Este trabalho foi apoiado pela Fundação Helênica para Pesquisa e Inovação (00376), os Institutos Nacionais de Saúde, o Instituto Nacional do Câncer (NCI) [Grant R15CA231339], o Centro de Ciências da Saúde da Texas Tech University (TTUHSC) Escola de Farmácia Escritório de Ciências da bolsa (para CMM) e pela Faculdade de Farmácia, Universidade de Louisiana Monroe financiamento inicial, os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) por meio do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais [Grant P20 GM103424-21] e o Subprograma de Competitividade em Pesquisa (RCS) do Conselho de Regentes da Louisiana por meio do Fundo de Apoio ao Conselho de Regentes (LEQSF(2021-24)-RD-A-23) (para GM). O equipamento TTUHSC comum usado foi obtido por meio do Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) Grants RP190524 and RP200572. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, na decisão de escrever ou na preparação do manuscrito. O resumo gráfico na Figura 1A foi criado com BioRender.com.

Os estudos em animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro de Ciências da Saúde da Texas Tech University (TTUHSC) para os experimentos no TTUHSC e pela Administração Veterinária da Prefeitura da Grécia Ocidental de acordo com a Diretiva 2010/63 para os experimentos na Universidade de Patras. Siga diligentemente os regulamentos de descarte de resíduos ao descartar resíduos animais.
1. Isolamento da derme do camundongo
<ol><li>Dia 1 NOTA: No dia 1; Prepare os seguintes materiais e equipamentos: câmara de anestesia, máquina de cortar pêlos de animais, isoflurano, pinça fina, filtros de seringa de 0,2 μm.<ol><li>Prepare uma solução Dispase de 2 mg/mL em DMEM com 1x solução antibiótico-antimicótica e filtre-a por filtro. NOTA: O uso de meio ou PBS pode ser substituído pelo HBSS, pois tem sido usado com sucesso em outros protocolos relatados12. A solução antibiótico-antimicótica 1x pode ser substituída pela adição de penicilina (100 UI/mL), estreptomicina (100 μg/mL) e anfotericina (2,5 μg/mL).</li>
		<li>Anestesiar o camundongo colocando-o em uma câmara de anestesia com administração de isoflurano (0,5-2% de isoflurano, fluxo: 1 L/min). Depois que o camundongo parar de se mover, transfira-o para fora da gaiola e continue a anestesia ajustando um cone do nariz com um fluxo de isoflurano semelhante. Belisque o animal com o dedo do pé para confirmar níveis suficientes de anestesia e monitore constantemente o camundongo para garantir que a anestesia profunda seja preservada (sem motilidade). Prenda aproximadamente 9 cm2 do pelo dorsal e ventral (dorso e abdômen do rato, respectivamente) longitudinalmente ao longo da linha média, usando uma máquina de cortar cabelo. Deixe o camundongo se recuperar da anestesia e devolva-o à gaiola. NOTA: O creme de depilação (depilação) pode ser usado em seu lugar. Certifique-se de que o pelo seja completamente removido nas áreas da pele a serem isoladas, mantendo a integridade da pele. Tente cortar a área da pele o mais estendida possível. Para garantir que a inflamação potencial da depilação seja resolvida, o isolamento celular deve ocorrer no dia seguinte. Para aumentar o número de células isoladas, agrupe de 2 a 4 camundongos por grupo.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 2 NOTA: Mantenha os seguintes materiais e equipamentos prontos: câmara de eutanásia, cabine de biossegurança, incubadora de CO2 , etanol, tesoura fina, pinça fina, pinça romba, placa de cultura de tecidos de 100 mm, Dispase, DMEM, 1x Solução Antibiótico-Antimicótica.<ol><li>Eutanasiar o camundongo pela administração de CO2 e colocá-lo em decúbito dorsal, expondo a área cortada. Pulverize etanol 70% como desinfetante. NOTA: A partir desta etapa, todas as etapas devem ser realizadas em condições estéreis (em um gabinete de biossegurança).</li>
		<li>Coloque uma placa de cultura de tecidos estéril de 100 mm no gelo.</li>
		<li>Faça um corte superficial de 0,5 polegada no abdômen e corte longitudinalmente ao longo da linha média até o pescoço e a parte inferior do abdômen. Faça cortes laterais para poder abrir a pele. NOTA: O tamanho da incisão e a área da pele isolada dependem do tamanho do mouse.</li>
		<li>Usando uma pinça romba, separe cuidadosamente a pele dos tecidos circundantes. Faça isso contornando todo o tronco do mouse, cortando a pele lateralmente ao redor do pescoço e da parte inferior do abdômen.</li>
		<li>Coloque cuidadosamente a pele na placa de cultura de tecidos de 100 mm, com o lado da derme voltado para baixo, mantendo a pele o mais esticada possível. Cubra os pratos e mantenha-os no gelo. Complete o isolamento de todos os camundongos do grupo.</li>
		<li>Depois que a pele for extraída de todos os camundongos, incube as placas por 10 min em temperatura ambiente para achatar o explante.</li>
