Esta investigação é apoiada pela Fundação Nacional de Pesquisa e Ministério da Educação Singapura no âmbito do seu Centro de Pesquisa do Programa de Excelência, as ajudas à instalação (M4330002.C70) da Universidade Tecnológica de Nanyang, e ACRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) do Ministério da Educação, Cingapura. Os autores agradecem Joey Yam Kuok Hoong para participar na manifestação deste protocolo.

1. biofilme Cultivo <ol><li> Preparação de Estirpes Bacterianas <ol><li> 1 dia antes do cultivo biofilme, preparar culturas de bactérias planctónicas inoculando 2 ml de meio de crescimento adequado a partir da cultura bacteriana congelado. Use meio de Luria-Caldo (10 g L -1 de NaCl, 10 g L -1 extrato de levedura e 10 g L -1 triptona) para mucoid P. aeruginosa e as suas pel Δ e Δ psl mutantes defeituosos. Incubar durante a noite a 200 rpm agitação condições 37 ° C e. Dilui-se as culturas durante a noite para uma DO 600 de 0,40 usando um espectrofotómetro. </li><li> Montar configuração da célula de fluxo, o que tem sido descrito anteriormente 14, de preferência em uma estação móvel ou carro que pode ser levado para a sala de microscópio para imagiologia da célula de fluxo, sem desmontagem. </li><li> Prepare meio de crescimento estéril em 2 L ou L 5 frascos para cada célula de fluxo. Use meio mínimo M9 (48 mM de Na 2 HPO 4, 22 mMKH 2 PO 4, 19 mM de NH4CI, NaCl 9 mM, 2 mM de MgSO4, e 0,1 mM de CaCl2) suplementado com 0,04% de glucose (p / v) e 0,2% (peso / vol) de casaminoácidos) para P. aeruginosa fluir biofilmes celulares. </li><li> Aliquota microesferas fluorescentes em tubos de microcentrífuga e girar para baixo em H 2 O esterilizada durante 5 min numa centrífuga a 9,391.2 g. Remover o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de meio de crescimento para remover azida de sódio (desinfectante) antes da adição ao meio de crescimento em G 2 ou 5 frascos de meio L. NOTA: Os tamanhos diferentes de microesferas vir em diferentes concentrações e deve ser diluída de acordo com as instruções. Por exemplo, dispersar 120 ul de microesferas de 1,0 um de diâmetro, 15 ul de microesferas de 0,5 um de diâmetro e 0,96 ul de microesferas de 0,2 um de diâmetro em 2 L de meio de crescimento para dar 2,18 x 10 6 ml -1 microesferas para cada tamanho de partícula. </li><li> Anexar meio garrafa para upstresma de célula de fluxo e permitir que o meio de crescimento a fluir através de instalação inteira. Pare o fluxo e injectar culturas durante a noite diluídas em câmaras de célula de fluxo. Permitir que as bactérias para anexar o substrato lamela durante 1 h antes de continuar o fluxo de meio de crescimento a uma taxa de fluxo de cerca de 5,5 x 10 -3 m s-1, ou 8 rpm com uma bomba peristáltica. NOTA: Os biofilmes são normalmente cultivadas à temperatura ambiente (25 ° C) durante 3-7 dias. </li><li> Alternativamente, para a configuração cultura estática, dilui-se culturas de uma noite de 100 vezes em tubos de microcentrífuga adicionando 10 ul de cultura durante a noite a 1 ml de meio de crescimento com partículas. Aumentar a concentração de partículas no meio de crescimento para cultura estática de cerca de 500 vezes em comparação com a utilizada para biofilmes de fluxo (por exemplo, lavar e ressuspender 600 ul de 1,0 uM esferas de diâmetro em 10 ml de meio de crescimento) como biofilmes de células de fluxo estão constantemente reabastecido com partículas, mas as culturas não são estáticas. <ol><li> Adicionar 2001; l de cultura durante a noite diluiu-se com partículas para as câmaras de 8 lâminas bem. Incubar a 37 ° C em condições estáticas. Os biofilmes são normalmente cultivadas para 1 dia. Substitua meio de crescimento gasto diário com meio de crescimento fresco com partículas se biofilme é cultivado por mais de 1 dia. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Microscopia <ol><li> No dia 3 e 5, desligue o fluxo de bomba peristáltica e trazer configuração de célula de fluxo para a sala de microscopia. Tubulação braçadeira perto da entrada e saída das câmaras de célula de fluxo para evitar a deriva (a causa do erro sistemático por mudanças no ambiente de fluxo). Coloque a célula de fluxo para o estágio de microscópio de um microscópio vertical. NOTA: Use um microscópio invertido para a imagem latente de micropoços. </li><li> Use microscopia fluorescente com 40X objetivo óleo para gravar vídeos de microesfera de movimento embutidos no biofilme em vários locais (microcolônias e camadas indiferenciadas plana) e em diferentes dias (dia 3 e 5) parainvestigações temporais e espaciais. Gravar vídeos curtos com maior taxa de quadros para investigar os eventos que ocorrem dentro de escalas de tempo curto (por exemplo, 1,5-3 mínimo de vídeos na taxa de quadros de 25-50 frames por segundo para uma dinâmica rápida), e mais vídeos com menor taxa de quadros para investigar eventos durante mais tempo escalas (por exemplo, 15-30 mínimo de vídeos na taxa de quadros de 2,5-5 frames / seg para uma dinâmica mais lentas). NOTA: Um vídeo normalmente contém partículas de 5-10, e é tipicamente de 1,0-2,5 GB no tamanho do arquivo. Microcolônias maiores podem conter mais partículas. Leve 5-10 vídeos para cada categoria (por exemplo, 10/05 vídeos de diferentes microcolônias e de diferentes locais em camadas planas indiferenciados). O biofilme tem uma arquitectura heterogénea que pode consistir de microcolónias, canais, cavidades e indiferenciadas camadas planas. </li><li> Salvar vídeos em formato apropriado que podem ser lidos por Fiji / ImageJ (por exemplo CZI, tif). </li><li> Confira vídeos de tração, percorrendo vid acabadoEO e observando-se que as partículas não se movem na mesma direcção simultaneamente. A deriva pode ser causado pelo movimento Z-fase, as correntes na célula de fluxo, o desequilíbrio de mesa anti-vibração, pressão de ar ou mudanças de temperatura. Menor correta deriva usando técnicas de pós-processamento normalmente fornecidos com o software de microscópio. Descartar nenhum vídeo em que deriva não podem ser corrigidos. Grave os seguintes parâmetros, que são necessários durante Particle Analysis Tracking: resolução (px / um), número de quadros, Duração. </li><li> Remover célula de fluxo de platina do microscópio e reiniciar a bomba peristáltica continuar a cultivar o biofilme. </li></ol> 3. Análise de Rastreamento de Partículas <ol><li> Obter trajetórias de partículas que usam o plug-in Trackmate em software de fonte aberta (ImageJ). Baixe Fiji em <a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji.</a> Abra o vídeo com Fiji e no menu Plugins, selecione Rastreamento e Trackmate. </li><li> Verifique ou ajustar as definições em the janela sugerindo ajustes de calibração iniciais para combinar os parâmetros de vídeo como registrado no passo 2.4. </li><li> Detectar partículas no Trackmate usando ImageJ. <ol><li> Selecione &#39;detector Log&#39;, diâmetro das partículas de entrada e valor limite (por exemplo, 1000). Percorra o vídeo enquanto clicando no botão &#39;Preview&#39; para verificar se os círculos roxos siga as partículas ao longo do vídeo. Ajuste os valores de diâmetro e de limite, conforme necessário: aumentar o valor limite se círculos roxos aparecer no espaço vazio. Reduzir o valor limite se forem detectadas partículas não o suficiente. Clique no botão ao lado para completar a detecção de partículas. </li><li> Clique no botão ao lado quando apresentado com a opção de adicionar ou remover as partículas detectadas no &#39;limiar Inicial&#39;, &#39;Selecione uma exibição&#39; e &#39;Selecione um filtro&#39; janelas para continuar sem ajuste se a detecção de partículas inicial foi satisfatório. </li><li> Selecione &#39;rastreador simples LAP&#39; na optina barra de &#39;Selecione um método rastreador &quot;janela como partículas raramente mover fora de foco no biofilme e são facilmente controladas. Use os valores max distância ligando sugerido ou baixo e abertura-fechamento, e clique em Avançar. </li><li> Verifique se rastreamento de partículas é satisfatória, percorrendo o vídeo para ver que as partículas de seguir as trilhas traçadas por Trackmate, e que não existem faixas indesejadas ou ausentes. Ir as várias etapas de filtragem. Ir para a última janela &quot;Selecione uma ação &#39;. Selecione &#39;faixas de exportação para arquivo xml&#39; a partir do menu drop-down e clique em &quot;Executar&quot;. Escolha uma pasta para salvar as faixas. NOTA: Existem vários programas disponíveis no domínio público para a análise de trajetórias de partículas e uso de microrheology. msdanalyzer e TrackArt