This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).

Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com a Política de Atenção Humanizada e Uso de Animais de Laboratório estabelecido pelo Office of Laboratory Animal Welfare (NIH) e somente com a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso Animal Institucional (IACUC) da Universidade de Centro de Saúde de Connecticut. 1 Preparação de culturas mista glial <ol><li> Esterilizar todos os instrumentos antes de usar. Adicione 3 mL de solução gelada estéril salina equilibrada de Hank (HBSS) contendo catiões não (Mg2 + ou Ca2 +) para 60 milímetros estéreis três placas de Petri mantidos em gelo para manter frio. </li><li> Isolar os córtices de pós-natais P0-P2 rato filhotes, como descrito anteriormente 17,18. NOTA: As estruturas subcorticais, como o hipocampo, não estão incluídos nestas culturas. </li><li> Retire cuidadosamente as meninges e, em seguida, transferir os córtices isoladas de HBSS e dissociar os tecidos enzimática, utilizando um nekit dissecção dos tecidos ural de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Placa as células em estéreis frascos T-175 e incubar durante a noite em meio [meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) contendo 1x penicilina / estreptomicina]. </li><li> Substituir todos os meios de comunicação social no dia seguinte com meio fresco. Continue-se a incubar as culturas, com mudanças de meio regulares, durante cerca de 3 semanas ou até que uma monocamada celular é estabelecida. NOTA: Este monocamada será compreendido de astrócitos e microglia com cerca de 10: 1 19. </li></ol> 2. Globóides Indução celular em culturas mista glial <ol><li> Prepare as lamelas revestidos de ECM. <ol><li> Soak lamelas circulares com ácido clorídrico 1 N estéril (HCl) em uma placa de Petri esterilizada, durante 30 minutos. Lavar 3x lamelas com água esterilizada e depois imersão em 95% de EtOH, durante pelo menos 20 min. e deixe secar ao ar. </li><li> Coloque gotas de matr extracelular diluídomateriais ix (ECM) de revestimento de proteína sobre uma folha de Parafilm (por exemplo, 150-250 mL / gotícula da laminina de 10 ug / ml dissolvido em solução tampão de fosfato estéril [PBS]). Distribua as gotas para que lamelas não vai tocar quando colocada sobre essas gotículas. Delicadamente, coloque cada lamela seca em uma gota com a pinça. </li><li> Deixe as lamelas sobre as gotas de aprox. 4-6 horas dentro da capa de cultura com a faixa fechada. </li><li> Coloque as lamelas revestidas com MEC (revestido de ECM secundários acima) em cada um dos poços de uma placa de 24 poços. Lavar cada poço com 3 x PBS estéril e manter a 4 ° C até ser necessário. </li></ol></li><li> Preparação da glia As células para plaqueamento em Lamelas. <ol><li> Aspirar a mídia das culturas gliais e lavar cuidadosamente as 3x monocamada gliais com 10 ml de PBS estéril. Em seguida, adicionar 8-10 ml de solução de tripsina-EDTA para o T-175, e incubar durante 5-10 min a 37 ° C. </li><li> Quando a maioria da monocamada foi individual, adicionar 20 ml de meio completoao frasco para parar a tripsinização. Recolher os meios contendo as células isoladas num tubo de 50 ml e girar durante 10 min a 300 xg à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento, e, em seguida, re-suspender as células em 2 ml de meio completo fresco pipetando suavemente a solução usando uma pipeta P1000. </li><li> Determinar o número de células utilizando um hemocitómetro e, em seguida, re-suspender as células em meio completo com uma densidade desejada (por exemplo 10 5 células / ml). Placa as células