		<li>Adicione 6 ml de solução Dispase à placa, certificando-se de que a pele está completamente imersa e incube durante a noite com agitação ligeira a 4 °C. NOTA: Em vez de Dispase, a digestão de tripsina também pode ser realizada12, seguida de tratamento com Liberase em vez de Colagenase Tipo II (abaixo).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Isolamento celular da derme
<ol><li>Dia 3 NOTA: Mantenha os seguintes materiais e equipamentos prontos: centrífuga, incubadora de CO2 , cabine de biossegurança, tesoura, DMEM, 1x Solução Antibiótico-Antimicótica, Colagenase Tipo II, PBS, tubo cônico de 50 mL, placas de cultura de tecidos de 100 mm e 60 mm, solução de DNAse I, Colágeno Tipo I, filtros de células de 70 μm e 40 μm, filtros de seringa de 0,2 μm, meio LEC.<ol><li>Prepare 500 mL de 1x PBS (1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4, pH 7,4) e autoclave por 20 min a 15 psi ou esterilize com filtro. Como alternativa, use PBS estéril disponível comercialmente.</li>
		<li>Prepare 10 mL de solução de colagenase tipo II de 2 mg/mL em DMEM com 1x solução antibiótica-antimicótica e esterilize-a por filtro. NOTA: Execute as próximas etapas sob uma capa estéril para diminuir as chances de contaminação da amostra.</li>
		<li>Use uma pipeta para remover o líquido do prato.</li>
		<li>Use uma pinça para separar a derme (parte inferior da pele) da epiderme (superior) e remova qualquer tecido adiposo óbvio. Transfira a derme para uma placa de cultura de tecidos limpa.</li>
		<li>Adicione 1 mL de DMEM com 1x solução antibiótica-antimicótica na placa de cultura de tecidos limpa e incline-a para que o líquido se acumule em um lado da placa.</li>
		<li>Pique a derme em pedaços de 1-2 mm2 e transfira-os para um novo tubo cônico de 50 mL. NOTA: Idealmente, esta etapa deve ser concluída em 4-5 minutos, pois não se espera que o processamento mais longo forneça maior rendimento ou sobrevivência celular.</li>
		<li>Adicione 10 mL da solução de colagenase tipo II.</li>
		<li>Adicionar 50 μL (25 unidades/ml da solução) de solução de DNAse I (reduz a aglomeração celular) e digerir a solução dérmica durante 2 h a 37 °C com agitação contínua (utilizar uma incubadora rotativa/agitada a 30-50 rpm). NOTA: Verifique periodicamente para identificar se a maior parte da derme foi digerida. Caso contrário, aumente o tempo de digestão (1 h extra no máximo) e a velocidade de agitação, se possível.</li>
		<li>Cubra as placas de cultura de tecidos de 60 mm com 2 mL de 10 μg/mL de colágeno tipo I em ácido acético 0,02 M por >20 min a 37 °C. Lave 2x com PBS estéril.</li>
		<li>Filtrar a suspensão celular com um filtro de células de 70 μm e centrifugar a 250 × g durante 5 min. Descarte o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspenda em 10 mL de DMEM com 1x Solução Antibiótico-Antimicótica.</li>
		<li>Filtrar a suspensão celular com um filtro de células de 40 μm e centrifugar a 250 × g durante 5 min. Descarte o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspenda em 1 mL de meio LEC completo (Endothelial Cell Growth Base Medium with Supplement).</li>
		<li>Coloque as células na placa de cultura de tecidos de 60 mm revestida de colágeno em meio LEC completo. Este será o Dia 0 da cultura de células.</li>
		<li>Substitua a mídia a cada 2 dias, lavando as células com 1x PBS duas vezes e adicionando mídia LEC nova.</li>
		<li>Repita a etapa 2.1.15 até que as células estejam 80-90% confluentes. NOTA: Se a purificação for realizada antes que as células sejam 80-90% confluentes, menos células endoteliais linfáticas serão isoladas. Esse processo leva cerca de 7 a 10 dias.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Revestimento magnético do grânulo com anticorpo LYVE-1
NOTA: Um dia antes da etapa de purificação, prepare os seguintes materiais e equipamentos: Refrigerador a 4 °C, Rotor, separador magnético, PBS, Grânulos magnéticos Anti-Rabbit IgG, tubos de microcentrífuga, filtros de seringa de 0.2 μm, Solução de revestimento de grânulos magnéticos, anticorpo LYVE-1.
<ol><li>Prepare a solução de revestimento magnético de esferas: 20 mL de PBS com 0,1% de BSA e 2 mM de EDTA e esterilize-o com filtro. Armazene-o a 4 °C. NOTA: Mais do que alguns dias de armazenamento não são recomendados; Verifique se há precipitados ou contaminação antes de usar.</li>
	<li>Pipete 500 μL de esferas magnéticas IgG anti-coelho para um tubo de microcentrífuga e adicione 1 mL de solução de revestimento de esferas magnéticas geladas.</li>
	<li>Use um separador magnético para lavar as contas.</li>
	<li>Repita as lavagens 2x com 1 mL da solução de revestimento magnético de esferas gelada.</li>
