Purificação de células endoteliais linfáticas murinas

Para purificar as células endoteliais linfáticas da urina, use células isoladas da derme murina depois que elas atingirem cerca de 80 a 90% de cofluência, comece lavando esferas magnéticas pré-codificadas em um separador magnético usando um mililitro de solução de revestimento de esferas magnéticas. Ressuspenda os grânulos em 150 microlitros de DMEM contendo 0,1% BSA. Em seguida, lave as células na placa de cultura de tecidos de 60 milímetros duas vezes com PBS.

Misture 50 microlitros de grânulos conjugados com anticorpos com três mililitros de DMEM contendo 0,1% BSA e adicione-o às células. Feche o prato com biofilme e, em seguida, incube o prato em uma coqueteleira agitando a 10 RPM em temperatura ambiente por exatamente 10 minutos. Descarte o meio antes de lavar as células uma vez com PBS.

Inspecione rapidamente as células para verificar a presença de colônias LEC na placa. Adicione um mililitro de tripsina EDTA às células e incube por três minutos a 37 graus Celsius para tripsinizar as células. Inspecione as células quanto ao desprendimento celular bem-sucedido.

Depois de neutralizar a solução com dois mililitros de meio LEC completo. Transfira a solução celular para um tubo de polipropileno estéril de cinco mililitros. Usando um separador magnético, lave as células com três mililitros de DMEM contendo 0,1% BSA para remover as células não ligadas.

Ressuspenda as células restantes ligadas ao grânulo em meio LEC completo e coloque-as em placas de cultura de tecidos de 60 milímetros revestidas com colágeno. A imagem de campo claro e fluorescência identificou facilmente as células endoteliais linfáticas positivas para LYVE1 após a purificação e mostrou várias esferas presas a elas. As células apresentaram baixa confluência 24 horas após a purificação, enquanto eram altamente cofluentes, sete dias após a purificação.