Name: quantitation of intra-peritoneal ovarian cancer metastasis
Uploaded: 2016-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis at JoVE.com

This research was supported by research grants RO1CA109545 and RO1CA086984 to M.S.S. by the National Institutes of Health/National Cancer Institute and by an award from the Leo and Ann Albert Charitable Trust (to M.S.S.).

Todos os estudos in vivo foram aprovados pela Universidade de Notre Dame Animal Care e do Comitê Use e usado feminino camundongos C57 / BL6J. Cultura de Células 1. Murino cancro do ovário <ol><li> Adicione o meio de cultura ID8 murino ovário de células de cancro da seguinte forma: 1 L de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 4% de Soro Bovino Fetal (FBS), 1% de Penicilina / Estreptomicina, 5 ug / ml de insulina, 5 ug / ml de transferrina e 5 ng / ml de selenito de sódio. </li><li> Transdução ID8 células de câncer de ovário murino 13 para expressar Red Fluorescent Protein (RFP), utilizando partículas lentivirais comercialmente adquiridos expressam RFP e um marcador de selecção (blasticidina gene). Note-se que a proteína fluorescente verde pode ser usado, mas fornece um sinal de fluorescência mais fraca. <ol><li> Imediatamente antes da transdução, as células de cultura a 50 - 70% de confluência e adicionar meio fresco (sem penicilina / estreptomicina) que inclui 1 ml de polibreno (5 ug / ml final,concentração). </li><li> Suavemente pipeta RFP-lentivírus (20 mL) gota a gota para o prato e incubar a 37 ° C durante 72 horas. Remova o meio e incubar com meio fresco durante 24 h. Comece a selecção de células transduzidas por adição de blasticidina para o meio de cultura (5 ug / ml) e monitor para células vermelhas através de microscopia de fluorescência (Figura 1). </li></ol></li><li> Cultura das células marcadas com RFP em forma ID8 por sementeira de aproximadamente 10 6 células num prato de cultura de tecidos e visualizando diariamente utilizando um microscópio de luz, até que a monocamada de células é confluente. </li><li> Quando confluentes, colher as células utilizando tripsina (0,25%, 3 min) e devolver o balão para a incubadora a 37 C até que o as células são separadas. </li><li> Neutraliza-se a tripsina com 6 mL de meio de cultura contendo soro de ID8. Pipeta cima e para baixo contra o fundo do prato, em seguida, transferir para um tubo de 15 ml. Centrifugar a 1200 rpm durante 2 min, em seguida, aspirar o meio utilizando uma glpipeta ass. </li><li> Lavam-se as células com tampão fosfato salino (PBS) por ressuspensão suave em 6 ml de PBS morno e centrifugação como em 1.5 acima. Re-suspender em PBS para uma concentração final de 5 x 10 6 células / ml. Manter as células quentes (37 ° C) até injeção. </li></ol> 2. intra-peritoneal injecção de células ID8 e in vivo de imagens <ol><li> Injectar cada ratinho, com 2 ml de solução de ID8-PBS quente para um total de 10 milhões de células por via intra-peritoneal (ip). Permitir que as células tumorais a crescer in vivo, durante cerca de 10 semanas, com imagens ao vivo semanal. </li><li> Imediatamente após a injecção e cada semana depois disso, pesar os ratos e depois anestesiar cada rato usando isofluorano (taxa de fluxo de 2,5% em 0,5 L / min O 2 de fluxo). Nota: Os ratinhos foram pesados, e não como uma medida quantitativa da carga tumoral, mas sim uma medida mais geral de ratinho individual progressão física ao longo do estudo. camundongos pesamts foram comparados com os seus próprios valores de peso anteriores. <ol><li> Anestesiar ratos, colocando em uma câmara de isoflurano. Manter a anestesia constantes durante a digitalização posicionando a cabeça de rato no nariz-cone para a exposição ao isoflurano caudal de 2,5% durante todo o procedimento. </li></ol></li><li> Use creme depilatório para remover os pêlos do torso e do abdome de cada rato, como o cabelo preto fará com que a atenuação do sinal de fluorescência. Os ratinhos são banhadas com água morna, após a aplicação do creme depilatório e secou-se com toalhas de