	<li>Ressuspenda os grânulos em 500 μL de solução de revestimento magnético de esferas e faça alíquotas de 150 μL em tubos de microcentrífuga.</li>
	<li>Adicione 15 μg do anticorpo LYVE-1 a cada tubo (15 μL de concentração de estoque de anticorpos de 1 mg / mL).</li>
	<li>Incubar durante a noite a 4 °C com agitação contínua.</li>
</ol>4. Purificação de células endoteliais linfáticas
NOTA: Prepare os seguintes materiais e equipamentos: incubadora de CO2 , agitador, temporizador, parafilme, DMEM, 1x solução antibiótica-antimicótica, BSA, PBS, solução de revestimento magnético de esferas, tripsina-EDTA, placas de cultura de tecidos de 100 mm ou 60 mm, filtros de seringa de 0.2 μm, colágeno tipo I, ácido acético, meio LEC.
<ol><li>Prepare 50 mL de DMEM com 1x solução antibiótico-antimicótica e 0,1% de BSA e filtre-esterilize.</li>
	<li>Cubra as placas de cultura de tecidos de 60 mm com 10 μg/mL de colágeno tipo I em ácido acético 0,02 M por >20 min a 37 °C. Lave 2x com PBS estéril.</li>
	<li>Lave os grânulos pré-revestidos com 1 mL de solução de revestimento magnético de grânulos, usando um separador magnético.</li>
	<li>Ressuspenda os grânulos em 150 μL de DMEM com 0,1% de BSA. NOTA: As contas agora podem ser armazenadas a 4 °C por até 1 mês.</li>
	<li>Lave as células 2x com PBS.</li>
	<li>Adicione 3 mL de DMEM com BSA a 0,1% (para uma placa de cultura de tecidos de 60 mm) e 50 μL de esferas conjugadas com anticorpos às células. NOTA: Se as células de dois ou mais camundongos estiverem agrupadas, use uma placa de cultura de tecidos de 100 mm e adicione 6 mL de DMEM com 0,1% de BSA.</li>
	<li>Sele o prato com parafilme.</li>
	<li>Coloque o prato em uma coqueteleira agitando a 10 RPM em RT e incube por exatamente 10 min. NOTA: Uma incubação mais longa resultará em ligação não específica. Para garantir que os grânulos interajam com toda a superfície da placa, gire manualmente a placa a cada poucos minutos, enquanto ela continua a tremer.</li>
	<li>Descarte o meio e lave as células uma vez com PBS. Inspecione rapidamente as células para verificar a presença de colônias LEC na placa.</li>
	<li>Tripsinizar as células: use 1 mL de tripsina-EDTA e incube por 3 min a 37 °C. Inspecione as células quanto ao desprendimento celular bem-sucedido.</li>
	<li>Neutralize a solução com 2 mL de meio LEC completo e transfira a solução para um tubo de polipropileno estéril de 5 mL.</li>
	<li>Usando um separador magnético, lave as células 4 x 3 mL de DMEM com 0,1% de BSA para remover as células não ligadas.</li>
	<li>Ressuspenda as células restantes ligadas ao cordão em meio LEC completo e aplique nas placas de cultura de tecidos de 60 mm previamente revestidas com colágeno.</li>
	<li>Incubar as células a 37 °C e mudar o meio em dias alternados após duas lavagens de PBS de cada vez.</li>
	<li>Cultive as células até atingirem a confluência (normalmente leva de 7 a 10 dias).</li>
	<li>Nesse ponto, verifique as células ao microscópio quanto à confluência e prossiga com a preparação das células para a citometria de fluxo. Se uma alta porcentagem de F4 / 80 + for identificada, repita a etapa de purificação com LYVE-1 (Etapa 4: Purificação de células endoteliais linfáticas) novamente ou, idealmente, outro marcador linfático (ou seja, podoplanina14). NOTA: A alta expressão da proteína alvo do anticorpo na população de células purificadas por esferas magnéticas foi demonstrada15,16. No entanto, para o LYVE-1, é importante realizar um controle de citometria de fluxo para a identificação da porcentagem de outras células do LYVE-1+, principalmente macrófagos. O LYVE-1 é expresso apenas em subconjuntos de macrófagos associados a tumores e feridas, enquanto na pele saudável, a expressão do LYVE-1 é mais restrita às células endoteliais linfáticas17. Assim, a triagem F4/80 não é obrigatória, mas sim dependente do contexto experimental. Os camundongos usados para demonstração não carregavam tumores ou feridas, apenas inflamação potencial por depilação, mas incluímos a coloração F4 / 80 como uma linha de base da porcentagem de macrófagos LYVE-1 +.</li>
</ol>5. Citometria de fluxo
NOTA: Prepare os seguintes materiais e equipamentos: centrífuga, incubadora de CO2 , temporizador, hemocitômetro, solução de EDTA, 1x solução antibiótica-antimicótica, BSA, PBS, tripsina-EDTA, tubos de polipropileno, filtros de seringa de 0.2 μm, etanol 70%, anticorpo conjugado com F4/80 FITC.
<ol><li>Prepare PBS contendo 0,1% de BSA e esterilize-o com filtro.</li>
	<li>Preparar a solução de EDTA 1 mM em PBS.</li>
	<li>Tripsinizar as células: incubar as células com 1 mL de solução de EDTA 1 mM por 5 min a 37 °C. NOTA: A incubação com solução de EDTA é um método mais suave de descolamento celular, que preserva melhor as proteínas transmembranares e é preferido, mas requer períodos de incubação mais longos. Alternativamente, a solução de tripsina-EDTA pode ser usada para incubação de 1 min a 37 ° C, mas isso pode afetar a afinidade do anticorpo para aplicações de citometria de fluxo.</li>
