Para começar, colha as sementes de plantas mutantes e X134 e deixe-as secar naturalmente à temperatura ambiente até que o teor de umidade atinja aproximadamente 13 a 15%Depois de ativar a máquina de descascar, introduza 10 g de grãos de arroz no comedouro para remover com eficiência a casca da gluma. Transfira as sementes de arroz descascadas para o moinho de arroz e opere a máquina por 60 segundos para eliminar a camada de aleurona que produz arroz polido. Em seguida, coloque o arroz polido no moedor de tecidos.
Ajuste a frequência de moagem para 60 Hz e opere o moedor por 15 segundos por dois ciclos para produzir pó de arroz. Deposite o pó de arroz moído em uma placa de Petri e leve ao forno pré-aquecido a 37 C por 12 horas. Em seguida, adicione 100 mg de pó de arroz em um tubo de microcentrífuga de 2 mL e bata suavemente no tubo.
Adicione 180 L de água purificada ao tubo e ferva a amostra em banho-maria por 20 minutos. Depois que a amostra esfriar, introduza 4 mL de AMG contendo alfa-amilase pancreática no tubo. Em seguida, misture o conteúdo em um oscilador de vórtice e incube o tubo a 37 C por 16 horas com agitação contínua.
Agora, adicione 4 mL de etanol e misture a amostra usando um vórtice. Em seguida, centrifugue o tubo a 1 500 g durante 10 minutos. Após a decantação do sobrenadante, adicione 2 mL de etanol a 50%, seguido de 6 mL de 50% IMS ao tubo e misture.
Depois de centrifugar o tubo, despeje cuidadosamente o sobrenadante e inverta o tubo para drenar o excesso de líquido. Colocando o tubo em um banho de gelo, adicione 2 mL de hidróxido de potássio 2 molar e mexa a amostra por 20 minutos para ressuspender o rebanho e dissolver o amido resistente. Adicione 8 mL de tampão de acetato de sódio 1,2 molar ajustado para pH 3,8 ao tubo e misture usando um agitador magnético.
Em seguida, introduza imediatamente 0,1 mL de AMG na mistura e misture bem. Incubar a amostra durante 30 minutos a 50 °C em banho-maria com mistura intermitente utilizando um vórtice. Após a incubação, centrifugar o tubo a 1 500 g durante 10 minutos.
Agora transfira 0,1 mL do sobrenadante para um tubo de vidro novo. Adicione 3 mL de reagente de glicose oxidase peroxidase e incube a amostra a 50 C por 20 minutos. Pipete cuidadosamente 200 L de cada solução de amostra em branco e solução padrão em uma placa de 96 poços.
Medir a absorvância de cada amostra a 510 nm em relação à solução em branco e calcular o teor de amido resistente utilizando a fórmula. Por fim, presenteie os participantes com 50 g de arroz preparado com 200 mL de água. Após a refeição, colete amostras de sangue venoso em vários momentos para realizar a análise da glicose no sangue.
O teor de amido resistente foi significativamente maior no mutante SBEIIb com 5,2% em comparação com o tipo selvagem. O consumo do arroz preparado levou a uma resposta glicêmica mais lenta e reduzida aos 15 e 30 minutos, com reduções de 9,7% e 3,7%, respectivamente.