papel RT. </li><li> Enquanto anestesiados, digitalizar todo o corpo de cada rato usando um sistema de imagem óptico de pequenos animais. Verificar todos os ratos em uma coorte em cada ponto de tempo. Use o seguinte dois protocolo passo (Figura 2A): <ol><li> No Passo 1, para observar as células tumorais marcadas por fluorescência (RFP), executar aquisição multi-espectral para recolher um total de 5 imagens usando filtros de excitação de 440 nm, 460 nm, 480 nm, 520 nm e 540 nm e um filtro de emissão de 600 nm. Utilize os seguintes parâmetros de aquisição: a exposição padrão de 15 segundos, 2 x 2 binning, FOV de 160 mm e f parada de 1,1. </li><li> No Passo 2, para observar o animal inteiro, adquirir uma imagem de reflectância usando um filtro aberto de excitação (luz branca), um filtro de emissão aberta, uma exposição padrão de 0,2 seg com 2 x 2 e arrumação de um FOV de 16 cm. Nota: O tempo de imagem efectivo é de ~ 1 min. </li></ol></li></ol> 3. Rato Dissecção e Aquisição de Imagem <ol><li> Quando imagens ao vivo mostra a presença de doença intra-peritoneal ou animais acumulação extensiva exposição de ascite (como evidenciado pela distensão abdominal), perda ou ganho de peso corporal superior a 20%, letargia ou outros sinais de aflição, eutanásia cada rato usando CO 2 anestesia seguida de deslocação cervical. </li><li> Cortar a pele anteriormente ao longo da linha média ventral do rato, usando dissectio pontasn tesoura, a partir da parte superior das coxas para a parte inferior da caixa torácica. Tome muito cuidado para cortar apenas a camada da pele (Figura 2BI). Delicadamente separar a pele do tecido peritoneal, tendo a certeza de não perfurar a parede peritoneal. </li><li> Com uma tesoura de dissecação, cortados pontiagudas tanto lateralmente ao longo da parte inferior da caixa torácica e na parte superior das coxas para criar duas abas de pele (Figura 2B II, III). </li><li> Coloque cada rato em seu lado ventral (cavidade peritoneal voltada para baixo) com as abas de pele abriu e digitalizar cada rato com seus órgãos in situ usando o pequeno sistema de imagem óptico do animal (Figura 3A, B). <ol><li> Use os mesmos parâmetros de aquisição de imagem, conforme descrito no 2.4.1.-2.4.2. </li></ol></li><li> Continuar dissecando o rato através da extracção de órgãos peritoneais individuais, incluindo fígado, omento / pâncreas, estômago, diafragma, intestino delgado, intestino grosso, à esquerda e à direita do peritoneu, ovários, kidneys, mesentério e almofada de gordura. <ol><li> Observe, enumerar e registrar tumores visíveis em cada órgão. Use uma pinça para medir o diâmetro de cada tumor. </li><li> Designar tumores inferior a 2 mm de diâmetro tão pequeno, de entre 2 e 5 mm como meio e superior a 5 mm, como grande. </li></ol></li><li> Colocar os órgãos sobre o modelo de varrimento do órgão (Figura 4) que identifica um local pré-determinado para cada órgão. Use PBS para manter os órgãos úmido. </li><li> Digitalizar cada folha de órgãos que utilizam o pequeno sistema de imagem óptico do animal (Figura 3C, D). <ol><li> Use os mesmos parâmetros de aquisição de imagem como descrito no passo 2.4. </li></ol></li><li> Após a digitalização, órgãos lugar em formol a 10% para permitir o processamento posterior para histologia. </li></ol> 4. Quantificação da carga tumoral em the fluorescência Imagens <ol><li> A fim de reduzir a quantidade de auto-fluorescência em cada varrimento multi-espectral, primeiro unmix os ficheiros utilizando software disponível com o sistema de imagiologia de pequenos animais. <ol><li> Carregar pela primeira vez a RFP: No arquivo espectral Vivo, seguido pelo Autofluor: No arquivo Vivo Vermelho na janela de Unmixed Imagens e selecione Unmix. </li></ol></li><li> Exportar os arquivos .bip como formato de 16 bit .tiff (sem escala). </li><li> Use software ImageJ (órgãos ex vivo e, em seguida, o corpo inteiro do rato com órgãos in situ). <ol><li> Use File&gt; Open para abrir os arquivos .tiff 16 bits dos arquivos de modelo de digitalização