nas lamelas de cobertura revestidas com ECM (por exemplo, 500 ul em cada poço da placa de 24 poços). Adicionar meio completo fresco adicionais a cada poço para 3-5 dias de incubação a 37 ° C, ou até que as células crescer até à confluência desejado visual. </li></ol></li><li> O tratamento com Psicosina. <ol><li> Reconstituir o psicosina a uma concentração de estoque (108,3 mM) em dimetil sulfóxido (DMSO). Diluir esse estoque em 100% EtOH para fazer um estoque de trabalho que pode on ser adicionado em cada poço da placa de 24 poços para atingir uma concentração final de 10 uM. </li><li> No momento da adição do psicosina, agite suavemente a placa de cultura para misturar o psicosina em meios de cultura. Suplementar o psicosina adicionando o equivalente a 10 uM em dias alternados durante uma semana. </li></ol></li><li> Após 7 dias de tratamento psicosina, recolher os meios de comunicação e de pipeta 500 mL de frio paraformaldeído 4% (PFA) em cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 20 minutos para fixar as células. Em seguida, lavar cada poço 3 vezes com PBS e, em seguida, manter as placas a 4 ° C até serem processadas para imunocitoquímica (ver abaixo). NOTA: meios de cultura de células podem ser recolhidas para enzimática ou ensaio ELISA, neste ponto, se desejado. </li></ol> 3. Imunocitoquímica (ICC) para visualizar Globóides Células <ol><li> Substituir PBS com tampão [PBS + 0,3% de Tween-20 + 5% de soro normal de cabra (NGS)] de bloqueio, e incuba-se as células durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> EmCubate as células fixadas em anti-soros contra o primário Iba-1 [(1: 1000), diluído em PBS + 0,3% de Tween-20 + 2% de NGS] durante pelo menos 1 hora à temperatura ambiente, em seguida lavar cada poço com PBS 3 x 5 min / lavar. </li><li> Adicionar o anticorpo secundário conjugado de fluorescência adequado para identificar a marcação de anticorpos e anti-mancha principal com 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, 1: 1000) para identificar os núcleos. Incubar em solução de anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente e lava-se com PBS, 3x 5 minutos. </li><li> Monte cada lamela a lâminas de microscópio utilizando um meio de montagem. Exibir slides em um microscópio de fluorescência para análise visual e quantitativa. </li></ol> 4 Análise e caracterização de células Globóides em cultura primária <ol><li> Use as três seguintes critérios morfológicos para identificar uma célula Globóides na cultura: <ol><li> Identificar células Globóides usando microscopia de fluorescência através da marcação imunoistoquímica para o marcador de microglia, Iba-1 +. </li><li> IdentificarGlobóides como células polinucleadas (isto é, contendo dois ou mais núcleos positivos DAPI). </li><li> Identificar células Globóides por uma morfologia arredondada distinta da aparência muito ramificado de descansar micróglias. NOTA: As células também podem ser recolhidos para análise de marcadores de superfície das células e quantificação por citometria de fluxo a partir de destas culturas. </li></ol></li><li> Medir a ativação fagocitária de microglia e células Globóides <ol><li> Para avaliar a atividade fagocítica de microglia tratados com psicosina, adicione esferas de látex FITC identificados nos poços, de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar pérolas de látex fluorescentes conjugados 48 horas antes da fixação com PFA. Corrigir as células tratadas com pérolas (como mencionado na seção 2.4), e processo para imunocitoquímica (como descrito na seção 3). </li><li> Seleccionar anticorpos secundários