são exemplos de programas de análise de rastreamento de partículas que são executados no ambiente Matlab. </li></ol></li><li> Prepare Matlab para importar as trajetórias de partículas nos arquivos XML, selecionando no menu deArquivo Matlab&gt; Set Path ... e adicione a pasta disponíveis os scripts com o pacote de Fiji. </li><li> Para analisar as trajetórias de partículas com msdanalyzer, baixar o link para o arquivo zip ou o arquivo tar.gz at <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories</a> . <ol><li> Extraia a pastamsdanalyzer 15 e soltá-lo em uma pasta que pertence ao caminho Matlab (por exemplo C: Documents and Settings &lt;usuário&gt; Meus Documentos Matlab). Comece Matlab e iniciar o analisador de digitação: ma = msdanalyzer (2, &#39;um&#39;, &#39;s&#39;) onde hum e sec são as unidades de tempo e espaço físicos no vídeo. <ol><li> Importe as trajetórias de partículas, digitando: [faixas, md] = importTrackMateTracks (&#39;FileName.xml&#39;, &#39;Clipz&#39;;, &#39;Scalet&#39;) ma = ma.addAll (faixas); onde &#39;Clipz&#39; remove a dimensão z para um vídeo 2D, e &#39;Scalet&#39;. </li><li> Traçar as trajetórias Onto gráfico usando: ma.plotTracks; ma.labelPlotTracks; </li><li> Calcule os LME das partículas usando: ma = ma.computeMSD; ma.msd </li><li> Traçar as perturbações músculo-esqueléticas de cada partícula: figura ma.plotMSD </li><li> Combinar trajetórias de partículas de outros vídeos do mesmo categery (por exemplo, partículas incorporadas no tipo selvagem microcolônias no dia 3), repetindo 3.5.1.1 a 3.5.1.4). </li><li> Traçar o conjunto médio ou a média sobre todas as curvas: ma.plotMeanMSD Alterar o Y e eixo-x de linear para escala logarítmica. Às vezes longas lag, as curvas MSD tornar-se barulhento devido a estatísticas insuficientes em prazos mais longos. As curvas MSD também pode subir abruptamente devido a erro dinâmico. Estas regiões da curva pode ser removida usando a ferramenta pincelpara selecionar o final da curva e da selecção de &quot;Escovar &#39;&gt;&#39; Remover unbrushed &#39;no menu Ferramentas. </li></ol></li><li> Baixe Ezyfit em <a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a> e adicionar Ezyfit para uma pasta pertencente ao caminho Matlab (por exemplo C: Documents and Settings &lt;usuário&gt; Meus Documentos Matlab). Instale o menu Ezyfit digitando em Matlab espaço de trabalho efmenu instalar. Reinicie MATLAB com cardápio Ezyfit na janela de figura. Ajustar as curvas MSD para a lei de potência, selecionando no menu Ezyfit &#39;Show Fit&#39;&gt; &#39;Power&#39;&gt; &#39;a * x ^ n&#39; eram n é o expoente α diffusive estimado. NOTA: msdanalyzer requer o ajuste de curva Toolbox em Matlab para ajuste de curvas de MSD. Ezyfit é uma alternativa e software livre que pode executar ajuste de curva. </li><li> Limpar trajetórias de partículas atuais e LME para calcular os novos LME partículas em outros locais ou tempo: Claro </li&gt; <li> Após o cálculo de várias curvas médias MSD de partículas no meio (controle), e microcolônias e áreas indiferenciadas de diversas estirpes, copie e cole as curvas em um gráfico para comparação. Rigidez da amostra e reticulação aumento com valores mais baixos MSD. Curvas planas têm α inferiores e amostra é mais elástica do que curvas mais íngremes com maior α. </li><li> Selecione a curva e vá em &quot;Ferramentas&quot; olhar para as estatísticas de dados, como a mediana e intervalo. A MSD da pérola é proporcional à fluência conformidade, J (t) do material em que o grânulo é incorporado de acordo com a relação, <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" /> onde J = conformidade fluência, d = diâmetro da partícula, B k = constante de Boltzmann, T = temperatura e t = tempo. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Microrheology é uma ferramenta útil para medições reológicas locais em sistemas heterogêneos, como biofilmes microbianos. É uma técnica não destrutiva, o que permite o acompanhamento em tempo real das modificações reológicas dentro da mesma amostra biológica sobre vários pontos de tempo. Neste protocolo, de rastreamento de partículas microrheology foi aplicada a Pel e mutantes de exopolissacarídeo Psl a fim de investigar como eles afetam a elasticidade e reticulação eficaz da matriz do biofilme. Psl fa...

