Gostaríamos de agradecer a Curt Mazer da Isis Pharmaceuticals para prestação de consultoria pertencente à cirurgia bolus ICV, bem como Isis Pharmaceuticals como um todo para o fornecimento de nosso laboratório com ASO. Além disso, gostaríamos de agradecer Carey Shaner pela revisão deste artigo. TMM e SLD são suportados pelo NIH concede P50AG005681, K08NS074194 e R01NS078398.

O protocolo a seguir foi aprovada pelo Animal Care Institucional e Comissões de Uso da Universidade de Washington em St. Louis e está em conformidade com os Institutos Nacionais de Saúde para o uso de animais de experimentação. Se esta é a sua primeira vez a realização de cirurgias, recomendamos olhando para o artigo Jove em cirurgias de roedores como uma introdução antes de começar a 14. ASO pode ser entregue para o SNC do rato, tanto através de infusão de bomba osmótica e uma única injecção de bolo ICV. Devido a isso, o processo detalhado a seguir é dividida em dois segmentos. Prós e contras de cada método será abordado na seção Discussão. As coordenadas utilizadas nos protocolos são para adultos C57BL6 e B6C3 camundongos. Coordenadas correspondentes de rato pode ser encontrada na Tabela 1. Bomba osmótica ALZET 1. Preparação de bombas osmóticas Alzet <ol><li> Estabelecer um Drap estérile e solte cuidadosamente os seguintes itens para ele, tendo o cuidado de não tocar nada diretamente, a fim de manter a esterilidade: bomba osmótica (s), o fluxo de modulador (s), 1 ml seringa estéril (s), lâmina de bisturi, e as seções de tubulação (um pedaço de tubo = 5 bombas). Para ratinhos, há três opções para as bombas de 14 dias, 28 dias, e 42 dias (Figura 2A). </li><li> Retire a tampa e preencha estéreis de 50 ml tubos cônicos com soro fisiológico 15-20 ml. Até 6 bombas montadas podem ser adicionados por tubo cónico. </li><li> Encher uma placa de Petri p60 com etanol 100%. Adicionar número apropriado de cateteres para o etanol. Para ratos, comprimento do cateter é de 2,5 mm. </li><li> Filtrar cada ASO em tantos tubos Eppendorf de 1,5 ml, tal como necessário. Incluir um tubo Eppendorf estéril cheio com 0,9% de solução salina para encher o tubo com. </li><li> Depois que tudo estiver preparado, colocar luvas estéreis. Certifique-se de não tocar em nada que não seja estéril. Mudar de luvas, se necessário. </li><li> Para cada ASO a ser utilizada, encher uma seringa de 1 mle loadpumps, colocando a agulha no orifício superior e enchendo lentamente até que o excesso de vazamentos para fora. Continuar até que todas as bombas são cheias. </li><li> Destampe o fluxo-moduladores e inserir as bombas. Empurrar o modulador de fluxo quase todo o caminho, deixando um intervalo de 3-5 mm. </li><li> Usando a lâmina de bisturi, corte cada pedaço de tubo em cinco segmentos iguais. Tomar um pedaço de tubo, encher com solução salina estéril usando uma seringa de 1 ml, e inserir a parte superior do modulador de fluxo em uma das extremidades do tubo. Então, uma cânula do etanol e ligá-la para a outra extremidade do tubo. A bomba agora está totalmente montado. </li><li> Coloque a bomba totalmente montado no tubo de 50 ml com solução salina estéril para priming. A iniciação permite que as bombas de absorver fluido para iniciar a entrega da droga, bem como de vir a temperatura adequada. Tempo priming: 14 bombas dias: 4-6 hr, 28 bombas dias: 40 h, 42 bombas dias: 60 hr. Quando terminar a montagem das bombas, tampar os tubos cônicos e coloque em um pano limpo37 ° C, banho de água até à cirurgia. </li></ol> 2. O processo pré-cirúrgico <ol><li> Limpe tudo para baixo com etanol 70% para esterilizar a área e estabelecer campos estéreis em cima da mesa e stereotax para criar um campo estéril. É importante estar consciente do campo estéril durante toda a cirurgia. Ligue o seguinte: Sterilizer Bead, Aquecimento Pad, Luz, Leitura Digital, e Oxigênio / System isoflurano (Figura 1). </li><li> Os seguintes itens serão necessários se fazer uma única cirurgia ou um lote inteiro de cirurgias como rotineiramente fazer: 1 par de fórceps, uma pinça hemostática curva, uma tesoura pequena, um par de pequenas tesouras embotadas