fluoróforos de modo que eles não se sobreponham os espectros de emissão de fluorescência do fluoróforo às contas de rotulado. </li><li> Analyze os perfis de fagocï¿½ica Iba-1 + microglia por identificação das células que co-localizados com os grânulos fluorescentemente marcado. NOTA: Psicosina ativará microglia. Grânulos fagocitados serão identificados dentro Iba-1 células mononucleares e multinucleadas + neste cenário cultura. </li></ol></li></ol> 5. indução de células Globóides de culturas puras Microglial Observação: Uma abordagem alternativa para decifrar a sinalização intercelular entre astrócito e microglia é outra vantagem deste modelo in vitro de células globoso. A purificação de células microgliais primárias para replating ou de co-cultura pode ser obtida pela sua propriedade de aderência inferior em cultura, tal como descrito nos passos seguintes (ver Secção 5.2). <ol><li> Recolha a mídia das culturas gliais mistas confluentes em tubo de 50 ml e mantê-la a 37 ° C na incubadora. </li><li> Isolamento da microglia de culturas mista glial primários.<ol><li> Depois de remover a mídia de uma garrafa mista confluente T175 cultura glial, adicionar mídia agitação quentes [consistindo de mídia completo + 25 mM 4 (2-hidroxietil) -1-piperazina (HEPES) de bicarbonato de sódio + 25 mM (Sigma)]. Agitar os frascos durante 3-4 horas num agitador orbital a 100 rpm (37 ° C). Recolha os media destes frascos agitados em 50 ml tubos cônicos. NOTA: Este suporte vai incluir a microglia menos aderente dos frascos. </li><li> Girar os meios de comunicação a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e voltar a suspender as células em 2 ml do meio condicionado de astrócitos (coletados na etapa 5.1). </li><li> Estabelecer o número de células obtidas utilizando um hemocitômetro e depois a chapa micróglias em lamelas revestido de substrato (ver secção 2.1) para imunocitoquímica ou placa na ULTRALOW placas aderência bem para o futuro conjunto de células Globóides para co-cultura com outros tipos de células, tais como oligodendrócitos (como described na seção seguinte). NOTA: Uma vez banhado a microglia pode ser tratada com psicosina (10 mM), como descrito acima (ver secção 2.3). </li></ol></li><li> Co-cultura com Primários Oligodendrócitos para Análise de citotoxicidade. NOTA: Recolha de microglia tratado psicosina das baixas para as placas de aderência subsequente co-cultura em culturas primárias de oligodendrócitos, ou células progenitoras de oligodendrócito, pode ser utilizado para examinar o potencial citotóxico função destas células-globoso, como in vitro. <ol><li> Desenvolver culturas de oligodendrócitos primário utilizando métodos estabelecidos 18,20. Para recolher a microglia tratado psicosina, pipetar suavemente para separar as células fracamente aderentes a partir do fundo dos poços. Recolher as células, centrifugar a 300 xg durante 10 min, e em seguida ressuspender cuidadosamente em meios de diferenciação de oligodendrócitos [composto de meios Neurobasal, L-glutamina (1x), B-27, suplemento (1x) e triiodotironina (T3, 10 ng / mL )]. </li><li> Conte o número de células utilizando um hemocitómetro e as sementes, em seguida, para a cultura de microglia oligodendrócitos a 1 x 10 5 células / ml, resultando num aproximada proporção de 1: 2 a microglia / oligodendrócito. Incubar como uma co-cultura durante 3 dias. </li><li> Fixar as células para imunocitoquímica (ver secção 2.4). Recolhe meios de cultura de células para o ELISA ou análises químicas, conforme necessário. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no conflicts of interest.

