Execute o protocolo dentro de um gabinete de biossegurança no camundongo eutanasiado adequadamente raspado e desinfetado com etanol 70%. Crie uma incisão superficial de 0,5 polegada no abdômen do animal usando uma tesoura. Corte longitudinalmente ao longo da linha média em direção ao pescoço e abdômen inferior.
Além disso, faça cortes laterais para abrir a pele. Usando uma pinça romba, separe suavemente a pele dos tecidos circundantes, enquanto contorna o torso do animal, cortando a pele lateralmente ao redor do pescoço e da parte inferior do abdômen. Coloque cuidadosamente a pele com o lado da derme voltado para baixo em uma placa de cultura de tecidos de 100 milímetros.
E certifique-se de que a pele esteja o mais esticada possível. Adicione seis mililitros de solução Dispase ao prato, garantindo que a pele esteja completamente coberta. Em seguida, cubra o prato.
Enrole o prato com Parafilm. Incube a placa em temperatura ambiente por 10 minutos para achatar o explante. No dia seguinte, usando uma pipeta, retire o líquido da placa que contém a pele isolada.
Em seguida, com o auxílio de uma pinça, separe a derme da epiderme enquanto remove qualquer tecido adiposo visível dela. E coloque a derme isolada em uma placa de cultura de tecidos limpa. Adicione um mililitro de DMEM contendo 1X solução antibiótica-antimicótica à derme na placa de cultura.
Incline a placa para acumular o líquido em um lado da placa. Em seguida, pique a derme em pedaços de um a dois milímetros quadrados. E transfira-os para um novo tubo cônico de 50 mililitros.
Adicione 10 mililitros de solução de colagenase tipo II ao tubo. Incube-o por duas horas a 37 graus Celsius com agitação contínua de 30 a 50 rpm para digerir a derme. Filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 70 mícrons.
E centrifugue a 250g por cinco minutos. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspender o pellet em 10 milímetros de DMEM contendo solução antibiótico-antimicótica. Filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 40 mícrons antes de centrifugar, conforme demonstrado anteriormente.
Ressuspenda o pellet celular resultante em um mililitro de meio LEC completo. Em seguida, coloque as células em meio LEC completo em uma placa de cultura de tecidos de 60 milímetros revestida com colágeno. Substitua a mídia a cada dois dias, lavando as células com PBS duas vezes e adicionando mídia LEC nova.
Imagens de baixa ampliação de células isoladas da derme murina mostraram uma população de células mistas.