curvas, um rato cortador de osso , uma pinça hemostática reta, 5-0 suturas de nylon, uma tubos cônicos com etanol 70%, um tubo cônico com 95% de etanol, um tubo cônico com iodo, um tubo cônico com peróxido de hidrogênio, o pacote de cotonetes estéreis, uma garrafa de super- cola, pomada antibiótica um tubo, um tubo de olholubrificante, e uma máquina de barbear eléctrica. </li><li> Coloque as pontas dos dois pares de tesouras, pinças, e hemostática curva no esterilizador talão por 15 s. Retire e coloque em etanol 70%. Ao realizar mais de uma cirurgia, re-esterilizar as pontas dos instrumentos entre animais. </li><li> Gire o isoflurano a 4% e O 2-0,4 L / min e fluxo de gás direto para a câmara. Temos o nosso sistema de isoflurano / oxigênio calibrado pelo menos uma vez por ano para garantir que estamos entregando a quantidade adequada de anestesia. Coloque o rato na câmara e aguarde até que a respiração é significativamente mais lento. Retire o mouse e executar uma pitada dedo do pé para garantir o mouse é completamente inconsciente. </li><li> Raspar o cabelo a partir da parte superior do ombro até entre os olhos. Se o rato começa a acordar, coloque o mouse de volta para a câmara até que o mouse é completamente inconsciente novamente, confirmando com uma pitada dedo do pé. Coloque o rato anestesiado no stereotax e empurre o cone do nariz sobre o nariz.Seja gentil como os dentes e os ossos são frágeis. </li><li> Dirigir o fluxo de gás para o stereotax para manter o rato anestesiado. É importante verificar ocasionalmente para certificar-se de que o mouse está completamente inconsciente com uma pitada dedo do pé durante toda a cirurgia. Proteja a cabeça com as barras de ouvido. Nós preferimos nivelamento barras de ouvido, que para atingir o ventrículo lateral, um crânio perfeitamente nivelada não é necessário, devido ao grande tamanho do ventrículo. </li><li> Vire o nível de isoflurano até 2,0% para a manutenção. Dab pomada em cada olho. Como pode ser visto no vídeo, colocar uma cortina estéril sobre o mouse de forma que apenas a base do pescoço e da cabeça estão expostos. Em seguida, desinfectar a zona cirúrgica, limpando a parte superior da cabeça e do pescoço em um movimento circular começando no centro da área raspada e movendo-se para fora em primeiro lugar com um algodão embebido em etanol a 95%, seguido por um algodão embebido em iodo. </li><li> Recomendamos o uso de um sistema de sonda retal feedback de temperatura controlada de aquecimento que garantea temperatura do rato permanece num estável de 37 ° C. Se a temperatura do rato diminui durante a cirurgia, a recuperação pós-cirurgia pode levar mais tempo e a hipotermia resultante pode conduzir a actividade da proteína aberrante, incluindo hiperfosforilação da proteína associada a microtúbulos tau 15. Depois de configurar o sistema de aquecimento, agora você está pronto para começar a cirurgia. </li></ol> 3. Implantação de bomba osmótica Alzet <ol><li> Antes de iniciar a cirurgia, colocar em um novo par de luvas estéreis. Em seguida, utilizando um fórceps e uma pequena tesoura, fazer uma incisão na pele a partir da base do crânio acima do pescoço do animal para cima entre os olhos </li><li> Aqui a tesoura embotadas com a curva virada para cima e deslizar por baixo da pele da base da parte de trás do pescoço para o membro posterior esquerdo. Não deve haver qualquer resistência. Se houver, remova a tesoura e tente novamente. Isto constitui a bolsa subcutânea para a bomba osmótica. </li><li> Wiep o crânio limpo com cotonetes de algodão estéril, seguido de uma mecha de algodão embebida em peróxido de hidrogénio para aumentar a bregma. </li><li> Limpar abaixo os tubos cónicos de 50 ml que contêm bombas para manter a esterilidade das bombas. Recolher cuidadosamente uma bomba a partir do tubo cónico usando a hemostática curvo, tendo o cuidado extra que a bomba não tocar as paredes do tubo cónico. Segurar a base da bomba com uma pinça e empurrar o modulador de fluxo do que no resto do caminho com a hemostática curvo. </li><li> Segurar a bomba quando o modulador de fluxo e tubo reunir com a