	<li>Neutralize a solução com 2 mL de meio LEC completo e transfira a solução para um tubo de polipropileno estéril de 5 mL.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 250 × g durante 5 min.</li>
	<li>Lave com PBS.</li>
	<li>Repita a centrifugação e a lavagem com PBS.</li>
	<li>Ressuspenda as células em PBS contendo 0,1% de BSA e conte-as usando um hemocitômetro ou método alternativo. Alíquota ~ 1 × 106 células em tubos de polipropileno com um volume final de 100 μl. A partir desta etapa, execute todas as etapas a 4 °C. NOTA: As células podem ser fixadas antes da coloração ou coradas enquanto vivas. A fixação pode ser subótima para citometria de fluxo, pois alguns anticorpos podem não detectar os antígenos após a fixação; portanto, recomendamos executar a citometria de fluxo imediatamente após a etapa anterior e pular a etapa de fixação. Se isso não for possível, a fixação antes do experimento de citometria de fluxo permitirá um atraso na etapa de citometria de fluxo. Se a fixação for realizada, o desempenho dos anticorpos no contexto de células fixas deve ser avaliado com antecedência.</li>
	<li>Realize a fixação (etapa opcional; se as células não forem fixadas, prossiga com a imunocoloração): ressuspenda as células em etanol 70% gelado e misture suavemente por 10 min no gelo. NOTA: A fixação de etanol pode permeabilizar as células e levar à liberação de GFP; no entanto, a fixação à base de paraformaldeído pode destruir os corantes usados para citometria de fluxo e, idealmente, pode ser evitada.</li>
	<li>Incubar por 15 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave as células 2x por centrifugação a 250 × g por 5 min em 1x PBS.</li>
	<li>Prossiga para a próxima etapa ou ressuspenda as células em 0,5-1 mL de 1x PBS e armazene a 4 ° C.</li>
</ol>6. Imunocoloração
NOTA: Manuseie as células com cuidado e evite pipetagem extensa, quando possível, para manter a integridade da membrana celular e minimizar a morte celular, garantindo que as células não formem aglomerados. A partir das células endoteliais isoladas, prepare os seguintes grupos: células não coradas e células coradas com outro marcador de células endoteliais (ou seja, VEGFR3, podoplanina), F4/80 e ambos. Incluir células endoteliais linfáticas de ratinho e macrófagos comercialmente disponíveis, se disponíveis, como controlos positivos. Para fins de demonstração, e devido à fluorescência endógena do tdTomato (PE+), usamos a coloração F4/80 conjugada com FITC.
<ol><li>Diluir o anticorpo primário em PBS com 0,1% de BSA de acordo com a diluição recomendada ou otimizada. Adicione 0,5 μg (1 μL de solução de anticorpo) do anticorpo conjugado com F4 / 80 FITC aos 100 μL da suspensão celular.</li>
	<li>Ressuspenda as células após a adição do anticorpo diluído conjugado com fluorescência. Misture sacudindo o tubo de polipropileno para garantir que não haja grumos e que todas as células estejam devidamente revestidas.</li>
	<li>Incubar durante 1 h à temperatura ambiente (células fixas) ou 30 min em gelo (células vivas) no escuro.</li>
	<li>Lave as células 2x centrifugando-as a 250 × g por 5 min a 4 °C (para células vivas) ou à temperatura ambiente (para células fixas), usando PBS com 0,1% de BSA no escuro.</li>
	<li>Para anticorpos não conjugados com fluorescência<ol><li>Diluir o anticorpo secundário conjugado com fluorocromo no tampão de incubação. Para anticorpos Alexa Flour, use uma diluição de 1:500.</li>
		<li>Adicionar o anticorpo secundário a 100 μL da solução de suspensão celular.</li>
		<li>Incubar durante 30 min à temperatura ambiente (células fixas) ou em gelo (células vivas).</li>
		<li>Lavar duas vezes por centrifugação a 250 × g durante 5 min a 4 °C (para células vivas) ou à temperatura ambiente (para células fixas) no tampão de incubação.</li>
	</ol></li>
	<li>Ressuspenda as células em 0,5 mL de PBS 1x e analise-as usando um citômetro de fluxo.</li>
	<li>Siga estas etapas da estratégia de gating para identificar a população de macrófagos dentro das células que expressam LYVE-1:<ol><li>Considere o espalhamento para frente e para o lado para distinguir a população celular.</li>
		<li>Considere o espalhamento direto para tamanho, área e altura da célula para distinguir as células únicas (Singlets).</li>
		<li>Leve em consideração a expressão F4 / 80 (FITC) e a expressão RFP (PE) para identificar macrófagos (F4 / 80 +) dentro das células murinas isoladas que expressam tdTomato (PE) (devido à presença de um repórter fluorescente tdTomato nos camundongos específicos, descritos abaixo).</li>
	</ol></li>
</ol>

