Financiado pelo NINDS, American Heart Association, American Federation for Aging Research, March of Dimes

1. Preparação Antes de começar, montar os instrumentos necessários cirúrgica, dissecção e meios de cultura, e sete dias de ratos velhos ou filhotes de rato. O protocolo é o mesmo para mouse e preparações de ratos. (I) Os materiais e equipamentos <ul><li> Tesoura operacional (comprimento em linha reta 6 &quot;, cat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Micro dissecando tesoura, (comprimento 4 &#39;&quot;, cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Aço Carbono Dumont Pinças (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Vidro modificado &quot;transferência&quot; pipetas (parte inferior da pipeta Pasteur removido e suavizada pela borda) </li><li> Aclar filme plástico cortadas a 2 &quot;em x 2&quot; em praças (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA) </li><li> Cobrir esponjas 4 em por 3 in (Kendall, cat # 3157, Mansfield, MA) </li><li> 30 milímetros Millicell insere membrana (0,4 mm; Millipore, Bedford, MA) </li><li> Mcllwain helicóptero Tecido com dois gumes lâmina de barbear (McIlwain helicóptero tecido, empresa Vibratome, St. Louis, MO) </li><li> Microscópio invertido com CCD da câmera e software de análise de imagem </li></ul> (Ii) Média Dissecação (DM; 1 litro em pH 7,3) <table border="0"><tbody><tr><td> Salina balanceada de Hank </td><td> 1 frasco (95,2 g/1L) (Sigma: H2387) </td></tr><tr><td> NHCO 3 (4,2 mM) </td><td> 350 mg </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 2,83 g </td></tr><tr><td> Glicose (33,3 mM) </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Penicilina estreptomicina / (100x) </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> BSA (0,3%) </td><td> 300 mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 O </td><td> 1,44 g </td></tr></tbody></table> (Iii) meio de cultura (400 mL) <table border="0"><tbody><tr><td> MEM (Invitrogen 11575-032) </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> *** Sal Balanço de Hank (Invitrogen 24020-117) </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> Soro de cavalo (Invitrogen 26050-070) </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> HEPES buffer (1 M; Invitrogen 15630-080) </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> Penicilina estreptomicina / (100x) </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td colspan="2"> *** Adicionar 12,8 g de glicose para Salt 500 mL de Hank Balance antes de fazer meio de cultura </td></tr></tbody></table> (Iv) Animais 7 dias de idade ou filhotes de ratos rato pós-parto, geralmente uma ninhada por experimento. 2. No Dia da Cultura <ol><li> Todas as ferramentas de dissecação e Aclar filme deve ser embebido em álcool etílico 70% por 30 minutos antes de começar. A superfície do capô, a dissecção da lâmina, e helicóptero tecido deve ser desinfetado com etanol. </li><li> Prepare vários (3-4) 6 placas de cultura de tecidos bem, adicione um meio de cultura mL por poço, e inserir uma membrana Millipore permeáveis ​​em cada poço. Coloque 6-bem placas no 37 ° incubadora até que esteja pronto para transferir fatias. </li><li> Prepare vários (4-6) 60 mm com placas DM e colocar no gelo. </li><li> Rapidamente decapitar com uma tesoura e mergulhe em 70% o álcool etílico, e rapidamente expor o cérebro com uma incisão sagital do crânio. Remova cuidadosamente o cérebro e coloque imediatamente em DM frio. Separá-lo em dois hemisférios e coloque cada lado medial do hemisfério para baixo em uma esponja de cobertura para 2-3 segundos. </li><li> Levantar delicadamente e coloque o hemisfério para a praça Aclar filme e coloque no helicóptero tecidos; corte coronal do cérebro em 350 seções mM. Quando terminar, retire com cuidado a praça Alcar com o hemisfério seccionados e submergir em DM frio. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, separar as seções do hipocampo. Para ratos, deve haver cinco seções que abrangem rostral hipocampo caudal, e para mouse deve haver seções 3-4. </li><li> Tirar as placas de 6 poços com inserções de membrana do 37 ° de cultura de tecidos incubadora. Transferência de fatias do hipocampo individualmente para a membranas permeáveis ​​usando a pipeta de transferência de vidro. Se demasiado DM é liberado para a membrana, remover o excesso de DM com uma pipeta Pasteur. Coloque cinco fatias do hipocampo em cada membrana. Permitir que pelo menos três poços por condição, ou 15 fatias. </li><li> Incubar as placas de cultura a 37 ° em 5% CO incubadora umidificada por 12-14 dias antes do início do experimento de toxicidade. O meio de cultura podem ser mudadas duas vezes por semana. </li></ol> 3. Induzir e quantificação lesão neuronal do hipocampo em Cultura Slice <ol><li> Depois de 12-14 dias em cultura, adicionar 5 mg / mL de iodeto de propídio (PI) para o meio de cultura. Esta etapa irá permitir a visualização e quantificação de morte celular basal. </li><li> No dia seguinte, quantificar PIfluorescência na sub-região CA1 (e / ou CA3 ou denteado se desejado) de cada fatia do hipocampo e obter média das medições de fluorescência PI representando a morte de células basais (referido como tempo = 0 horas, ou T 0). Para aquisição de imagem e quantificação, usamos OpenLab software (Improvisação, UK), mas a aquisição de imagens e outros softwares de análise podem ser usados ​​para quantificar a intensidade de fluorescência. </li><li> Imediatamente após a aquisição da imagem de T 0 PI fluorescência, induzir lesão neuronal pelo seu método de escolha (temos usado 10 mM NMDA, oxigênio glucose-privação, ou LPS para uma hora como indutores de toxicidade neuronal 2,5). Após o estímulo tóxicos, substituir média com meio fresco contendo 5 mg / mL PI e manter fatias durante a noite. </li><li> No dia 3, significa quantificar PI fluorescência da condição experimental em 24h, ou T 24. </li><li> Após esta aquisição de imagem, mudar imediatamente médio e adicionar 10 mM NMDA e 5 mg / mL PI e fatias de incubar durante a noite para atingir a morte neuronal máxima. </li><li> No dia 4, significa quantificar PI fluorescência da morte neuronal máxima, definida como T max. Calcular a morte celular por cento da seguinte forma: (T 24 - T 0) / (T max-T 0). </li></ol> 4. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2106/2106fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. (A) da linha de tempo para a geração de hipocampo e subsequente lesão experimental e de aquisição de imagem. (B) Imagens representativas de fatias do hipocampo basally (T 0), 24 horas após uma exposição de uma hora a 10 mM NMDA (T 24), e após mais 24 horas ou 10 mM NMDA para obter lesão neuronal máxima (T max).