hemostática curvo. Insira a bomba sob a pele na base do pescoço e empurrá-lo de volta para o membro posterior esquerdo, tanto quanto ele vai sem resistência. Tenha cuidado para não deixar o cateter toque em nada. </li><li> Com a pinça hemostática curva, pegue a cânula no sulco onde a parte superior se encontra com o pedestal. Mova o motorista cânula para a posição e assegurar no lugar. </li><li> Colocar uma única gota de supercola sobre a base da cânula. Push o topo da cânula para o condutor e a posição de modo a que o tubo está apontado para trás. </li><li> Toque a ponta do cateter para bregma e zerar as coordenadas no visor digital. Elevar o cateter de 1,1 milímetros e mover lateralmente para a direita e 0,5 mm posterior (Figura 2B). Segure a pele para fora do caminho com a pinça hemostática curva. </li><li> Dirigir o cateter de metal fino através do crânio até que a base da cânula de plástico está firmemente pressionado contra o topo do crânio. O cateter de metal pode ser conduzido directamente através do crânio no ratinho, devido à relativamente fina do crânio. Se utilizando ratos, perfurar um orifício no crânio antes de baixar o cateter. </li><li> Puxar qualquer pele que tem cola nele longe do crânio. Com o driver cânula segurando a cânula / cateter no lugar, espere 1-2 minutos para a cola secar totalmente. </li><li> Quando se pratica, para avaliar a colocação do cateter, injecta-se 20-40 mL de 2,5% Corante FastGreen através do tubo (Figura 2C). Espere 2-3 min, perfuse o rato com 1X PBS 0,03% de heparina, e remover o cérebro. Corte coronal no local do cateter. Se o catéter foi colocado no ventrículo, o corante serão perfundidos por todo o sistema ventricular do rato (Figura 2D). </li><li> Segure o cateter no lugar com a pinça hemostática curva, aumentando simultaneamente o condutor. Lentamente, liberte a hemostática para assegurar que a cânula é adequadamente fixada ao crânio. </li><li> Com uma mecha de algodão, pressionar para baixo sobre a parte superior da cula. Coloque os clippers óssea de ratos no bosque entre o topo ea base da cânula. Clipe fora do topo da cânula enquanto ainda pressionando para baixo com o chumaço de algodão. Tentar e manter o nível de cortadores de modo a não retirar a cânula do crânio. Se a cânula não desgrudar, rapidamente re-cola e aplique pressão com um cotonete para um adicional de 2 min. </li><li> Usando o fio de sutura 5-0, pinça hemostática regular, e fórceps, sutura ao longo da abertura total, com especial atenção para a direita sobre a cânula. Nós usamos a correrg sutura colchão horizontal (ver Figura 5), devido à maior incisão sobre o crânio. </li><li> Aplique um pouco de pomada antibiótica na cabeça e no pescoço. Desapertar bares da orelha e soltar o cone do nariz. Remover o rato da stereotax e coloque sobre uma almofada de aquecimento para a recuperação. Monitorizar os ratinhos perto durante o período de recuperação, tipicamente variando de 10-30 minutos. Verifique a cada 2-3 minutos, até que o mouse começa a andar em volta e prepara-se. </li></ol> 4. Cuidados pós-operatórios <ol><li> Monitorizar os ratinhos diariamente após a cirurgia para a primeira semana. </li><li> Se um rato parece estar com dor ou angústia, recomendamos fornecendo o mouse com um mg / kg de injeção subcutânea de 5 Carprofen uma vez a cada 24 horas para até 5 dias, a fim de aliviar a dor. </li><li> Se parece existir uma infecção, generosamente aplicar pomada antibiótica para a área diariamente e consultar um médico veterinário responsável para assegurar que a ferida cicatriza adequadamente. </li><li> Remove o náilon 5-0 7-10 dias após a cirurgia para evitar a irritação do fio de sutura. </li></ol> 5. Alterando ou removendo bomba osmótica Alzet Após a bomba é feita a infusão activamente ASO, pode ser alterado ou completamente removida. <ol><li> Siga o mesmo procedimento de pré-cirurgia, como acima, com as seguintes alterações: 1) Você não vai precisar de uma tesoura curva, pinça hemostática curva, cortadores óssea de ratos, nem o mostrador digital, e 2) em vez de preparar a cabeça do rato, fazer a barba e desinfectar a parte traseira