Isolando células endoteliais de capilares linfáticos dérmicos murinos

<ol>
	<li>Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphatic+vasculature+in+the+21(st)+century:+novel+functional+roles+in+homeostasis+and+disease.">The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease.</a> Cell. 182 (2), 270-296 (2020).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoangiocrine+signals+promote+cardiac+growth+and+repair.">Lymphoangiocrine signals promote cardiac growth and repair.</a> Nature. 588 (7839), 705-711 (2020).</li><li>Biswas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+in+bone+support+regeneration+after+injury.">Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury.</a> Cell. 186 (2), 382-397 (2023).</li><li>Tammela, T., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis:+molecular+mechanisms+and+future+promise.">Lymphangiogenesis: molecular mechanisms and future promise.</a> Cell. 140 (4), 460-476 (2010).</li><li>Ji, R. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Del-1,+an+endogenous+leukocyte-endothelial+adhesion+inhibitor,+limits+inflammatory+cell+recruitment.">Del-1, an endogenous leukocyte-endothelial adhesion inhibitor, limits inflammatory cell recruitment.</a> Science. 322 (5904), 1101-1104 (2008).</li><li>Mikelis, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+and+ROCK+mediate+histamine-induced+vascular+leakage+and+anaphylactic+shock.">RhoA and ROCK mediate histamine-induced vascular leakage and anaphylactic shock.</a> Nature Communications. 6, 6725 (2015).</li><li>Schledzewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelium-specific+hyaluronan+receptor+LYVE-1+is+expressed+by+stabilin-1+,+F4/80+,+CD11b++macrophages+in+malignant+tumours+and+wound+healing+tissue+in+vivo+and+in+bone+marrow+cultures+in+vitro:+implications+for+the+assessment+of+lymphangiogenesis.">Lymphatic endothelium-specific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1+, F4/80+, CD11b+ macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro: implications for the assessment of lymphangiogenesis.</a> Journal of Pathology. 209 (1), 67-77 (2006).</li><li>Akwii, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2-induced+lymphatic+endothelial+cell+migration+drives+lymphangiogenesis+via+the+beta1+integrin-RhoA-formin+axis.">Angiopoietin-2-induced lymphatic endothelial cell migration drives lymphangiogenesis via the beta1 integrin-RhoA-formin axis.</a> Angiogenesis. 25 (3), 373-396 (2022).</li><li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+functions+of+lymphatic+vessels.">Biological functions of lymphatic vessels.</a> Science. 369 (6500), eaax4063 (2020).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+cancer+metastasis:+the+'seed+and+soil'+hypothesis+revisited.">The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited.</a> Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 453-458 (2003).</li><li>Mellor, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+dysfunction,+not+aplasia,+underlies+Milroy+disease.">Lymphatic dysfunction, not aplasia, underlies Milroy disease.</a> Microcirculation. 17 (4), 281-296 (2010).</li><li>Connell, F., Brice, G., Mortimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+primary+lymphedema.">Phenotypic characterization of primary lymphedema.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 140-146 (2008).</li><li>Croteau, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposiform+lymphangiomatosis:+a+distinct+aggressive+lymphatic+anomaly.">Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly.</a> Journal of Pediatris. 164 (2), 383-388 (2014).</li><li>Ji, Y., Chen, S., Peng, S., Xia, C., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposiform+lymphangiomatosis+and+kaposiform+hemangioendothelioma:+similarities+and+differences.">Kaposiform lymphangiomatosis and kaposiform hemangioendothelioma: similarities and differences.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 165 (2019).</li><li>Kriehuber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+dermal+lymphatic+and+blood+endothelial+cells+reveal+stable+and+functionally+specialized+cell+lineages.">Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages.</a> Journal of Experimental Medicine. 194 (6), 797-808 (2001).</li><li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells.">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li><li>Garrafa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+heterogeneity+of+human+lymphatic+endothelial+cells+from+different+tissues.">Isolation, purification, and heterogeneity of human lymphatic endothelial cells from different tissues.</a> Lymphology. 38 (4), 159-166 (2005).</li><li>Kazenwadel, J., Secker, G. A., Betterman, K. L., Harvey, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+using+primary+embryonic+mouse+lymphatic+endothelial+cells+uncover+key+roles+for+FGFR1+signalling+in+lymphangiogenesis.">In vitro assays using primary embryonic mouse lymphatic endothelial cells uncover key roles for FGFR1 signalling in lymphangiogenesis.</a> PLoS One. 7 (7), e40497 (2012).</li><li>Steele, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+egress+via+lymphatic+vessels+is+tuned+by+antigen+encounter+and+limits+tumor+control.">T cell egress via lymphatic vessels is tuned by antigen encounter and limits tumor control.</a> Nature Immunology. 24 (4), 664-675 (2023).</li><li>Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+age-dependent+changes+in+cell+size+on+endothelial+cell+proliferation+and+senescence+through+YAP1.">Effects of age-dependent changes in cell size on endothelial cell proliferation and senescence through YAP1.</a> Aging. 11 (17), 7051-7069 (2019).</li><li>Regina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+ageing+and+endothelial+cell+senescence:+Molecular+mechanisms+of+physiology+and+diseases.">Vascular ageing and endothelial cell senescence: Molecular mechanisms of physiology and diseases.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 159, 14-21 (2016).</li><li>Muhleder, S., Fernandez-Chacon, M., Garcia-Gonzalez, I., Benedito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+sprouting,+proliferation,+or+senescence:+tipping+the+balance+from+physiology+to+pathology.">Endothelial sprouting, proliferation, or senescence: tipping the balance from physiology to pathology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (4), 1329-1354 (2021).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

O sistema linfático é um importante regulador da função homeostática do organismo, sendo as funções mais importantes a manutenção do plasma fluido, a remoção de subprodutos do metabolismo celular e moléculas tóxicas, a absorção de lipídios e o tráfego de células imunes 1,19. A identificação de marcadores apropriados provocou uma explosão de novos dados no campo linfático, revelando novas funções da vasculatura linfática, como seu papel no...