órgão em ImageJ. </li><li> Sob Image&gt; Adjust&gt; Brightness / Contrast, optar por definir o valor mínimo exibido para 0 e o valor máximo exibido para 35.353 e depois sobImagem&gt; tabelas de pesquisa, selecione Red Hot. Nota: Vários modelos animais irá requerer diferentes níveis de brilho, mas é importante para manter o brilho consistente ao longo de um determinado estudo. </li><li> Usando a ferramenta Freehand Selection, desenhe uma região de forma livre da seleção interesse (ROI) em torno de cada órgão e usar a ferramenta Measure (CTRL + M) para calcular a área de superfície de cada órgão; gravar a área de superfície de cada órgão em uma planilha. </li><li> Com o ROI desenhada em torno de cada órgão, clique direito dentro do ROI e selecione Duplicar para incluir apenas o órgão. </li><li> Enquanto olha para o órgão indivíduo, sob Image&gt; Adjust&gt; Threshold, optar por definir o limiar da imagem para um limiar menor nível de + 1200 e um limite de Nível Superior de + 1,700 para selecionar only regiões mais brilhantemente fluorescentes e verificar para seleccionar fundo escuro; selecione OK. Nota: As imagens podem exigir manipulação manual dos controles deslizantes de limiar em ImageJ para que as áreas anteriormente brilhantes são selecionados para a etapa de análise, como mostrado acima. Diferentes modelos de doença irá requerer diferentes constrangimentos de limiar, mas é importante para manter os níveis de limiar consistentes ao longo de um determinado estudo. </li><li> Sob Analisar&gt; Analisar Partículas, altere o Tamanho (pixels ^ 2) a 10 Infinito, optar por mostrar: esboços, verificar para selecionar apenas &quot;Mostrar resultados&quot; e clique em OK para medir ambas as áreas e densidades integrados matérias destas regiões brilhantes, tumores considerados. </li><li> Grave os valores de área de superfície ea densidade Raw Integrado de cada seleção tumor exibido no <strong&gt; tabela de resultados na mesma planilha contendo as áreas de superfície de órgãos. </li><li> Sob Analisar&gt; Ferramentas&gt; Calibragem Bar, adicionar uma barra de escala de calibração para as imagens dos órgãos. Nota: Neste exemplo, isso foi feito mudando o local para superior direito, a cor de preenchimento de preto, a cor do rótulo de White, o número de etiquetas a 5, as casas decimais para 0, o tamanho da fonte para 12 e o Zoom fator para 4,0 e permitindo texto em negrito. </li><li> Em Arquivo&gt; Salvar como ..., salvar a montagem como um .tiff e .jpeg. </li><li> Use File&gt; Open para abrir o arquivo .jpeg dos órgãos e, em seguida, em Inserir&gt; Caixa de Texto </strong&gt;, adicionar rótulos de órgãos através da criação de uma caixa de texto abaixo de cada uma das três linhas de órgãos. </li><li> Use File&gt; Open para abrir cada uma das ficheiros.tiff 16 bits dos scans de corpo inteiro em ImageJ a ordem do número mouse. </li><li> Sob Image&gt; Adjust&gt; Brightness / Contrast, optar por definir o valor mínimo exibido para 0 e o valor máximo exibido para + 35353 e depois em Imagem&gt; tabelas de pesquisa, selecione Red Hot. </li><li> Em Arquivo&gt; Salvar como ..., salvar a montagem como um. Tiff e .jpeg. </li></ol></li></ol> Análise 5. Os dados <ol><li> Adicionar as áreas de selecção de tumor e as densidades de matérias-integrados, respectivamente, para cada órgão de cada rato e registar a área total do tumor para cada ratinho de órgãos. </li><li> Normalizar a área gravada e integrat cruaOs valores de densidade ed para o tamanho de cada órgão pela divisão da área total da lesão e valores de densidade integrados matérias totais pela área de superfície do órgão correspondente (Tabela 1). </li><li> Calcular e representar graficamente a média de ambas as áreas de superfície do tumor normalizados e os valores de densidade em bruto integrados normalizadas (Figura 5A, B). </li><li> Comparar estes valores médios para as obtidas por contagem visual os tumores que eram visíveis a olho nu durante a inspecção de cada órgão de lesões metastáticas. </li></ol>

