Para começar, corte as malhas de metal em tiras medindo 25 por 8 milímetros. Coloque as malhas personalizadas em um recipiente de esterilização e autoclave por duas horas. Após a autoclavagem, coloque o recipiente de esterilização e os frascos de 1,8 mililitro sob a bancada de fluxo laminar.
Abra o recipiente de esterilização e remova a grade de metal. Encaixe a grelha na tampa do frasco para injetáveis de 1,8 mililitros e feche o frasco. Depois de coletar o tecido do córtex ovariano humano, remova a medula e corte o tecido nas formas desejadas.
Adicione cinco mililitros da solução de vitrificação 1 no primeiro poço da placa de seis poços. Usando o filtro de células, equilibre o tecido do córtex ovariano por cinco minutos no poço 1 da placa. Mova o filtro de células com o tecido do córtex para o poço 2 contendo cinco mililitros da solução de vitrificação 2 e equilibre por cinco minutos.
Em seguida, coloque o filtro contendo o tecido do córtex no poço 3 de uma placa de seis poços, contendo cinco mililitros de solução de vitrificação 3 por seis minutos. Encha o frasco criogênico preparado com nitrogênio líquido esterilizado e coloque-o no recipiente criogênico cheio de nitrogênio líquido. Carregue as amostras de tecido na grade de metal do dispositivo de vitrificação dentro de um minuto.
Em seguida, insira a grade de metal no nitrogênio líquido no frasco criogênico baseado em grade. Adicione seis mililitros de solução de equilíbrio ao poço 1 de uma placa estéril de seis poços e, em seguida, transfira seis mililitros de RS, cada um para os poços 2 e 3. Incube por uma hora em temperatura ambiente.
Aquecer a solução de aquecimento rápido num copo esterilizado durante uma hora numa placa de aquecimento regulada para 37 graus Celsius. Sob a bancada de fluxo laminar, abra os frascos criopreservados contendo tecido cortical ovariano vitrificado. Transfira rapidamente a malha para a solução de aquecimento rápido.
Usando uma pinça estéril, transfira o tecido para a solução de equilíbrio e incube por três minutos em um agitador de balanço. Em seguida, enxágue o lenço em temperatura ambiente por 10 minutos cada com RS1 e RS2 em um agitador de balanço. Dissolva a calceína em 100 microlitros de DMSO.
Transfira três microlitros de calceína para o fundo de um tubo de 1,5 mililitro e armazene a menos 20 graus Celsius. Adicione 0,007 gramas de colagenase em um tubo de 1,5 mililitro e armazene o tubo a menos 20 graus Celsius. Adicione 997 microlitros de DPBS aos três microlitros congelados de calceína e ressuspenda para dissolver a calceína.
Em seguida, adicione pó de colagenase fria para obter 1000 microlitros de solução de trabalho. Em seguida, adicione 500 microlitros de solução de calceína de trabalho e transfira dois pedaços de dois milímetros de fragmentos de córtex ovariano para os poços de um prato de quatro poços. Em seguida, incube por 90 minutos a 37 graus Celsius, protegendo da luz.
Finalmente, sob microscopia de fluorescência, determinar a viabilidade folicular.