O sistema linfático desempenha um papel fundamental na fisiologia humana. É considerado um fator homeostático vital, que facilita funções importantes, como a manutenção do equilíbrio hídrico tecidual-plasmático, a vigilância imunológica e a absorção de lipídios1, bem como funções recentemente identificadas, como a capacidade de reparo do coração2 e a capacidade regenerativa do osso e hematopoiese3. Apesar do papel significativo do sistema linfático, vários aspectos do papel dos linfáticos, bem como os mecanismos moleculares que governam certos parâmetros e respostas fisiológicas, permanecem indefinidos. Além disso, os defeitos vasculares linfáticos são fatores desencadeantes ou deteriorantes em certas condições fisiopatológicas. Exemplos bem conhecidos são os linfedemas primários e secundários, dependendo da origem genética ou não genética da doença, respectivamente, enquanto o papel do sistema linfático no crescimento do tumor primário e na disseminação metastática é fundamental, pois pode atuar como um canal para metástases e modulador das funções imunes1.
A defasagem no estudo e conhecimento da vasculatura linfática em relação à vasculatura sanguínea deve-se principalmente à descoberta posterior do sistema linfático em comparação com o sistema vascular sanguíneo e ao atraso na identificação de marcadores moleculares linfático-específicos. Isso melhorou muito nas últimas décadas, levando à alteração do quadro convencional dos linfáticos no estado estacionário e em condições de doença1. Semelhante à angiogênese, a linfangiogênese é a formação de novos vasos linfáticos a partir de vasos pré-existentes e desempenha um papel fundamental no desenvolvimento de um amplo espectro de doenças 4,5,6. No entanto, ao contrário da angiogênese, a investigação da linfangiogênese tem sido limitada principalmente a modelos in vivo com foco na formação de vasos de desenvolvimento e defeitos estruturais em modelos patológicos. O isolamento das células endoteliais linfáticas é importante para estudos in vitro, e isso pode ser proporcionado pelo protocolo apresentado.
Vários protocolos para isolamento endotelial linfático de camundongos foram desenvolvidos, os quais requerem o uso de classificação de células ativadas por fluorescência7. A vantagem do classificador de células, quando disponível, é o maior grau de pureza, ao contrário do isolamento baseado em esferas, com este último proporcionando um maior rendimento. O protocolo utiliza a expressão do receptor de hialuronano endotelial linfático 1 (LYVE-1), um marcador endotelial linfático, importante para o tráfego celular dentro dos vasos linfáticos 4,8. Como a expressão de LYVE-1 é limitada aos capilares linfáticos e não aos vasos linfáticos coletores, a técnica é adequada para o isolamento de células endoteliais linfáticas especificamente dos capilares linfáticos, ao contrário de outros marcadores linfáticos, como a podoplanina, que são expressos uniformemente em todas as células endoteliais linfáticas9. Para o protocolo, outros marcadores linfáticos importantes que não eram transmembrana, como o Prox1, foram excluídos.
Como o desfecho fisiológico foi a linfangiogênese, que geralmente é iniciada nos capilares linfáticos, o LYVE-1 foi selecionado como alvo devido à sua seletividade nessas células e porque o anticorpo selecionado proporcionou um alto rendimento. As enzimas utilizadas foram a colagenase tipo II, que é geralmente conhecida por ser mais eficaz na dissociação do colágeno do que o tipo I10, e a dispase, uma protease mais ampla, regularmente usada para a separação derme-epiderme11; no entanto, outras enzimas para separação tecidual foram relatadas12,13 e podem ser usadas. O objetivo deste protocolo é descrever um método para isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas de capilares linfáticos de camundongos adultos com alto rendimento usando purificação de esferas magnéticas, especialmente em locais onde a classificação de células ativadas por fluorescência não está prontamente disponível. O método é adequado para aplicações onde a pureza das células endoteliais linfáticas pode ser comprometida para aplicações a jusante.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m Syringe Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-719C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Hair Clipper</td>
			<td>Wahl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11992-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>542040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, High Concentration Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td>dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Solution (2,500 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>120-21D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Base Medium &#38; Supplement (LEC medium)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>CCM027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia chamber</td>
			<td>Euthanex Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1432S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber</td>
			<td>Euthanex Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution 4% in PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Mouse LYVE-1</td>
			<td>ReliaTech GmbH</td>
			<td>103-PA50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating/Shaking Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters w 0.2 &#956;m Pores</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-719C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine dermal lymphatic endothelial cell isolation