<ol>
	<li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+development+and+metastasis.">Ovarian cancer development and metastasis.</a> American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).</li><li>Halkia, E., Spiliotis, J., Sugarbaker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+peritoneal+metastases+from+ovarian+cancer.">Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer.</a> Gastroenterology Research and Practice. 2012, 541842-541854 (2012).</li><li>Barbolina, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+ovarian+cancer+metastasis.">Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis.</a> Cancer Treatment and Research. 149, 319-334 (2009).</li><li>Lengyel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ovarian+cancer+experimental+models.">Epithelial ovarian cancer experimental models.</a> Oncogene. 33 (28), 3619-3633 (2014).</li><li>Harter, P., duBois, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+surgery+in+ovarian+cancer+with+special+emphasis+on+cytoreductive+surgery+for+recurrence.">The role of surgery in ovarian cancer with special emphasis on cytoreductive surgery for recurrence.</a> Current Opinion in Oncology. 17 (5), 505-514 (2005).</li><li>Bristow, R. E., Puri, I., Chi, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoreductive+surgery+for+recurrent+ovarian+cancer:+a+meta-analysis.">Cytoreductive surgery for recurrent ovarian cancer: a meta-analysis.</a> Gynecologic Oncology. 112 (1), 265-274 (2009).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+metastatic+cancer+with+fluorescent+proteins.">In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins.</a> Cell Death and Differentiation. 9, 786-789 (2002).</li><li>Sweeney, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+kinetics+of+tumor-cell+clearance+in+living+animals.">Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 96, 12044-12049 (1999).</li><li>Chishima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+invasion+and+micrometastasis+visualized+in+live+tissue+by+green+fluorescent+protein+expression.">Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression.</a> Cancer Research. 57, 2042-2047 (1997).</li><li>Bouvet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+imaging+of+primary+tumor+growth+and+multiple+metastatic+events+in+a+pancreatic+cancer+orthotopic+model.">Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model.</a> Cancer Research. 62, 1534-1540 (2002).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multiples+Uses+of+Fluorescent+Proteins+to+Visualize+Cancer+in+vivo.">The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo.</a> Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).</li><li>Roby, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+syngeneic+mouse+model+for+events+related+to+ovarian+cancer.">Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer.</a> Carcinogenesis. 21 (4), 585-591 (2000).</li><li>Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+intraperitoneal+tumors+by+in+vivo+computed+tomography+using+negative+contrast+enhancement+strategy+in+a+mouse+model+of+ovarian+cancer.">Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer.</a> Translational Oncology. 2 (2), 96-106 (2009).</li><li>Kim, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+and+antivascular+effects+of+AVE8062+in+ovarian+carcinoma.">Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma.</a> Cancer Research. 67, 9337-9345 (2007).</li><li>Picchio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+ovarian+carcinoma:+usefulness+of+[(18)F]FDG-PET+in+combination+with+CT+for+lesion+detection+after+primary+treatment.">Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment.</a> Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).</li></ol>