A maioria das células bacterianas são capazes de empregar tanto planctônicas (de vida livre) e (sésseis) modos ligado à superfície de crescimento 1. No modo ligado à superfície de crescimento, as células bacterianas e secretar encerrar-se em grandes quantidades de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) para formar biofilmes. O EPS é constituído principalmente por proteínas, exopolissacarídeo, ADN extracelular e é essencial para a formação de biofilme 2. Ele serve como um andaime física através da qual as bactérias podem ser utilizadas para diferenciar espacialmente e protege as bactérias de condições ambientais prejudiciais e as respostas do hospedeiro. Diferentes componentes de EPS têm papéis distintos na formação de biofilme 3 e alterações na expressão de componentes EPS pode remodelar drasticamente estruturas biofilme 4. Componentes EPS também pode funcionar como moléculas sinalizadoras 5, e estudos recentes tem mostrado certos componentes EPS interagindo com células microbianas para orientar suas migração e biofilme differentiation 6-8. A investigação sobre o EPS tem muito avançado com base nas análises morfológicas dos biofilmes produzidos por mutantes defeituosos em um componente específico do EPS 9,10. Além disso, o EPS é geralmente caracterizado na macro-escala (caracterização granel) 11. Morfológica analisa no entanto pode faltar detalhe caracterização quantitativa e grandes quantidades, o que devolve valores médios, perde o detalhe de que existe dentro da heterogeneidade do biofilme. Existe agora uma tendência crescente para avançar para caracterização em tempo real das propriedades mecânicas do EPS no micro-escala. Este protocolo demonstra como partícula-tracking microrheology é capaz de determinar os efeitos espaço-temporais de componentes da matriz Pel e exopolissacarídeos Psl sobre a viscoelasticidade e eficaz de reticulação de Pseudomonas aeruginosa 4 biofilmes. Microrheology passivo é um rh simples e baratoeology método que fornece a maior velocidade de amostragem microrheological espacial de um material à data 12,13. Em microrheology passiva, esferas de sondas são colocados na amostra e o seu movimento Browniano, impulsionado por energias térmica (K) B T é seguido por microscopia de vídeo. Diversas partículas podem ser monitoradas simultaneamente, e as coordenadas dependentes do tempo das partículas seguem um passeio aleatório convencional. Portanto, em média, as partículas permanecem na mesma posição. No entanto, o desvio padrão dos deslocamentos ou o deslocamento quadrático médio (MSD) das partículas, não é zero. Uma vez que o fluxo de fluidos viscosos, a partícula MSD num fluido viscoso cresce linearmente à medida que o tempo avança. Em contraste, a ligação cruzada polimérico encontrado em viscoelástico ou substâncias elásticas para ajudar a resistir a fluir, e as partículas tornam-se limitada no seu deslocamento, levando a planaltos na curva MSD (Figura 1A). Esta observação segue a relação MSDαt <saté&gt; α, onde α é o expoente difusivo que está relacionada proporção de contribuições elásticas e viscosas da substância. Para as partículas que se deslocam em fluidos viscosos a = 1, em substâncias viscoelásticas 0 &lt;α &lt;1, e em substâncias elásticas α = 0. A MSD também pode ser utilizado para calcular a conformidade fluência, que é a tendência do material para deformar permanentemente sobre tempo e estima quão facilmente um spread materiais. O tamanho, densidade e química da superfície da partícula são importantes para a aplicação correcta do experimento microrheological e são escolhidos com respeito ao sistema estudado (neste caso, os polímeros da matriz do biofilme, ver Figura 1B). Em primeiro lugar, a partícula mede a reologia da substância com as estruturas que são muito menores do que a própria partícula. Se as estruturas da substância são de dimensão semelhante à das partículas, o movimento do partigo é perturbado pela forma e orientação das estruturas individuais. No entanto, se as estruturas circundantes da partícula são muito menores, este efeito é pequena e média para fora, apresentando um ambiente homogéneo para a partícula (Figura 1B). Em segundo lugar, a densidade das partículas deve ser semelhante ao meio (1,05 g ml -1 de meios à base de água) de tal modo que a sedimentação é evitada e as forças de inércia são insignificantes. A maioria das partículas de poliestireno com treliças cumpram os critérios acima. Idealmente, a partícula não interage com os polímeros da matriz do biofilme como a interpretação reológico de partícula MSD só é válida se o movimento é aleatório, conduzido por energia térmica e de colisão com estruturas de substância. Isto pode ser observado através da verificação se a sonda de partículas tende a ligar-se ou saltar para fora da superfície de um biofilme de pré-adulto. No entanto, apesar da falta de atracção para o biofilme, as partículas devem ser capazes de ser incorporados na matriz.Além disso, a heterogeneidade físico-químicas do biofilme pode resultar em diferentes partículas sendo mais apropriados como sondas em diferentes regiões do biofilme. Assim, as partículas de diferentes tamanhos e química de superfície deve ser aplicado para o biofilme. Como tal, a partícula MSD é capaz de fornecer informações úteis sobre como os diferentes componentes contribuem para a reologia e divulgação do biofilme. Além disso, a utilização de diferentes sondas permite a obtenção de informação sobre a heterogeneidade espacial físico-química do biofilme. Este método pode ser utilizado para testar o efeito do tratamento antimicrobiano sobre as propriedades mecânicas do biofilme, ou aplicado a biofilmes espécies mistas para investigar como as propriedades mecânicas do biofilme são alteradas de introdução de uma outra espécie. Partículas perturbações músculo-esqueléticas pode também ser útil para caracterizar a dispersão do biofilme. Tais estudos seriam úteis em nosso entendimento de biofilmes, melhorando potencialmente tratamentos biofilme umnd engenharia de biofilmes para atividades úteis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-8821</td>
			<td>1.0 um red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive 07523-80</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07523-80</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell Chambers</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear polypropylene plastic connectors&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06365-83</td>
			<td>1/16 in. (1.588 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder Clips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To clamp tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td colspan="2">Thermo Scientific&#8482; Nunc&#8482;</td>
			<td>50 x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 3 mL</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L Storage/Media Bottles</td>
			<td>VWR&#174;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolley</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To hold biofilm setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ mapping of the mechanical properties of biofilms by particle-tracking microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