do rato, na junção da bomba e da tubagem. </li><li> Adicione uma incisão de 1,5 cm na parte traseira do rato, perpendicular à bomba / tubo de junção, utilizando fórceps e tesouras. Puxar cuidadosamente a bomba para fora da incisão sem puxar significativamente / empurrando o tubo, uma vez que pode unir o cateter. </li><li> Para retirar a bomba, cortar o tubo de cerca de 0,5 cm acima do modulador de fluxo e tocar o supercola para a tubagem to selo fechada. Espera 1-2 min para a cola secar. Colocar o tubo em volta da incisão e sutura fechada. Dab pomada antibiótica para a pele suturada e coloque o mouse sobre uma almofada de recuperação aquecida. </li><li> Para mudar a bomba, ter acabado de fazer bombas imediata junto com um prato de 10 cm cheia com 95% de etanol. Cateteres não são necessários com as novas bombas. </li><li> Pegue uma nova bomba com a pinça. Mergulhe os dedos no etanol, tomar posse da bomba, e descartar o modulador de fluxo. Então, com cuidado e lentamente retirar a antiga bomba do modulador de fluxo ligado ao tubo e cânula. Assim que estiver desligado, deslize lentamente a nova bomba, assegurando que o modulador de fluxo nunca toca o exterior do rato. </li><li> Insira novamente a nova bomba através da incisão em volta do pacote subcutânea e sutura da pele. Dab pomada antibiótica na ferida e lugar do mouse no bloco de recuperação. </li><li> Assim como com a implantação da bomba, monitorar os ratos diariamente após a cirurgia para verificar se há pain / desconforto e infecções. Tratar com carprofeno e antibióticos se for considerado necessário. </li></ol> ICV BOLUS 6. O processo pré-cirúrgico <ol><li> Siga o mesmo procedimento de pré-cirurgia, na Seção 2 acima com as seguintes alterações: 1) Você não vai precisar de tesoura curva, pinça hemostática curva, ou cortadores óssea de ratos; 2) Limpe a seringa Hamilton de 10 mL e agulha com água esterilizada e de carga com ASO, e 3) se ligam a seringa e a agulha para o aparelho estereotáxico onde o condutor cânula foi localizado. </li></ol> 7. Bolus de ASO <ol><li> Usando fórceps e uma pequena tesoura, fazer uma incisão a partir da base do pescoço até entre os olhos. </li><li> Limpe o crânio limpo com cotonetes estéril, seguido de um cotonete embebido em água oxigenada para aumentar bregma. </li><li> Mova a seringa / agulha no lugar e prenda. Certifique-se de que a parte do bisel da agulha enfrenta posterior. Abaixea agulha até tocar bregma. Zero todas as coordenadas. Mover a agulha lateralmente para a direita 1,0 milímetros e 0,3 milímetros anterior (Figura 3A). </li><li> Lentamente conduzir a agulha através do crânio apenas até que o furo da agulha é nivelado com o topo do crânio. Novamente, isto pode ser feito devido à finura do crânio rato. Zero a coordenada z e abaixar a agulha a -3,0 mm, a uma taxa de 1 mm / seg (Figura 3B). Espera 2-3 min para o cérebro para selar em torno da agulha. </li><li> Entregar o total de 10 ul de ASO a uma taxa de 1 ml por segundo. Espere 2-3 min. Nós usamos uma taxa de infusão de 1 ml para ASOs para o ventrículo, embora esta taxa pode variar entre diferentes drogas. Ao praticar, para verificar a colocação correta da agulha através da apresentação de 10-20 mL de 2,5% FastGreen Dye. Perfundir o rato com 1X PBS 0,03% de heparina, logo após a infusão de corante e fazer cortes coronais do cérebro para verificar se a tinta se encontra no sistema ventricular (Figura 3C). </li> &lt;li&gt; Mantenha um cotonete contra o crânio na base da agulha. Elevar a agulha a uma velocidade de 1 mm por segundo. Assim que a agulha está fora do crânio, role o cotonete em cima do buraco da agulha e segure por 1 min para evitar qualquer ASO vaze. </li><li> Suturar a pele fechada, aplique pomada antibiótica, e lugar do mouse sobre aquecida pad recuperação. Dependendo da concentração de ASO, pode demorar 20 min a algumas horas para se recuperar totalmente. </li><li> Assim como com a implantação da bomba, monitorar os ratos diariamente após a cirurgia para verificar se há dor / desconforto e infecções. Tratar com carprofeno e antibióticos se for considerado necessário. </li></ol>