Este artigo é parte de uma edição especial on Imaging Multimodal pré-clínica, patrocinado pela Bruker Biospin.

Em contraste com os estudos que utilizam células de cancro do ovário humano que devem ser realizados em ratinhos imunocomprometidos, o protocolo descrito acima utiliza imunocompetentes ratinhos C57 / Bl6 e células de cancro do ovário murino singeneicas. Enquanto isto permite avaliar o papel potencial de infiltrados imunes em progressão tumoral e metástases, a presença de cabelo escuro na superfície abdominal torna menos sensível imagiologia. Utilização de um depilatório para remover os pêlos antes da imagem...

Câncer epitelial de ovário (EOC) é a causa mais comum de morte por neoplasia ginecológica, com uma estimativa de 21,290 novos diagnósticos em os EUA em 2015 e uma estimativa de 14,180 mortes 1. A grande maioria (&gt; 75%) das mulheres são diagnosticadas com a doença de fase final (fase III ou IV), caracterizado por difuso metástases intra-peritoneal e mau prognóstico. A recorrência da doença na cavidade peritoneal na sequência da primeira linha de quimioterapia também é comum e representa uma das principais causas de mortalidade 2,3. EOC metastasizes por um único mecanismo envolvendo tanto extensão directa do tumor primário para órgãos peritoneais vizinhas, assim como pela dissociação ou derramamento de células da superfície do tumor primário, como células individuais ou agregados multicelulares. As células são vertidos para dentro da cavidade peritoneal, em que eles resistir apoptose induzida por descolamento 4. Acúmulo de ascite peritoneal é comum, como as células tumorais derramam bloquear a drenagem linfática peritoneal e tumors produzem fatores de crescimento que alteram a permeabilidade vascular. Uma porção de células tumorais vertente anexar à superfície de órgãos e estruturas peritoneais incluindo intestino, fígado, mesentério e omento, após o que ancorar e proliferam para produzir múltiplas lesões secundárias amplamente disseminadas 3,5. metástase hematogênica é incomum. Assim, a gestão clínica comumente consiste em cirurgia cytoreductive incluindo &quot;debulking óptima&quot;, definida como a ressecção de todo o tumor visível (não importa quão pequena). Citorredução completa está associada a um aumento significativo na sobrevivência global 6,7 e está associada com o desafio da identificação e da remoção de lesões &lt;0,5 cm. modelos animais pequenos têm demonstrado utilidade na pesquisa do câncer de ovário em melhorar o nosso entendimento da progressão da doença, bem como em identificação de biomarcadores de prognóstico e ensaio de novas quimioterapias ou abordagens de terapia de combinação. À medida que o primáriolocal de incidência de câncer de ovário e metástase é a cavidade peritoneal, modelos ortotópicos de EOC metástase envolvem a análise e caracterização da doença intraperitoneal. Embora tenha havido recentes melhorias na capacidade de células tumorais imagem, mesmo ao nível de uma única célula, ainda existem dificuldades significativas na quantificação da carga de tumor metastático de EOC. Estes desafios surgem devido ao número, tamanho e localização anatômica das lesões metastáticas. Além disso, existe uma necessidade para células de cancro da etiqueta para distingui-las das células hospedeiras normais. Estudos anteriores utilizaram protocolos de rotulagem baseadas em anticorpos ou a transfecção de células de tumor com 8,9 luciferase. A marcação directa fluorescente de células cancerosas foi relatada pela primeira vez por Chishima e colaboradores em 1997 10. Os marcadores fluorescentes não necessitam de adição de substrato exógeno e proporcionar especificidade de células tumorais requintado, proporcionando um meio mais eficaz para controlar metástases de cancro 11,12 </sup&gt;. Aqui nós descrevemos um método de imagem óptico para análise quantitativa de doença metastática utilizando um modelo de xenoenxerto ortotópico singênico composta de proteína fluorescente vermelha (RFP) tagged ID8 células de câncer de ovário murino 13 e camundongos C57 / Bl6 imuno-competente. Nós demonstramos um método novo para a quantificação da carga tumoral em relação combinar imagens in vivo e ex vivo com a remoção de tecido auto-fluorescência. Esta abordagem tem uma utilidade potencial em estudos destinados a avaliar o efeito do específica genética, epigenética ou micro-ambientais modificações e / ou modalidades de tratamento específico nas metástases de órgãos de cancro do ovário.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Corning</td><td>10-014-CM</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement</td><td>Sigma</td><td>I-1884</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Xtreme small animal imaging system</td><td>Bruker Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Multispectral software</td><td>Bruker Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lentiviral particles with Red fluorescent protein</td><td>GenTarget, Inc.</td><td>LVP023</td><td></td></tr><tr><td>trypsin for cell culture</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)</td><td>purchases from drugstore&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software&amp;nbsp;</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/&amp;nbsp;</td><td></td><td>free download</td></tr><tr><td>dissecting tools (forceps)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>&amp;nbsp;RS 5130</td><td></td></tr><tr><td>dissecting tools (Scissors)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS 5910</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitation of intra-peritoneal ovarian cancer metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