O protocolo aqui descrito fornece um novo sistema modelo para estudar o desenvolvimento e caracterização funcional de microglia ativados e células Globóides. Trabalhos anteriores por Im et al. utilizando uma linha celular HEK293 fornecido um modelo para o desenvolvimento do presente protocolo para o estudo da formação de células globoso 21. É também importante salientar que as células derivadas Globóides no modelo diferem das células nativas Globóides identificáveis ​​em GLD. Por ex...

Leucodistrofia celular Globóides (GLD), também conhecida como doença de Krabbe, é uma doença desmielinizante fatal, resultante da perda de mutações de função no galatocerebrosidase (GalC) do gene 1. A forma mais prevalente de GLD é a variante infantil que se caracteriza por início na infância e caracteriza-se por um curso clínico agressivo do motor e do declínio cognitivo, levando à morte prematura, muitas vezes antes dos cinco anos de idade 2,3. O teste genético é utilizado para verificar o diagnóstico de GLD 4. Neuropatologia da GLD revela desmielinização generalizada, atrofia neuronal, astrogliosis e presença de microglia multi-nucleadas ingurgitadas chamadas células Globóides 5-7. A identificação de células Globóides, muitas vezes contendo inclusões tubulosas no seu citoplasma, tem sido uma característica de definição de GLD para os últimos 97 anos, embora a função específica destas células visíveis tem permanecido elusiva. A participação das organizações não-myelinating glia (microglia e astrócitos) na patogênese da GLD tem sido considerada uma resposta secundária à profunda desmielinização nesta doença 8. Curiosamente, a primeira descrição da doença, feita por Knud Krabbe em 1916 5, formação relatado dos fagócitos multinucleadas contendo detritos lipídica que foram nomeados &#39;Globóides células &quot;e são uma característica desta doença. Células Globóides são a característica marca de GLD patologia, apesar de seu papel na GLD tem sido ignorado. Curiosamente, estas células estão entre as primeiras alterações características no tecido do SNC de GLD. Esta falta de conhecimento pode ter sido devido à suposição de que a formação de fagócitos multinucleadas, chamadas de células gigantes em outras doenças, são normalmente considerados como uma consequência de uma patologia, em vez de uma força motriz patogénico inicial 9. Portanto, há poucos estudos sobre os mecanismos pelos whicélulas Globóides ch são formados a partir de fagócitos, em particular no sistema nervoso central de GLD. O procedimento descrito no presente relatório centra-se na importância da formação de células Globóides no SNC e nossa manifestação anterior que multinucleações induzida por psicosina de microglia in vitro e essas células apresentaram níveis mais altos de atividade fagocitária. Consistente com essas observações, as células Globóides em cérebros Twitcher contêm freqüentemente detritos PAS-positivo, sugerindo níveis elevados de atividade fagocitária. Células Globóides também são encontrados para ser imunopositivas para ferritina (um marcador de microglia) 10, KP-1 / CD68 (um marcador de monócitos), e alguns também são positivas para vimentina (uma proteína intermediária filamento e marcador de astrócitos e microglia ativada) 11, HLA-RDa (um receptor da superfície MHCII), e TNF-α 7, e Iba-1 (uma proteína de ligação de cálcio utilizado para identificar microglia) 12. Com base neste conjunto de marcadores, células Globóides originam de microglia que desenvolvemum fenótipo original. Apesar de sua singularidade, a função ea contribuição dos GCs para GLD patogênese específica tem sido largamente ignorado. Células Globóides ter sido pensado para ser uma consequência secundária de desmielinização crônica. No entanto, estudos anteriores examinaram a relação temporal de células Globóides para a patologia da substância branca de GLD identificaram a presença de células no final do Globóides embrionário para períodos de pós-natais; tempos que precederam a apoptose de oligodendrócitos e desmielinização evidente 13. Assim, a sequência temporal do desenvolvimento da neuropatologia no GLD sugere que as células Globóides são formadas antes da desmielinização nesta doença 14. Isto levou a nossa hipótese de que o início da formação de células Globóides em GLD pode representar um evento patogénico definindo, em vez de, uma resposta secundária a danos reactivo oligodendrócitos 15. Além disso, a desregulação da atividade da microglia em GLD tem sido considerado um factor limitando a sua eficácia a longo prazo da terapia de células estaminais hematopeotic para tratar esta doença 16. Assim, investigando as funções celulares e regulação da microglia e células Globóides, em resposta a psicosina deverá fornecer novos insights na patogênese da GLD. Até recentemente, a falta de um modelo adequado para estudar a formação de células globoso limitou a compreensão da função e contribuição exacta destas células para a patologia de GLD. Em estudos recentes, foi determinado que as células-Globóides como pode ser formado em resposta directa a Psicosina, uma toxina lípido patogénico que se acumula em GLD. Descobrimos que a microglia, mas não macrófagos, são activadas e transformado em células Globóides em culturas gliais primários, em resposta a Psicosina 15. Esta transformação em células Globóides foi encontrado para ser mediada pela protease extracelular, as metaloproteinases de matriz (MMP) -3 15. Mais recentemente,estenderam estas conclusões e determinou que microglia e Globóides células ativadas por psicosina desenvolvidos neste sistema in vitro modelo são potencialmente tóxicos para os oligodendrócitos e as células progenitoras de oligodendrócitos. Assim, quando considerado no contexto de GLD, a acumulação inicial de psicosina e formação de células Globóides anteriores à desmielinização apoiam um papel patogénico primário e eventualmente em microglias emergente para esta doença. Propomos que o estudo da formação de células Globóides irá revelar novas informações sobre a patogenia da GLD que irá contribuir para a nossa compreensão da doença. Além disso, esse novo modelo de celular da GLD pode fornecer um novo formato a partir do qual novas abordagens terapêuticas para lidar com alterações patológicas esta doença poderia ser testada. Assim, neste relatório nós fornecemos um protocolo detalhado para o desenvolvimento in vitro de células Globóides induzida por psicosina de culturas primárias de células da glia não myelinating.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="884">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:500px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td style="width:297px;">Life technologies</td>
			<td style="width:87px;">14175-095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-092-628</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 uM cell-strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15070-063</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25299-056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Psychosine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9256</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19208</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PCN5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iba-1</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>019-19741</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor conjugated antisera</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Various</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Media</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>OB100-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phagocytic Assay Kit</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>500290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BP310-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for the study of cellular pathophysiology in globoid cell leukodystrophy

