Para começar, ressuspenda as células musculares esqueléticas isoladas de camundongos feridos com Notexin, marcados com iododesoxiuridina em um mililitro de DMEM livre de soro frio e conte-as usando um hemocitômetro ou um contador de células. Sob uma hotte, adicionar estoque de cisplatina para atingir uma concentração final de 25 micromolares. Vortex o tubo por 10 segundos e incube em temperatura ambiente por um minuto.
Tempere a reação com DMEM gelado contendo 10% de FBS e coloque-o no gelo. Após peletizar e ressuspender as células, filtrar a suspensão através de um filtro de células de 35 micrômetros. Sob uma hotte, adicionar uma solução de reserva de paraformaldeído filtrado para fixar a suspensão celular e o vórtice durante 30 segundos.
Lave-o duas vezes com dois mililitros de meio de coloração celular ou CSM por centrifugação. Após a lavagem final, aspirar o sobrenadante a cerca de 60 microlitros e ressuspender completamente o sedimento. Adicione 40 microlitros de mistura de coloração de anticorpos de superfície 2,5 vezes preparada em CSM e incube por uma hora enquanto os vórtice a cada 20 minutos.
Depois de lavar a amostra duas vezes com CSM, aspirar o sobrenadante e sacudir o gancho. Para permeabilizar as células, sob uma capela de exaustão, adicione 0,5 mililitros de metanol gelado gota a gota durante o vórtice. Lave as células duas vezes com um mililitro de CSM por centrifugação.
Após a última lavagem, aspirar o sobrenadante a cerca de 60 microlitros e ressuspender cuidadosamente o sedimento. Incube as células com 40 microlitros de mistura de coloração de anticorpos intracelulares por uma hora, enquanto vórtice as amostras a cada 20 minutos. Depois de lavar as células duas vezes com um mililitro CSM, ressuspender as amostras em 0,5 mililitros da solução de irídio intercalador e vórtice.