As propriedades viscoelásticas locais do biofilme em diferentes regiões do biofilme, que inclui os espaços vazios (médias acima do biofilme), planícies (camada plana de células indiferenciadas) e microcolônias (ver etiquetas na Figura 2A) foram investigados. As alterações temporais em propriedades viscoelásticas do biofilme durante a maturação dos dias 3 a 5 também foram determinadas. A MSD das partículas em espaços vazios foi usada como um controlo e comparável ao MSD de partículas em ...

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In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

9.6K visualizações.  Nanyang Technological University. Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparamétrico Mapping Optical do Coração Coelho Langendorff-perfundidos

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Bioengenharia

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantificar as propriedades mecânicas do Glicocálix endotelial com Microscopia de Força Atômica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in these structures are held together by physical interactions mediated by a network of extracellular polymeric substances. Bacterial biofilms impact many human activities and the understanding of their properties is crucial for a better control of their development &#8212; maintenance or eradication &#8212; depending on their adverse or beneficial outcome. This paper describes a novel methodology aiming to measure in situ the local physical properties of the biofilm that had been, until now, examined only from a macroscopic and homogeneous material perspective. The experiment described here&#160;involves introducing magnetic particles into a growing biofilm to seed local probes that can be remotely actuated without disturbing the structural properties of the biofilm. Dedicated magnetic tweezers were developed to exert a defined force on each particle embedded in the biofilm. The setup is mounted on the stage of a microscope to enable the&#160;recording of time-lapse images of the particle-pulling period. The particle trajectories are then extracted from the pulling sequence and the local viscoelastic parameters are derived from each particle displacement curve, thereby providing the 3D-spatial distribution of the parameters. Gaining insights into the biofilm mechanical profile is essential from an engineer&#39;s point of view for biofilm control purposes but also from a fundamental perspective to clarify the relationship between the architectural properties and the specific biology of these structures.

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

This paper shows an original methodology based on the remote actuation of magnetic particles seeded in a bacterial biofilm and the development of dedicated magnetic tweezers to measure in situ the local mechanical properties of the complex living material built by micro-organisms at interfaces.

Atuação Remoto magnética de micrométricas para Sondas<em&gt; In situ</em&gt; Mapping 3D de bactérias biofilme Propriedades Físicas

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Investigando a separação de fluxo tridimensional induzida por um polip de dobra vocal modelo

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Medição Longitudinal de Matriz Extracelular Rigidez em 3D tumorais modelos com o uso de rastreamento de partículas Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Cultura Órgão da Murino Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Um milímetro escala Flexural sistema de testes para medir as propriedades mecânicas de espículas de esponja marinha

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Um protocolo para rastreamento em tempo real 3D única partícula

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...