O sistema linfático participa da regulação da vigilância imunológica, absorção de lipídios e equilíbrio de fluidos teciduais. O isolamento de células endoteliais linfáticas murinas é um processo importante para a pesquisa linfática, pois permite a realização de experimentos in vitro e bioquímicos nas células isoladas. Além disso, o desenvolvimento da tecnologia Cre-lox permitiu a deficiência específica do tecido de genes que não podem ser direcionados globalmente, levando à determinação precisa de seu papel nos tecidos estudados. A dissecação do papel de certos genes na fisiologia e fisiopatologia linfática requer o uso de promotores linfático-específicos e, portanto, a verificação experimental dos níveis de expressão dos genes-alvo.
Métodos para isolamento eficiente de células endoteliais linfáticas de camundongos selvagens ou transgênicos permitem o uso de ensaios ex vivo e in vitro para estudar os mecanismos que regulam as funções linfáticas e a identificação dos níveis de expressão das proteínas estudadas. Desenvolvemos, padronizamos e apresentamos um protocolo para o isolamento eficiente de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas (DLECs) via purificação de esferas magnéticas com base na expressão de LYVE-1. O protocolo descrito visa equipar os pesquisadores com uma ferramenta para entender e elucidar ainda mais os atores importantes das funções das células endoteliais linfáticas, especialmente em instalações onde o equipamento de classificação de células ativadas por fluorescência não está disponível.

The lymphatic system plays a pivotal role in human physiology. It is considered a vital homeostatic factor, that facilitates important functions, such as the maintenance of tissue-plasma fluid balance, immune surveillance, and lipid absorption1, as well as recently-identified functions, such as the repair ability of the heart2 and regenerative capacity of bone and hematopoiesis3. Despite the significant role of the lymphatic system, several aspects of the role of the lymphatics, as well as the molecular mechanisms governing certain physiological parameters and responses remain elusive. Moreover, lymphatic vascular defects are triggering or deteriorating factors in certain pathophysiological conditions. Well-known examples are the primary and secondary lymphedemas, depending on the genetic or non-genetic origin of the disease, respectively, while the role of the lymphatic system on primary tumor growth and metastatic dissemination is pivotal, as it can act as a conduit for metastasis and modulator of immune functions1.
The lag in the study and knowledge of the lymphatic compared to the blood vasculature is mainly due to the later discovery of the lymphatic system in comparison with the blood vascular system and the delay in the identification of lymphatic-specific molecular markers. This has greatly improved in recent decades, leading to the alteration of the conventional picture of the lymphatics at steady state and in diseased conditions1. Similar to angiogenesis, lymphangiogenesis is the formation of new lymphatic vessels from pre-existing ones and plays a pivotal role in the development of a wide spectrum of diseases4,5,6. However, unlike angiogenesis, the investigation of lymphangiogenesis has been limited to mostly in vivo models focusing on developmental vessel formation and structural defects in pathological models. The isolation of the lymphatic endothelial cells is important for in vitro studies, and this can be provided by the presented protocol.
Several protocols for lymphatic endothelial isolation from mice have been developed, which require the use of fluorescence-activated cell sorting7. The advantage of the cell sorter, where available, is the higher degree of purity, contrary to bead-based isolation, with the latter providing a higher yield. The protocol utilizes the expression of lymphatic endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE-1), a lymphatic endothelial marker, important for cell trafficking within the lymphatic vessels4,8. Since LYVE-1 expression is limited to the lymphatic capillaries and not the collecting lymphatic vessels, the technique is suitable for the isolation of lymphatic endothelial cells specifically from the lymphatic capillaries, contrary to other lymphatic markers, such as podoplanin, which are expressed uniformly in all lymphatic endothelial cells9. For the protocol, other important lymphatic markers that were not transmembrane, such as Prox1, were excluded.
As the physiological outcome was lymphangiogenesis, which is usually initiated at the lymphatic capillaries, LYVE-1 was selected as a target due to its selectivity in these cells and because the selected antibody provided a high yield. The enzymes used were collagenase type II, which is generally known to be more effective in collagen dissociation than type I10, and dispase, a broader protease, regularly used for dermis-epidermis separation11; however, other enzymes for tissue separation have been reported12,13 and can be used. The goal of this protocol is to describe a method for dermal lymphatic endothelial cell isolation from lymphatic capillaries of adult mice with high yield using magnetic bead purification, especially in places where fluorescence-activated cell sorting is not readily available. The method is suitable for applications where the purity of lymphatic endothelial cells can be compromised for downstream applications.

Autor em destaque: Isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

Our group's research focuses on delineating the mechanisms regulating endothelial cell physiology. This protocol describes a method for magnetic bead-based isolation of renal endothelial cells, specifically from thermal lymphatic capillaries in facilities where fluorescence-activated cell sorting is not available. The protocol allows the isolation of lymphatic endothelial cells from transgenic mice to study their physiology in vitro.It is particularly suitable where the purity of the lymphatic endothelial cells can be compromised for downstream applications. This process provides a high yield of lymphatic endothelial cells obtained from the lymphatic capillaries and not other collecting vessels. It is also a nice alternative in the case of the absence of cell sorting facilities.

