As células-tronco musculares permanecem associadas ao seu nicho endógeno e podem ser manipuladas facilmente, por exemplo, através da transfecção do siRNA. Este método permite analisar células-tronco musculares na cultura em um cenário que se assemelha mais à situação in-vivo do que os modelos de cultura 2D padrão, preservando o nicho. Comece cortando pipetas estéreis de pasta com uma caneta de diamante.
Para cada rato, use uma pipeta grande com uma abertura de cerca de 0,3 centímetros e um comprimento de cerca de 10 a 12 centímetros e uma segunda pipeta de vidro com uma pequena abertura de cerca de 0,1 centímetro e um comprimento de aproximadamente 22 centímetros. Alisando as bordas de ambas as pipetas segurando as pontas da pipeta na chama de um queimador Bunsen por cinco a 10 segundos com movimento suave. Imediatamente antes do uso, cubra ambas as pipetas com soro de cavalo estéril preenchendo toda a pipeta com 2 mililitros de soro de cavalo por cinco minutos, depois injetando o soro do cavalo e permitindo que as pipetas sequem por cinco minutos em temperatura ambiente.
Pulverizar todos os equipamentos e os membros traseiros do mouse com 70% de etanol. Use tesouras curvadas finas endurecidas e fórceps finos para remover a pele e expor os músculos subjacentes. Remova a fáscia circundante com os fórceps curvados finos sem danificar os músculos subjacentes.
Para remover a tibialis anterior ou TA, pegue o tendão distal ta com fórceps e corte-o com uma tesoura fina. Enquanto segura o TA no tendão, puxe-o em direção ao joelho e corte o músculo perto do joelho para expor o músculo EDL. Levante o tendão dítalo EDL com fórceps curvos e corte com uma tesoura fina de mola Vannas.
Exponha o tendão proximal de EDL puxando cuidadosamente o EDL em direção ao joelho. Em seguida, corte o tendão proximal com uma tesoura. Incubar os músculos EDL no tubo de reação a 37 graus Celsius em um banho de água circulante.
Pare a digestão quando os músculos se soltarem e fibras de uma milha são visíveis. Trabalhar sob um microscópio binóculo estéril equipado com uma placa de aquecimento corou os músculos com meio de isolamento quente usando a pipeta de furo grande. Dissociar os músculos com a pipeta de furo grande até que o número desejado de miofibers esteja flutuando livremente na solução.
Para lavar os detritos, use a pequena pipeta de vidro para transferir miofibers não contraídos para o segundo poço cheio de meio de isolamento. Em seguida, transfira 50 a 100 myofibers não contratados para um poço de uma placa de 24 poços cheia de meio cultura miofibra. Incubar os miofibers a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 72 a 96 horas.
Transfeito miofibra associada células-tronco musculares quatro horas após o isolamento da miofibra. Combine 25 microliters de Opti-MEM com o respectivo volume de siRNA com 25 microliters Opti-MEM contendo 1,5 microliters de reagente transfecção. Incubar a mistura de reação por cinco minutos e adicioná-la às células na placa de 24 poços.
Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius pelo respeito do tempo. Apenas passos críticos do protocolo de coloração imunofluorescente são demonstrados aqui. Com cuidado, descarte o meio de cultura miofibra, deixando alguma solução no poço.
Adicione 500 microliters de 2% paraformaldeído para fixar os miofibers com suas células-tronco musculares adjacentes. Incubar a placa por cinco minutos em temperatura ambiente. Remova o supernatante com cuidado e lave os miofibers três vezes com PBS.
Cubra a placa com papel alumínio durante as etapas de incubação após a incubação com anticorpos secundários. Use uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo em um escorregador de vidro microscópico. Em seguida, transfira os myofibers no menor volume possível para o slide e dispersá-los.
Remova o líquido residual com a pipeta pasteur pequena ou uma pipeta de 200 microliter. Use duas gotas de meio de montagem aquoso e cubra os miofibers com um deslizamento de cobertura. Em seguida, deixe os slides secarem e armazená-los a quatro graus celsius no escuro seguido de análise microscópica.
Este protocolo demonstra derivação e cultura de miofibers únicos de músculos murine EDL. A coloração imunofluorescente para Pax7 foi usada para identificar núcleos de células-tronco musculares. A área ampliada expõe a miofibra com sua célula-tronco muscular adjacente e demonstra o sinal de imunofluorescência PAX7 no núcleo de uma célula-tronco muscular.
A progressão miogênica das células-tronco musculares pode ser analisada pela expressão do marcador. A presença de Pax7 e a ausência de expressão myoD está associada a células-tronco musculares quiescentes de miofibers recém-isolados. A expressão mioD pode ser observada na proliferação de células-tronco musculares.
Após 72 horas, células-tronco musculares formam aglomerados de progênies com diferentes estados miogênicos, que é paralelo pela expressão de diferentes marcadores miogênicos. Só as células-tronco Pax7 são células-tronco auto-renovados. Pax7 e MyoD células duplas positivas estão se proliferando.
Considerando que as células apenas myo D são células diferenciadoras. A transfecção siRNA de células-tronco musculares mostrou acúmulo de siRNA citoplasmica de forma granular indicando uma absorção eficiente. A quantificação de células positivas Pax7 transfectadas por miofibra revelou que o número de células transfeinadas aumentou até 74% após 30 horas sem efeito adverso no número de células-tronco musculares.
Ao tentar este protocolo, é de extrema importância dissecar cuidadosamente o EDL sem causar nenhum dano. Além da transfecção do siRNA, a análise de animais transgênicos ou a incubação com proteínas recombinantes é possível para análises mais funcionais de células-tronco musculares em seus miofibers adjacentes.