O mecanismo metastático do câncer de ovário é caracterizada por metástase intra-peritoneal altamente difuso composto por numerosas lesões de tamanhos variados, incluindo múltiplas (&lt;2mm) pequenas lesões. Assim, a utilização de células tumorais marcadas com RFP (Figura 1) e imagiologia óptica fornece um método alternativo para a contagem manual e medição do tamanho da lesão. O desenvolvimento do peso do tumor ao longo do tempo pode ser determinada por p...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis at JoVE.com

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

A quantificação da Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metástase

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

quantitation-of-intra-peritoneal-ovarian-cancer-metastasis

Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K visualizações.  University of Notre Dame. Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Vídeo: Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all gynecologic malignancies among US women 1,2,3. Serous tumors are the most widespread forms of ovarian cancer and 4,5 the Tg-MISIIR-TAg transgenic represents the only mouse model that spontaneously develops this type of tumors. Tg-MISIIR-TAg mice express SV40 transforming region under control of the Mullerian Inhibitory Substance type II Receptor (MISIIR) gene promoter 6. Additional transgenic lines have been identified that express the SV40 TAg transgene, but do not develop ovarian tumors. Non-tumor prone mice exhibit typical lifespan for C57Bl/6 mice and are fertile. These mice can be used as syngeneic allograft recipients for tumor cells isolated from Tg-MISIIR-TAg-DR26 mice.
Objective: Although tumor imaging is possible 7, early detection of deep tumors is challenging in small living animals. To enable preclinical studies in an immunologically intact animal model for serous ovarian cancer, we describe a syngeneic mouse model for this type of ovarian cancer that permits in vivo imaging, studies of the tumor microenvironment and tumor immune responses.
Methods: We first derived a TAg+ mouse cancer cell line (MOV1) from a spontaneous ovarian tumor harvested in a 26 week-old DR26 Tg-MISIIR-TAg female. Then, we stably transduced MOV1 cells with TurboFP635 Lentivirus mammalian vector that encodes Katushka, a far-red mutant of the red fluorescent protein from sea anemone Entacmaea quadricolor with excitation/emission maxima at 588/635 nm 8,9,10. We orthotopically implanted MOV1Kat in the ovary 11,12,13,14 of non-tumor prone Tg-MISIIR-TAg female mice. Tumor progression was followed by in vivo optical imaging and tumor microenvironment was analyzed by immunohistochemistry.
Results: Orthotopically implanted MOV1Kat cells developed serous ovarian tumors. MOV1Kat tumors could be visualized by in vivo imaging up to three weeks after implantation (fig. 1) and were infiltrated with leukocytes, as observed in human ovarian cancers 15 (fig. 2).
Conclusions: We describe an orthotopic model of ovarian cancer suitable for in vivo imaging of early tumors due to the high pH-stability and photostability of Katushka in deep tissues. We propose the use of this novel syngeneic model of serous ovarian cancer for in vivo imaging studies and monitoring of tumor immune responses and immunotherapies.

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

To study in vivo tumor growth and tumor microenvironment, we used a syngeneic and orthotopic mouse model of ovarian cancer in immunocompetent animals. We transduced a mouse tumor cell line (MOV1) with Katushka fluorescent protein (MOV1KAT) and here we show its orthotopic implantation in ovary and in vivo imaging.

