A vitrificação oócida e os procedimentos de aquecimento são essenciais para a preservação da fertilidade. Seguir este protocolo como demonstrado permite que um usuário maximize a eficácia desses procedimentos. A preservação da fertilidade para a vitrificação oócida é hoje uma abordagem estabelecida e eticamente aceitável.
Permite alcançar desfechos clínicos eficazes e consistentes e superar a limitação moral e legal associada à criopreservação de embriões. Para alcançar a proficiência com o processo de vitrificação, é importante familiarizar-se com todos os pontos críticos do protocolo, prestando especial atenção ao tempo de exposição das amostras aos crioprotetores. Dentro de 38 horas após a recuperação e imediatamente após a desnudação, rotule todos os suprimentos plásticos com o nome do paciente, RG e tipo de solução, e peça a uma testemunha que confirme as informações do paciente sobre o dispositivo crio.
Quando todos os suprimentos tiverem sido rotulados, inverta cuidadosamente cada frasco de oócitos várias vezes para misturar e colocar uma gota de 30 microliter de meio tampão HEPES complementado com albumina de soro humano e uma solução de 30 microliter adjacente de solução de equilíbrio em uma placa de petri. Use a pipeta de stripper para colocar os oócitos na primeira gota e criar uma ponte de média a 30 microliteres de solução de equilíbrio para obter um aumento gradual na concentração dos crioprotetores. Após três minutos, adicione uma segunda gota de 30 microliter de solução de equilíbrio à placa e use a pipeta para criar uma ponte média entre as gotas de solução.
Enquanto os oócitos estão se equilibrando, adicione uma queda de 30 microliter de solução de equilíbrio para cada dispositivo criogeno a ser usado na placa. Após três minutos, mova os oócitos para a solução de equilíbrio puro por seis a nove minutos para permitir que os oócitos retornem ao seu tamanho inicial. Quando os oócitos se recuperarem, prepare um prato de FIV de poço central contendo um mililitro de solução de vitrificação.
Transfira os oócitos para o prato no mínimo possível e mova-os cuidadosamente para remover qualquer solução de equilíbrio em excesso. Aproximadamente 10 segundos antes do fim da incubação, coloque um dispositivo criofilado rotulado com as informações do paciente sob o microscópio e ajuste o foco na ponta do dispositivo crio. Coloque os oócitos no dispositivo criogeno ao lado da ponta na quantidade mínima de solução de vitrificação e mova a pipeta de stripper para longe dos oócitos para remover qualquer solução de vitrificação em excesso, deixando os oócitos cobertos com uma fina camada de meio.
Mergulhe rapidamente o dispositivo criogeno em nitrogênio líquido e agite rapidamente o dispositivo para remover quaisquer bolhas de ar de sua superfície. Segurando a tampa protetora do dispositivo criogeno com pinças, encha a tampa com nitrogênio líquido antes de inserir o dispositivo na tampa, mantendo as tiras de propileno em nitrogênio líquido. Em seguida, armazene o dispositivo criogeno em um visotube rotulado com as informações do paciente e atualize a folha de laboratório.
Para o aquecimento do oócito, inverta cuidadosamente cada frasco de solução de descongelamento, diluição e lavagem aquecida à temperatura ambiente, e adicione um mililitro de solução de descongelamento ao poço central de uma placa de petri para uma incubação de pelo menos uma hora a 37 graus Celsius. Rotule todos os suprimentos plásticos com o nome e a ID do paciente e o tipo de solução, e peça a uma testemunha que confirme as informações do paciente sobre o dispositivo crio. Para que cada dispositivo seja aquecido, adicione 200 microliters de solução de diluição ao primeiro poço de uma placa de seis poços e adicione um volume igual de solução de lavagem ao segundo e terceiro poços da placa.
Adicione PBS à área do lado de fora dos poços para evitar a evaporação da solução. Coloque o prato de solução de descongelamento sob o microscópio estéreo e ajuste o foco para o centro do prato. Torça cuidadosamente para remover a tampa protetora de um dispositivo criotilo, mantendo as tiras de propileno em nitrogênio líquido e transfira o dispositivo criogeno do nitrogênio líquido para a solução de descongelamento o mais rápido possível para evitar o risco de desvitarificação.
Após um minuto, concentre-se na ponta do dispositivo criogeno para localizar os oócitos e eventualmente use uma pipeta de stripper para liberar suavemente os oócitos do dispositivo. Use uma pipeta stripper de 170 mícrons de diâmetro para transferir os oócitos e um pequeno volume de solução de descongelamento para a solução de diluição no primeiro poço da placa de seis poços. Depois de três minutos, mova os oócitos para o primeiro poço de solução de lavagem por cinco minutos.
Ao final da incubação, transfira os oócitos para o segundo poço de solução de lavagem e incubar a 37 graus Celsius por um minuto antes de transferir os oócitos para um volume apropriado de meio de cultura de FIV pré-equilibrada por uma hora e atualizar a folha de laboratório. Durante um período de 12 anos, 285 mulheres foram submetidas a pelo menos uma recuperação de oócito, implicando a vitrificação de toda a coorte de ovos maduros coletados. A maioria dessas mulheres foi submetida a uma única recuperação.
35 foram submetidos a múltiplas recuperações. As razões para a recuperação de oócitos para vitrificação de óvulos foram geralmente caracterizadas como médicas que não o câncer, câncer, não médicas, entre outras. Pacientes com uma razão médica para a vitrificação dos óvulos e pacientes submetidos à preservação da fertilidade por causa do câncer eram mais jovens e apresentavam maior contagem folicular antral do que pacientes com razões não médicas ou outras.
No entanto, como as taxas médias de maturação foram ligeiramente menores nas razões médicas, o número de oócitos vitrificados em média foi semelhante entre os grupos. Aproximadamente metade dos pacientes com razões médicas além do câncer, e a maioria dos pacientes com outras razões para a vitrificação de óvulos realmente retornou para o aquecimento. Por outro lado, muito poucos pacientes submetidos à preservação da fertilidade por câncer ou razões não medídicas usaram seus oócitos vitrificados para FIV.
Apesar das diferenças no tempo decorrido entre vitrificação e aquecimento, a taxa de sobrevivência dos oócitos foi semelhante entre os grupos de pacientes, confirmando a eficácia e a segurança dos protocolos de vitrificação e aquecimento oócitos. Além disso, a taxa de sobrevivência foi independente da experiência do operador de vitrificação e aquecimento. Os passos mais cruciais que podem afetar a consistência dos resultados são os relacionados com o aquecimento.
Por isso, é muito importante controlar cuidadosamente o volume e a temperatura das soluções de descongelamento. Criopreservação de tecido ovariano a única estratégia atualmente em investigação como opção para pacientes pré-pubertal. Embora promissora, essa abordagem tem uma limitação importante que limitou sua aplicação.
