Esta técnica permite a combinação da injeção intramuscular da cardiotoxina venenosa da cobra, a injeção intramuscular do siRNA auto-entrega, permitindo assim a análise da regeneração do músculo esquelético. A aplicação do siRNA auto-entrega é uma maneira elegante de investigar a perda funcional de genes únicos durante a regeneração muscular, evitando assim animais transgênicos. Depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do pé, raspe a área de injeção da perna inferior craniana do joelho até a pata, e remova qualquer cabelo solto.
Coloque o mouse na condição supina em uma almofada de cabeça coberta com um pano cirúrgico estéril, e use 70% de etanol para desinfetar a área de injeção da perna inferior craniana. Em seguida, carregue uma seringa de insulina equipada com uma agulha de calibre 29, com 50 microliters de 20 cardiotoxinas micromolares e fure a pele totalmente no músculo, apenas distal até o joelho. Quando a agulha estiver no lugar, injete a cardiotoxina durante um período de parto de 10 a 20 segundos ao longo de toda a extensão do músculo, enquanto move a agulha para frente e para trás, para permitir uma distribuição uniforme da cardiotoxina, ferindo assim todo o músculo tibialis anterior.
Em seguida, devolva o mouse para sua gaiola em uma almofada de aquecimento com monitoramento até a recumbência total. Três dias após a cirurgia, desinfete a área de injeção como acabou de demonstrar. Injete até 50 microliters de siRNA direcionados contra o gene alvo de interesse no músculo tibialis anterior do camundongo anestesiado, como apenas demonstrado.
Em seguida, devolva o mouse para sua gaiola, com monitoramento até a recumbência total. Antes de coletar o tecido muscular ferido, enrole a folha em torno de um lápis e sele o lápis com fita, de tal forma que a parte inferior do molde fornece uma superfície uniforme e fechada. Quando o molde estiver pronto, desinfete todo o animal com 70% de etanol, e use uma tesoura extra afiada para remover a pele no tornozelo.
Antes de colher o músculo, use fórceps finos para beliscar os fórceps fechados através da fáscia ao lado do osso da tíbia no tornozelo da perna lesionada, e mover os fórceps em direção ao joelho para rasgar a fáscia, expondo o músculo tibialis anterior. Para isolar o músculo tibialis anterior, exponha o tendão distal e agarre o tendão com fórceps finos. Use a tesoura de mola para cortar o tendão, e segure o músculo no tendão para puxar o músculo em direção ao joelho.
Para permitir a análise da região do cinturão médio, use uma tesoura reta para cortar o músculo tibialis anterior na região midbelly em duas metades de tamanho igual, e encher o molde de lápis no meio do caminho com solução de congelamento. Insira as duas metades do músculo tibialis anterior no molde de congelamento em uma posição vertical, com a região midbelly voltada para a parte inferior do molde. Use fórceps para transferir o molde de congelamento a meio caminho do nitrogênio líquido.
Quando o meio de congelamento mudar de transparente para branco e se tornar sólido, transfira o molde de congelamento para um congelador de 80 graus Celsius, ou para escarar gelo para processamento futuro. Nos músculos de controle, a arquitetura do tecido permanece intacta, como observado pela localização dos núcleos na periferia dos miofibers, e pela falta de acúmulo de células mononucleadas dentro do espaço intersticial. Sete dias após a lesão mediada por cardiotoxinas, novos miofibers são formados como marcados por núcleos localizados centralmente, e um acúmulo de células mononucleadas consistindo principalmente de células satélites, mas também células não iogênicas como células imunes.
Em condições de descanso, as células de satélite marcadas pela mancha Pax7 em vermelho, estão localizadas sob a lamina basal, mostrada em verde aqui. Três dias após a lesão, o número de células satélites aumenta, e as células satélites não estão mais localizadas sob a lamina basal. No dia 10, após a lesão, o número de satélites ainda é aumentado.
Para analisar melhor o processo de regeneração, os miofibers recém-formados podem ser manchados com anticorpos direcionados contra a minosina do desenvolvimento. Dois dias após a injeção com siRNA, as células satélites podem ser analisadas para a presença do siRNA rotulado fluorescentemente. Neste experimento representativo, cerca de 75% das células satélites no músculo regenerador foram positivas para o siRNA rotulado fluorescentemente.
Além disso, cerca de 74% de todos os miofibers regeneradores também foram positivos para o siRNA fluorescentemente rotulado, sugerindo que 74% dos miofibers regeneradores assumiram o siRNA, que as células de satélite siRNA-positivas haviam se fundido para formar novos miofibers, ou que a fusão com miofibers regeneradores já existentes tinha ocorrido. O passo mais crítico é conseguir uma lesão completa do músculo tibialis anterior. Além da análise histológica, parâmetros como a força gerada podem ser registrados para analisar a regeneração do músculo esquelético de forma funcional.