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Os autores recebem seus oligonucleotídeos antisense da Isis Pharmaceuticals.

A capacidade para entregar drogas globalmente no SNC, como mostrado no vídeo é uma técnica poderosa que é fácil de aprender e utilizar. Com a prática, uma única bomba ou por uma implantação ICV em bolus pode ser completada em 10 min, permitindo grandes grupos de ratinhos a ser tratada ao mesmo tempo. Isto é especialmente útil para estudos com uma leitura comportamental, como números maiores para o comportamento do mouse são fundamentais para ajudar a ver diferenças significativas. Com base em nossas experiências entregando ASO através de bombas e injeções em bolus, temos observado alguns prós e contras de cada método. Deve-se notar que estas são as opiniões em nosso laboratório e não pode ser verdadeiro para todos os modelos de rato e de ratazana. Encontramos uma vantagem da utilização das bombas é a sua capacidade para proporcionar uma quantidade elevada de ASO desde o ASO é distribuído ao longo de um período mais longo de tempo. Isso geralmente equivale a knockdown mais sustentada ou splicing após ativoASO infusão, embora isso não seja sempre o caso. As bombas também permitem um prazo preciso de entrega ASO (14 dias, 28 dias ou 42 dias) e as bombas podem ser alterados uma vez para permitir a infusão ASO ainda mais ativo. No entanto, verificamos que a mudança bombeia mais do que uma vez aumenta a variabilidade devido à formação de bolsas fibrosas à volta da bomba para evitar que o da bomba de absorver adequadamente fluido. Uma desvantagem das bombas é que alguns ratinhos não toleram a bomba, bem como outros. Se a linhagem transgênica que você está trabalhando é mais frágil, uma bomba pode ser muito complicado. As bombas também precisam de ser removidos após a infusão final, submetendo os ratinhos a outra cirurgia e anestesia adicional. Se fazer trabalho comportamento, é especialmente importante para remover a bomba e para permitir que, pelo menos, 1-2 semanas de recuperação uma vez que a presença da bomba irá afectar alguns comportamentos nos ratinhos. Com ICV bolus injeções, uma vantagem é o custo. Existe umainvestimento inicial para comprar as seringas e agulhas, mas ao longo do tempo, as injeções em bolus são mais custo-efetiva, pois não existem bombas / tubulação / cateteres para comprar. Em geral, há menos manter-se-com as injecções de bolus ICV, devido à falta de cânulas e bombas. Nós também descobrimos que ICV bolo pode ser utilizada para entregar ASO a ratinhos jovens frágeis e / ou mais. Uma desvantagem do ICV bolus é que é de uma única injecção. Não tanto ASO geral podem ser entregues por esta via, e se a duração da acção do ASO ser utilizado é curto, o efeito do knockdown / splicing também será de curta duração. Ambas as bombas osmóticas, bem como os bolus ICV tem a capacidade de entregar o ASO que pode proteínas knockdown ou alteram de splicing de genes em todo o sistema nervoso central de roedores, uma técnica que tem larga aplicação em vários campos neuroscience relacionados. Sugerimos que pilotar os dois métodos de entrega, se você não souber qual a via de administração é o mais adequado para o seu sestudo ESPECÍFICAS.