A função precisa da microglia multi-nucleadas, chamados de células Globóides, que são excepcionalmente abundantes no sistema nervoso central de leucodistrofia celular globoso (GLD) é incerto. Esta lacuna no conhecimento tem sido dificultada pela falta de um adequado modelo in vitro para o estudo. Relata-se um sistema de cultura glial murino primário em que o tratamento com resultados psicosina em multinucleações de microglia semelhantes às células Globóides características encontradas em GLD. Usando este novo sistema, que definiu as condições e modos de análise para o estudo de células Globóides. O potencial de uso deste sistema modelo foi validado em nosso estudo anterior, que identificou um papel potencial para metaloproteinases da matriz (MMP) -3 em GLD. Este novo sistema in vitro pode ser um modelo útil para estudar a formação e função, mas também a manipulação terapêutica potencial, destas células únicas.

Este protocolo, como está escrito, deverá ter cerca de 36 dias para ser concluído do início ao fim (veja a Figura 1: Esquema de Fluxo de Trabalho Experimental). Tem sido nossa experiência que o desenvolvimento de células &quot;Globóides-like &#39;neste sistema de cultura primária é confiável e reprodutível: a formação de células multinucleadas em resposta a psicosina é observado de forma consistente com 7 dias de tratamento. Coloração imunocitoquímica de mi...

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An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

7.8K visualizações.  University of Connecticut Health Center. Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells. 

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An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Nervo Óptico um modelo murino de lesão por esmagamento Estudo de Sobrevivência de células da retina Gânglio

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Neurociência

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

Geração de uma Murine Cérebro Imortalizado linha celular endotelial microvascular como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sangue Cérebro Modelo Barreira

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

O Sistema Olfativo como um modelo para estudar os padrões de crescimento axonal e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Dorsal Root Ganglia neurônios e células-tronco diferenciadas adiposo-derivados: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultura modelo para estudar a regeneração do nervo periférico

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In Vitro Modelagem de Cancerous Neural Invasion: o gânglio Modelo de raiz dorsal

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up para a investigação detalhada da Relação Neuron-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

In vivo Imagem de Tecido Cerebral Totalmente Ativo em Larvas de Zebrafish Acordados e Juvenis por Remoção de Crânio e Pele

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...