O método de gravação óptica com corante sensível à tensão é considerado uma tecnologia ideal para visualizar como o cérebro funciona. Este método nos permitiu registrar uma dinâmica neuropsíquica de forma estável e confiável ao longo de 12 horas, nos dado uma visão sobre a atividade psíquica. Estamos tentando expandir a aplicação para detectar alterações de circuito causadas por produtos químicos em todo o estágio de desenvolvimento, como a valiosa aplicação de ácido às mães.
A técnica já está bem estabelecida. Por favor, tente reproduzir estudos seguindo o método aqui apresentado. Para iniciar este procedimento, mergulhe a cabeça decapitada em ACSF gelado em uma bandeja cirúrgica de aço inoxidável.
Extrair o cérebro dentro de um minuto e colocá-lo em um béquer contendo ACSF refrigerado por cinco minutos. Em seguida, divida a seção cerebral na linha média com um bisturi e coloque ambos os hemisférios em um bloco de 4% de ágar. Em seguida, coloque o bloco cerebral com ambos os hemisférios em um bloco de 4% de ágar.
Limpe o excesso de ACSF do bloco com um papel filtro. Posteriormente, aplique supercola na plataforma vibratome. Coloque o bloco de ágar sobre ele e limpe o adesivo excessivo com um papel filtro.
Aplique suavemente uma pequena quantidade de ACSF gelado do topo do bloco de ágar cerebral para ajudar a solidificar o excesso de supercola e evitar que a cola cubra o cérebro e perturpe o fatiamento. Depois, fixe a plataforma na bandeja vibratome e despeje o ACSF modificado. Ajuste o vibratome a uma velocidade lenta e tenha a frequência da lâmina em sua configuração máxima.
Então comece a cortar. Coloque as fatias no canto da câmara de fatia em sequência para que a ordem das fatias possa ser facilmente distinguida. Normalmente, três a cinco fatias podem ser obtidas de um hemisfério.
Em seguida, corte a porção do tronco cerebral usando uma agulha calibre 30. Usando uma pequena escova de tinta com ponta, coloque a fatia no filtro de membrana segurado com um anel de plexiglass. Coloque o anel em uma câmara de recuperação úmida e fixe a tampa para manter a pressão interna alta.
Ao colocar a fatia no filtro de membrana, ajuste a direção e a posição da fatia dentro do anel para garantir que ela esteja bem centrada e tenha uma direção consistente. Deixe o espécime a 28 graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, em temperatura ambiente por pelo menos 10 a 30 minutos para recuperação. Para colorir as fatias, aplique suavemente 100 microliters da solução de coloração em cada fatia e incubar a 20 minutos para temperatura ambiente.
Em seguida, prepare 50 a 100 mililitros de ACSF em um recipiente. Coloque o anel com o espécime nele para enxaguar a solução de coloração. Em seguida, transfira as fatias enxaguadas para outra câmara de incubação.
Espere mais de uma hora para a recuperação antes do experimento. Para iniciar este procedimento, ligue o amplificador, o computador e o sistema de câmera e abra o software. Despeje ACSF em um tubo de 50 mililitros e borbulhe-o com carbogen.
Use uma bomba peristáltica para circular o ACSF e ajustar a vazão para aproximadamente um mililitro por minuto. Em seguida, ajuste a altura da pipeta de sucção para que o nível líquido dentro da câmara de experimento seja sempre constante. Coloque o eletrodo de chão na câmara.
Posteriormente, encha o eletrodo de vidro com uma pequena quantidade de ACSF e coloque-o no suporte de eletrodos. Coloque o suporte na haste do manipulador. Usando um amplificador, certifique-se de que a resistência ao eletrodo é aproximadamente um megaohm.
Na sessão de gravação, transfira uma fatia da câmara úmida para uma câmara experimental. Pressione a borda do anel firmemente no o-anel de silicone. Tenha cuidado para não quebrar a membrana ou a parte inferior da câmara de experimento.
Sob o microscópio coloque a ponta do eletrodo estimulante e o potencial de campo de gravação do eletrodo na fatia. Verifique a resposta evocada fornecendo um estímulo. Confirme que o campo de visão cobre o circuito neural certo no sistema de gravação óptica.
Em seguida, ajuste a intensidade da luz de excitação para aproximadamente 70 a 80% da capacidade máxima da câmera. Usando a fonte de luz fluorescente, ajuste o foco com o sistema de aquisição. Em seguida, inicie a gravação e analise os dados em um software de aquisição de imagens após a aquisição.
Esta figura mostra o sinal óptico representativo sobre a estimulação elétrica do collaterol Schaffer na área CA1 de uma fatia hipocampal de rato. Estas imagens consecutivas mostram o sinal óptico antes de qualquer filtro espacial e temporal ser aplicado enquanto essas imagens mostram os mesmos dados depois de aplicar um filtro cúbico de cinco por cinco por cinco duas vezes. Devido à alta taxa de quadros e alta resolução espacial, a aplicação do filtro não alterou o sinal, mas filtrava o ruído que também pode ser observado no curso de tempo registrado em pixels em um único ensaio.
Aqui está a comparação das respostas típicas na área CA1 das fatias hipocampais entre rato e rato. A pequena resposta hiperpolarizadora é observada no lado distal do CA1 após 24 milissegundos na fatia hipocampal do rato, mas uma resposta hiperpolarizadora mais maciça ultrapassou a resposta despolarizante na fatia hipocampal de rato. Uma vez que as fatias estão manchadas, elas devem durar mais de 12 horas e você pode realizar outras gravações eletrofisiológicas nelas.