<ol>
	<li>Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).</li><li>McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+Function+of+the+PGE2+EP2+Receptor+in+Cerebral+Ischemia.">Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia.</a> J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).</li><li>Czapiga, M., Colton, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+microglia+in+organotypic+slice+cultures.">Function of microglia in organotypic slice cultures.</a> J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).</li><li>Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+and+non-glutamate+receptor+mediated+toxicity+caused+by+oxygen+and+glucose+deprivation+in+organotypic+hippocampal+cultures.">Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures.</a> J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).</li><li>Wu, L., Wang, Q., Liang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+Effects+of+prostaglandin+recetor+signaling+on+neuronal+survival.">Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival.</a> Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).</li><li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+in+vitro:+Analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18, 319-319 (1996).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Existem dois pontos importantes a seguir para garantir resultados reprodutíveis e consistentes ao replicar as experiências. Primeiro, é importante deixar que a idade fatias do hipocampo por 12-14 dias antes da experimentação. Com isolamento fatia, há uma resposta significativa da microglia e microglia permanecerá ativado por algum tempo, com um retorno a um estado de repouso ramificada ocorrem de dia 10 in vitro 3,6. Em segundo lugar, com média de PI intensidade de fluorescência é proporcio...

the organotypic hippocampal slice culture model for examining neuronal injury

Cultura fatia organotípicas hipocampo é um método in vitro para analisar os mecanismos de lesão neuronal em que a arquitetura básica e composição do hipocampo é relativamente preservado 1. O sistema de cultura organotípicas permite o exame dos efeitos neuronal, astrocíticos e microglia, mas como uma preparação ex vivo, não aborda os efeitos do fluxo de sangue, ou recrutamento de células inflamatórias periféricas. Para o efeito, este método de cultura é freqüentemente utilizado para examinar lesão hipóxico excitotoxic e aos neurônios piramidais do hipocampo, mas também tem sido usado para examinar a resposta inflamatória. Aqui nós descrevemos os métodos para a geração de culturas fatia do hipocampo do cérebro do roedor pós-parto, administrar estímulos tóxicos para induzir a lesão neuronal, e assaying e quantificar a morte neuronal no hipocampo.

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The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

O modelo de cultura organoptypic hipocampo é uma fatia<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo usado para examinar lesão neuronal em uma variedade de paradigmas. Neste artigo, vamos descrever os métodos de geração de culturas fatia e quantificar lesão neuronal.

O modelo de Cultura organotípicas Hippocampal Slice para o exame das lesões neuronais

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

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19.0K visualizações.  Stanford University School of Medicine. O modelo de cultura organoptypic hipocampo é uma fatia In vitro Modelo usado para examinar lesão neuronal em uma variedade de paradigmas. Neste artigo, vamos descrever os métodos de geração de culturas fatia e quantificar lesão neuronal.