Alguns medicamentos não são capazes de atravessar a barreira hemato-encefálica (BHE), exigir Sistema Nervoso Central directa (CNS) de entrega. Para contornar a certificação, os fármacos podem ser entregues directamente para o cérebro, utilizando os métodos descritos. Enquanto o nosso laboratório e o papel detalhado aqui em foco oligonucleótidos anti-sentido (ASOs), outras drogas, tais como pequenas moléculas, anticorpos, vectores de terapia genética, etc., Pode também ser fornecido através da mesma abordagem. Certas proteínas desempenham um papel fundamental na patogênese de doenças neurodegenerativas. Tais proteínas muitas vezes formam espécies tóxicas e se acumulam em agregados, levando à eventual morte neuronal e doença neurológica subseqüente 3-4. Num esforço para reduzir ou mesmo parar a progressão destas doenças, uma opção terapêutica pode ser diretamente alvo e diminuir a proteína causador. No entanto, estas proteínas são frequentemente encontrados ubíqua através do CNS, o que torna difícil a e<html> ffectively orientá-las em uma escala global. A fim de orientar genes em todo o CNS, que administramos ASOs em rato líquido cefalorraquidiano (LCR), através do ventrículo lateral para ignorar o BBB. Este método tira vantagem específica do sistema ventricular do rato que banha todo o cérebro e na medula espinal, permitindo a distribuição generalizada dos ASO. Usamos ASO que são 18-20 mer-RNA como moléculas que se ligam directamente a sequência de mRNA-alvo e, em função das modificações químicas em ASO, quer A) recruta RNase H degrada o ARNm que conduz a knockdown ou B), deslocar um splicing alternativo , 2,16,17. Deve notar-se que múltiplas moléculas existem para derrubar uma proteína específica in vivo, incluindo shRNA. Uma vez que estas moléculas não são o foco deste artigo, vamos direcionar o leitor a rever os artigos que melhores mecanismos knockdown detalhes da ação e as vantagens / desvantagens de cada um 5-6. jove_content &quot;&gt; Em trabalhos anteriores, que usaram ASO para segmentar o superóxido dismutase de proteína 1 (SOD1) num modelo de rato transgénico de esclerose lateral amiotrófica (ELA), 7 (Figura 4). Mutações em SOD1 ocorrem em aproximadamente 2% de todos os ALS 8 casos, no entanto, foi recentemente SOD1 hipótese que pode desempenhar um papel importante na forma esporádica, bem 9-10. Diminuindo os níveis totais de SOD1 no rato transgénico ALS, a sobrevivência após o início foi significativamente aumentada 7. Estes dados importantes foram os primeiros para mostrar que um tratamento de ASO no SNC pode ter um profundo impacto positivo sobre um modelo de doença neurológica. Desde então, ASO orientadas para SOD1 humanos ter entrado e concluído com êxito uma Fase I de ensaios clínicos em humanos, com efeitos colaterais mínimos (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , conforme apresentado no 2012 64 º Annual Academy Americana de Neurologia. Planos para mover os ASOs para a frente para ensaios de Fase II estão em andamento. <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; Enquanto segmentação SOD1 foi a primeira demonstração de utilização de ASO para o tratamento de uma doença neurológica, vários outros estudos já foram realizados olhando para diferentes doenças e suas respectivas proteínas alvo. Em 2010 e 2011, ASOs essa mudança splicing da proteína sobrevivência do neurônio motor 2 (SMN2) foram usados ​​em modelos de camundongos transgênicos de atrofia muscular espinhal (AME) e resultou em uma melhora significativa nos fenótipos da doença 11,12. Estes ASOs splicing estão agora em fase I de ensaios clínicos em crianças com SMA (Clinicaltrails.gov NCT01494701). Adicionalmente, foi recentemente mostrado que a administração transiente de ASO dirigidas contra o gene de huntingtina foram capazes de resgatar dramaticamente o modelo de ratinho de Huntington, mesmo após os níveis de proteína huntingtina retornou à linha de base 13. Em todos estes estudos, o ASO foram entregues ao ventrículo lateral para diminuir os níveis totais do gene ou combinação de genes através de alterartodo o CNS. Ambas as bombas osmóticas e uma única injecção de bolo pode ser utilizada para entregar ASO para o CSF. Bombas para permitir uma entrega lenta, contínua, enquanto a intracerebroventricular (ICV) em bolus é um, a injecção rápida de uma só vez. Usámos estes dois métodos com sucesso, embora não tenham relatado a comparação directa entre a bomba eo bolo em uma única linha transgénica. Usando ASOs no SNC é uma poderosa forma de diminuir os níveis de proteína total e / ou mudança de emenda de várias proteínas. Enquanto usamos ASOs exclusivamente como um tratamento para distúrbios neurológicos, reconhecemos que outras áreas também podem se beneficiar desta técnica. Contanto que a proteína de interesse é expressa no sistema nervoso central e o objectivo final é o de alcançar o SNC largas variações na expressão de genes, utilizando ASO nas técnicas demonstradas pode ser muito útil.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 14 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 1002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 28 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 42 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2006</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.5 mm Catheters</td>
 <td>PlasticsOne</td>
 <td>3280PM/SPC</td>
 <td>Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vinyl Catheter Tubing</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>7760</td>
 <td>ID: 0.027", OD: 0.045"</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP</td>
 <td>Baxter</td>
 <td>2F7124</td>
 <td>NOT to be used in pumps or tubing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Injection, USP</td>
 <td>Hospira</td>
 <td>NDC 0409-4888-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p60 Petri Dish (Sterilized)</td>
 <td>TRP</td>
 <td>93060</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Surgical Blades (Sterile)</td>
 <td>Butler Schein</td>
 <td>#007319</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Latex Surgical Gloves (Sterile)</td>
 <td>Micro-Touch</td>
 <td></td>
 <td>CatNo will depend on size of the gloves needed</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile Towel Drape</td>
 <td>Dynarex</td>
 <td>4410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>.2um Syringe Filters</td>
 <td>PALL</td>
 <td>4192</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml Syringe (Sterile)</td>
 <td>BD</td>
 <td>309625</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Conical Tubes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PUMP &amp; BOLUS SURGERY PROTOCOLS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Forceps</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11001-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>13009-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine Sharp Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14060-09</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Blunt Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14029-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bone Cutter</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>16104-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Straight Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>12002-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l gas-tight with removable needles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needles</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7758-04</td>
 <td>26 gauge, Point Style: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5-0 Nylon Suture Thread</td>
 <td>Covidient</td>
 <td>SN-871</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alcohol Pads</td>
 <td>Select</td>
 <td>#521</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cotton Swabs (sterile)</td>
 <td>Puritan</td>
 <td>REF 806-WC</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super Glue</td>
 <td>Loctite</td>
 <td></td>
 <td>Longneck Bottles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CAUTION: FastGreen Dye</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F7252-5G</td>
 <td>Wear Eyeshields and Gloves when handling this product</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic Cream</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eye Ointment</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electric Shaver</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Provadone Iodine</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3% Hydogen Peroxide</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Warming Pad</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead Sterilizer</td>
 <td>SouthPointe Surgical</td>
 <td>GRM5-1450</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 940</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nose Cone</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 923-B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ear Bars</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 921</td>
 <td>This model is optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cannula Driver</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1966</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe Holder</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1972</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Temperature Control System</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model TCAT-2LV</td>
 <td>Optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oxygen/Isoflurane System</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system