Um modelo ortotópico de câncer de ovário seroso em camundongos imunocompetentes para In vivo Imaging Tumor e Monitoramento de Tumor respostas imunes

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Imunologia e Infecção

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic spread has already occurred. However, ovarian cancer has a unique pattern of metastatic spread, in that tumor implants are initially contained within the peritoneal cavity. This feature could enable, in principle, the complete resection of tumor implants with curative intent. Many of these metastatic lesions are microscopic, making them hard to identify and treat. Neutralizing such micrometastases is believed to be a major goal towards eliminating tumor recurrence and achieving long-term survival. Raman imaging with surface enhanced resonance Raman scattering nanoprobes can be used to delineate microscopic tumors with high sensitivity, due to their bright and bioorthogonal spectral signatures. Here, we describe the synthesis of two &#39;flavors&#39; of such nanoprobes: an antibody-functionalized one that targets the folate receptor &#8212; overexpressed in many ovarian cancers &#8212; and a non-targeted control nanoprobe, with&#160;distinct spectra. The nanoprobes are co-administered intraperitoneally to mouse models of metastatic human ovarian adenocarcinoma. All animal studies were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Memorial Sloan Kettering Cancer Center. The peritoneal cavity of the animals is surgically exposed, washed, and scanned with a Raman microphotospectrometer. Subsequently, the Raman signatures of the two nanoprobes are decoupled using a Classical Least Squares fitting algorithm, and their respective scores divided to provide a ratiometric signal of folate-targeted over untargeted probes. In this way, microscopic metastases are visualized with high specificity. The main benefit of this approach is that the local application into the peritoneal cavity &#8212; which can be done conveniently during the surgical procedure &#8212; can tag tumors without subjecting the patient to systemic nanoparticle exposure. False positive signals stemming from non-specific binding of the nanoprobes onto visceral surfaces can be eliminated by following a ratiometric approach where targeted and non-targeted nanoprobes with distinct Raman signatures are applied as a mixture. The procedure is currently still limited by the lack of a commercial wide-field Raman imaging camera system, which once available will allow for the application of this technique in the operating theater.

Ovarian cancer forms metastases throughout the peritoneal cavity. Here, we present a protocol to make and use folate-receptor targeted surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobes that reveal these lesions with high specificity via ratiometric imaging. The nanoprobes are administered intraperitoneally to living mice, and the derived images correlate well with histology.

Ressonância de superfície melhorada Raman dispersão nano-sonda Ratiometry para detecção de câncer de ovário microscópico através do Receptor de folato como alvo

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Pesquisa do câncer

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Medicina

An Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer using Human Stroma to Promote Metastasis

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant transgenic mouse models of ovarian cancer exist, these mice are expensive and take a long time to develop tumors. Intraperitoneal injection xenograft models lack human stroma and do not accurately model ovarian cancer metastasis. Even patient derived xenografts (PDX) do not fully recapitulate the human stromal microenvironment as serial PDX passages demonstrate significant loss of human stroma. The ability to easily model human ovarian cancer within a physiologically relevant stromal microenvironment is an unmet need. Here, the protocol presents an orthotopic ovarian cancer mouse model using human ovarian cancer cells combined with patient-derived carcinoma-associated mesenchymal stem cells (CA-MSCs). CA-MSCs are stromal progenitor cells, which drive the formation of the stromal microenvironment and support ovarian cancer growth and metastasis. This model develops early and diffuses metastasis mimicking clinical presentation. In this model, luciferase expressing ovarian cancer cells are mixed in a 1:1 ratio with CA-MSCs and injected into the ovarian bursa of NSG mice. Tumor growth and metastasis are followed serially over time using bioluminescence imaging. The resulting tumors grow aggressively and form abdominal metastases by 14 days post injection. Mice experienced significant decreases in body weight as a marker of systemic illness and increased disease burden. By day 30 post injection, mice met endpoint criteria of &gt;10% body weight loss and necropsy confirmed intra-abdominal metastasis in 100% of mice and 60%-80% lung and parenchymal liver metastasis. Collectively, orthotopic engraftment of ovarian cancer cells and stroma cells generates tumors that closely mimic the early and diffuse metastatic behavior of human ovarian cancer. Furthermore, this model provides a tool to study the role of ovarian cancer cell: stroma cell interactions in metastatic progression.

