Para começar, pegue as células musculares esqueléticas coradas com cisplatina, anticorpos conjugados com metal e solução de intercalador-irídio e peletize as células por centrifugação. Uma vez que o sobrenadante é removido, adicione um mililitro de CSM às células em vórtice. Pellet as células por centrifugação e lavar em um mililitro de tampão CAS.
Após centrifugação, aspirar o sobrenadante a cerca de 200 microlitros. Adicione um mililitro de tampão CAS às amostras em vórtice e alíquota de cinco microlitros para contagem de células. Depois de centrifugar as células e aspirar o sobrenadante a 50 microlitros, ressuspender as células em tampão CAS até uma concentração final de 1 milhão de células por mililitro e adicionar esferas de calibração para atingir uma concentração final de 0,1x.
Carregue a amostra no citômetro de massa para coletar dados usando uma taxa de fluxo de 400 a 500 células por segundo e normalize os dados após a coleta. Se necessário, concatene arquivos individuais de citometria de fluxo padrão ou FCS para cada amostra em um único arquivo. Identifique células individuais por meio de eventos positivos do intercalador de irídio.
Selecione eventos negativos para cisplatina para células vivas. Gate na população de interesse e quantifique a proporção relativa de células-tronco e progenitoras. Para executar análises de alta dimensão, exporte a população de interesse e use algoritmos de agrupamento.
Para análise de deslocamento X, baixe o pacote de software Vortex e o Java de 64 bits. Carregue as populações de células exportadas para um banco de dados local e defina os parâmetros de agrupamento. Para visualizar as relações espaciais entre as populações de células dentro dos aglomerados de deslocamento X, execute um layout direcionado por força.
A análise CyTOF identificou uma sequência de quatro populações, células-tronco e populações progenitoras de uma a três. As populações progenitoras P1 e P2 correspondem a células progenitoras cada vez mais maduras. P3 foi previamente identificado, mas não caracterizado devido à sua baixa abundância.
A dinâmica das células-tronco e progenitoras pós-lesão foi analisada usando CD9 por CD104 por gráficos de pontos axiais. Um aumento notável na população de células-tronco foi observado no terceiro dia, sugerindo expansão. Isso foi apoiado pelo aumento da incorporação de iododesoxiuridina, indicando proliferação celular, e maior expressão de MyoD, conforme mostrado pela sobreposição de cores.
Células-tronco ativadas marcadas por altos níveis de CD98, CD44, MyoD e iododesoxiuridina foram identificadas, ressaltando sua alta proliferação e estado ativado no terceiro dia pós-lesão.