Devido à incapacidade de atravessar a barreira hemato-encefálica, certas drogas têm de ser entregue directamente no sistema nervoso central (SNC). O nosso laboratório foca especificamente oligonucleótidos anti-sentido (ASOs), embora as técnicas apresentadas no vídeo aqui também podem ser usadas para entregar uma infinidade de outras drogas para o SNC. Oligonucleótidos anti-sentido (ASOs) têm a capacidade de knockdown alvos específicos de sequência 1, bem como índices de isoformas de transferência de genes específicos 2. Para alcançar knockdown gene generalizado ou splicing no SNC de camundongos, os ASOs podem ser entregues no cérebro usando duas rotas distintas de administração, sendo que ambos demonstramos no vídeo. As primeiras utilizações bombas osmóticas Alzet, ligados a um cateter que é implantado cirurgicamente dentro do ventrículo lateral. Isto permite que os ASO para ser infundida continuamente para o SNC, por um período de tempo designado. A segunda envolve uma única injeção bolus de um oigh concentração de ASO no ventrículo lateral direito. Ambos os métodos utilizam o sistema do ventrículo cerebral do rato para entregar o ASO para todo o cérebro e na medula espinal, embora, dependendo das necessidades do estudo, um método pode ser preferido em detrimento do outro.

Após a infusão de bomba ou de um tempo designado após a injecção ICV de bolus (rotineiramente utilizar quatro semanas), é importante para testar a eficácia dos ASO. Recomendamos tomar várias regiões do cérebro e da medula espinal para medir os níveis / isoformas do gene alvo, quer ao nível de ARNm utilizando PCR quantitativo em tempo real, bem como o nível de proteína usando ELISA ou Western Blot (Figura 4 para um exemplo publicada ). Isto irá ajudar a determinar a eficácia de ASO ao longo das diferentes regiões do SNC. Se a meia-vida da proteína alvo é longa, aconselha esperar mais tempo após a infusão de ASO, de modo a avaliar o knockdown máximo proteína ou splicing. Também é importante testar distribuição oligo. Bomba de infusão resultar na distribuição através de ambos os hemisférios ipsilateral e contralateral, apesar de uma concentração de ASO superior é muitas vezes observada em regiões mais próximas no sistema ventricular 16. ICV bolus injeções de produzir um mais unifodistribuição rm de oligo através do SNC 16, embora os efeitos podem não durar tanto tempo. Nós direcionar o leitor para Southwell et al. Ver uma comparação direta de bomba contra bolus distribuição oligo 16. Recomenda-se também testes de doses múltiplas, assim como a duração da acção de cada vez que os ASO ASO irá comportar-se de forma ligeiramente diferente in vivo. ASOs normalmente têm uma duração relativamente longa de ação, com knockdown alvo ou splicing durando vários meses pós-parto ASO. Além disso, alguns ASO irá funcionar melhor do que outros, e alguns genes alvos, será mais fácil para o knockdown do que outros. Devido a isso, o rastreio asos para determinar o candidato chumbo, recomendamos testar pelo menos 3-5 ASO in vivo com um n = 4-6 ratinhos adultos por ASO, numa primeira passagem. Se você estiver usando uma droga diferente de ASOs, também será importante para pilotar a concentração ideal de drogas, duração de drogas de ação e CNS drogadistribuição para esse composto específico. <img alt="Tabela 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326table1.jpg" /> Tabela 1. Cirurgia Coordenadas. As coordenadas usado para bater o ventrículo lateral direita em ambos os camundongos e ratos quando implantando bombas osmóticas, bem como realizar uma intracerebroventricular (ICV) bolus. Ambas as coordenadas, para bombas e ICV bolus, o alvo do ventrículo lateral direito. Usamos dois conjuntos diferentes, porque estes são o que temos mais experiência e saber proporcionam excelente distribuição de ASO. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig1.jpg" /> Figura 1. Setup estereotáxica. (A) O equipamento estereotáxico necessário para a bomba Alzet e cirurgias bolus. I) Glass Bead Esterilizarr. ii) Leitura Digital. iii) Base estereotáxica com braços móveis. iv) Temperatura controlada Aquecimento Pad. v) Isoflurane / System Oxygen. vi) Câmara isoflurano. (B) Feche acima do cone do nariz e barras de ouvido. (C) Dois anexos necessários. Esquerda: Seringa / porta-agulha para ICV injeções em bolus. Direita: Driver cânula para implantação da bomba osmótica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig2.jpg" /> Figura 2. Alzet osmótica Implantação da bomba. (A) Alzet opções bomba osmótica para camundongos. 14 bombas. Dias (0,25 mL / hr), 28 bombas dias (0,25 mL / hr), 42 bombas dias (0,15 mL / hr) (B) Coordenadas para implantação da bomba de bregma: -0,5 mm Posterior, -1,1 mm Lateral ( direita), e ventral -2,5 mm (comprimento do cateter). (C) após a condução do cateter através dacrânio e colagem da cânula, corante é descarregado através do cateter para avaliar a colocação correcta do cateter no ventrículo lateral (D). perfundidos cérebro imediatamente após corante administrado como em (C). Se o cateter é colocado no ventrículo com sucesso, o corante será distribuído por todo o sistema ventricular do rato. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig3.jpg" /> Figura 3. Injeção intracerebroventricular Bolus. (A) Coordenadas para o bolus de bregma: 0,3 milímetros anterior, -1,0 mm Lateral (Direito) e -3,0 mm ventral (B) Depois de dirigir a agulha através do crânio -3,0 mm ventral, corante é empurrado através da seringa. para avaliar a colocação apropriada da agulha no ventrículo posterior. (C) cérebro perfundidos logo após corante administrado como em (B). Se a agulha é colocada com sucesso no ventrículo, acorante será distribuído por todo o sistema ventricular do rato. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4.jpg" /> Figura 4. Os oligonucleótidos anti-sentido reduzem SOD1 rato in vivo (figura feita directamente a partir de Smith et ai. 7). (AD), os oligonucleótidos anti-sentido SOD1 r146192 SOD ou SOD mexidos foram infundidos durante 28 dias no ventrículo lateral direito de ratos normais a 100 ug / dia. (A) endógenos SOD1 níveis de mRNA de cérebro e medula espinal como medido por qRT-PCR. ( B) SOD1 e a-tubulina de níveis de proteína após infusão de ASO. (C e D), os níveis de proteína para a tubulina e SOD1 quantificados para diferentes regiões do cérebro após a infusão. (E) ASOs contra presenilina 1 ou a GSK-3 e beta, Foram infundidas por 2 semanas no ventrículo lateral direito não transgênicas de camundongos e os níveis de mRNA avaliadas no córtex frontal / temporal direito. Reproduzido com permissão da American Society for Clinical Investigation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50326/50326fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5.jpg" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5highres.jpg"/> Figura 5. Execução Horizontal Sutura colchão. 5-0 nylon fio de sutura é tecida dentro e fora da pele, começando anterior e posterior trabalho, concentrando-se mais sobre a cânula. Uma vez tendo atingido o ponto mais posterior, o fio de sutura é então levado de volta para cima e enfiada pela cânula mais uma vez. Isto assegura o fechamento da ferida adequada e impede a cânula / tubo de trabalho através da pele.