Orthotopic engraftment of ovarian cancer cells mixed with human stromal cells provides a mouse model that exhibits rapid, diffuse metastatic behavior that is characteristic of human ovarian cancer. This model also allows for the study of tumor cell and stromal cell interactions, as well as their role in tumor progression and metastasis.

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Avaliação do cancro do ovário esferóide Apego e invasão de células mesoteliais em Tempo real

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Murine Model for Non-invasive Imaging to Detect and Monitor Ovarian Cancer Recurrence

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of care consisting of surgical debulking and combination chemotherapy consisting of platinum and taxane compounds, almost 90% of patients recur within a few years. In these patients the development of chemoresistant disease limits the efficacy of currently available chemotherapy agents and therefore contributes to the high mortality. To discover novel therapy options that can target recurrent disease, appropriate animal models that closely mimic the clinical profile of patients with recurrent ovarian cancer are required. The challenge in monitoring intra-peritoneal (i.p.) disease limits the use of i.p. models and thus most xenografts are established subcutaneously. We have developed a sensitive optical imaging platform that allows the detection and anatomical location of i.p. tumor mass. The platform includes the use of optical reporters that extend from the visible light range to near infrared, which in combination with 2-dimensional X-ray co-registration can provide anatomical location of molecular signals. Detection is significantly improved by the use of a rotation system that drives the animal to multiple angular positions for 360 degree imaging, allowing the identification of tumors that are not visible in single orientation. This platform provides a unique model to non-invasively monitor tumor growth and evaluate the efficacy of new therapies for the prevention or treatment of recurrent ovarian cancer.

We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.

Modelo murino de imagem não invasivo para detectar e monitorar o cancro do ovário Recorrência

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of ...

Estabelecendo um modelo 3D ex vivo para interação câncer de ovário-omento

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian cancer cells as well as immune modulatory signals that allow tumor tolerance. However, we have limited models that closely mimic the interaction between ovarian cancer cells and adipose-rich tissues. To further understand the cellular and molecular mechanisms by which the omentum provides a pro-tumoral microenvironment, we developed a unique 3D ex vivo model of cancer cell-omentum interaction. Using human omentum, we are able to grow ovarian cancer cells within this adipose-rich microenvironment and monitor the factors responsible for tumor growth and immune regulation. In addition to providing a platform for the study of this adipose-rich tumor microenvironment, the model provides an excellent platform for the development and evaluation of novel therapeutic approaches to target metastatic cancer cells in this niche. The proposed model is easy to generate, inexpensive, and applicable to translational investigations.

Autor em destaque: Modelo ex vivo avançado para investigar a interação câncer-microambiente adiposo 

This protocol describes the establishment of a three-dimensional (3D) ex vivo model of cancer cell-omentum interaction. The model provides a platform for elucidating pro-tumor mechanisms within the adipose niche and for testing novel therapies.

Modelo Ex Vivo de Metástase Peritoneal de Câncer de Ovário Utilizando Omento Humano

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In Vivo e Ex Vivo Abordagens para o Estudo do cancro do ovário metastático Colonização de Estruturas Láctea natural em Peritoneal adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

A quantificação da Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metástase

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Um modelo ortotópico de câncer de ovário seroso em camundongos imunocompetentes para In vivo Imaging Tumor e Monitoramento de Tumor respostas imunes

Ressonância de superfície melhorada Raman dispersão nano-sonda Ratiometry para detecção de câncer de ovário microscópico através do Receptor de folato como alvo

Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

An Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer using Human Stroma to Promote Metastasis

Avaliação do cancro do ovário esferóide Apego e invasão de células mesoteliais em Tempo real

Modelo murino de imagem não invasivo para detectar e monitorar o cancro do ovário Recorrência

Modelo Ex Vivo de Metástase Peritoneal de Câncer de Ovário Utilizando Omento Humano

Modelo Ex Vivo de Metástase Peritoneal de Câncer de Ovário Utilizando Omento Humano

Modelo Ex Vivo de Metástase Peritoneal de Câncer de Ovário Utilizando Omento Humano

In Vivo e Ex Vivo Abordagens para o Estudo do cancro do ovário metastático Colonização de Estruturas Láctea natural em Peritoneal adiposo