O método foi desenvolvido para identificar a expressão proteica de uma pequena GTPase, RhoA, cujo gene codificador foi floxizado em ambos os alelos e deletado sob o efeito do promotor específico do endotélio linfático induzível por tamoxifeno Prox1-CreERT2 18. Os LECs isolados podem ser cultivados por até quatro gerações, após o que se tornam senescentes. Eles foram congelados, descongelados e estimulados com sucesso com angiopoietina-2. Devido ao número limitado de ...

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Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

A pesquisa do nosso grupo se concentra em delinear os mecanismos que regulam a fisiologia das células endoteliais. Este protocolo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais renais, especificamente de capilares linfáticos térmicos em instalações onde a classificação de células ativadas por fluorescência não está disponível. O protocolo permite o isolamento de células endoteliais linfáticas de camundongos transgênicos para estudar sua fisiologia in vitro.É particularmente adequado onde a pureza das células endoteliais linfáticas pode ser comprometida para aplicações a jusante. Este processo proporciona um alto rendimento de células endoteliais linfáticas obtidas dos capilares linfáticos e não de outros vasos coletores. É também uma boa alternativa no caso da ausência de instalações de triagem de células.

murine-dermal-lymphatic-endothelial-cell-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

908 visualizações.  Texas Tech University Health Sciences Center. A pesquisa do nosso grupo se concentra em delinear os mecanismos que regulam a fisiologia das células endoteliais. Este protocolo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais renais, especificamente de capilares linfáticos térmicos em instalações onde a classificação de células ativadas por fluorescência não está disponível. O protocolo permite o isolamento de células endoteliais linfáticas de camundongos transgênicos para estudar s...

Vídeo: Autor em destaque: Isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

Biologia

Isolation of Cells from Murine Dermis

Perform the protocol inside a biosafety cabinet on the euthanized mouse appropriately shaved and disinfected with 70%ethanol. Create a 0.5-inch superficial incision in the animal's abdomen using scissors. Cut longitudinally along the midline towards the neck and lower abdomen.Additionally, make lateral cuts to flap open the skin. Using blunt forceps, gently separate the skin from surrounding tissues, while going around the animal's torso cutting the skin laterally around the neck and the lower abdomen. Carefully place the skin with the dermis side facing down in a 100-millimeter tissue culture plate.And ensure the skin is as stretched as possible. Add six milliliters of Dispase solution to the plate, ensuring the skin is completely covered. Then, cover the plate.Wrap the plate with Parafilm. Incubate the plate at room temperature for 10 minutes to flatten the explant. The next day, using a pipette, remove the liquid from the plate containing the isolated skin.Then, with the aid of forceps, separate the dermis from the epidermis while removing any visible adipose tissue from it. And place the isolated dermis into a clean tissue culture plate. Add one milliliter of DMEM containing 1X antibiotic-antimycotic solution to the dermis in the culture plate.Tilt the plate to accumulate the liquid on one side of the plate. Then, mince the dermis into pieces of one to two square millimeters. And transfer them to a new 50-milliliter conical tube.Add 10 milliliters of collagenase type II solution to the tube. Incubate it for two hours at 37 degrees Celsius with continuous agitation at 30 to 50 rpm to digest the dermis. Filter the cell suspension through a 70-micron cell strainer.And centrifuge it at 250g for five minutes. After discarding the supernatant, resuspend the pellet in 10 millimeters of DMEM containing antibiotic-antimycotic solution. Filter the cell suspension through a 40-micron cell strainer before centrifuging, as demonstrated previously.Resuspend the resulting cell pellet in one milliliter of complete LEC media. Then, plate the cells in complete LEC media in a collagen-coated 60-millimeter tissue culture plate. Replace the media every two days by washing cells with PBS twice and adding fresh LEC media.Low magnification images of cells isolated from the murine dermis showed a mixed cell population.

Isolamento de células da derme murina

Murine Lymphatic Endothelial Cell Purification

To purify urine lymphatic endothelial cells, use cells isolated from the murine dermis after they reach about 80 to 90%Co-fluency, begin by washing pre-coded magnetic beads in a magnetic separator using one milliliter of magnetic bead coating solution. Resuspend the beads in 150 microliters of DMEM containing 0.1%BSA. Next, wash the cells in the 60 millimeter tissue culture plate twice with PBS.Mix 50 microliters of the antibody conjugated beads with three milliliters of DMEM containing 0.1%BSA and add it to the cells. Seal the dish with biofilm, then incubate the dish on a shaker agitating at 10 RPM at room temperature for exactly 10 minutes. Discard the medium before washing the cells once with PBS.Quickly inspect the cells to verify the presence of LEC colonies on the plate. Add one milliliter of tripsin EDTA to the cells and incubate for three minutes at 37 degrees Celsius to trypsinize the cells. Inspect the cells for successful cell detachment.After neutralizing the solution with two milliliters of complete LEC media. Transfer the cell solution to a five milliliter sterile polypropylene tube. Using a magnetic separator, wash the cells with three milliliters of DMEM containing 0.1%BSA to remove unbound cells.Resuspend the remaining bead bound cells in complete LEC media and plate them onto collagen coated 60 millimeter tissue culture plates. Brightfield and fluorescence imaging easily identified the LYVE1 positive lymphatic endothelial cells after purification and showed several beads attached to them. The cells displayed low-confluency 24 hours after purification, while they were highly cofluent, seven days after purification.