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Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Descreve-se um método para alvejar fármacos para o sistema nervoso central por qualquer implante de um cateter ou realizar uma injecção de bolus no ventrículo lateral direito de ratos. Nós nos concentramos especificamente na entrega de oligonucleotídeos antisense. Esta técnica é facilmente adaptável a outros fármacos e a ratos.

Entrega intraventricular direta de medicamentos para o Sistema Nervoso Central Rodent

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

direct-intraventricular-delivery-drugs-to-rodent-central-nervous

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Pharmacotherapy of Psychosis and Mania

SCIENTISTS IN ACTION

59.7K visualizações.  Washington University in St. Louis School of Medicine. Descreve-se um método para alvejar fármacos para o sistema nervoso central por qualquer implante de um cateter ou realizar uma injecção de bolus no ventrículo lateral direito de ratos. Nós nos concentramos especificamente na entrega de oligonucleotídeos antisense. Esta técnica é facilmente adaptável a outros fármacos e a ratos.

Vídeo: Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Entrega da droga sistêmica e local para o tratamento de doenças do sistema nervoso central em modelos de roedores

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Neurociência

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Um Paradigma para Investigar Lesão de reparação do sistema nervoso central em<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing óptica do Sistema Nervoso Central Rato Usando a claridade passiva

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Computerized Test Battery to Study Pharmacodynamic Effects on the Central Nervous System of Cholinergic Drugs in Early Phase Drug Development

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for further development of new compounds. A computerized and thoroughly validated battery of neuropsychological and neurophysiological tests has been shown to be sensitive to detect drug-induced effects of multiple new and existing compounds. The test battery covers the main CNS domains, which have been shown to respond to drug effects and can be repeatedly administered following drug administration to characterize the concentration-effect profile of a drug.
The standard tests in the battery are saccadic eye movement, smooth pursuit eye movement, the Bowdle visual analog scale (VAS), the Bond and Lader VAS, body sway, adaptive tracking, visual verbal learning, and quantitative electroencephalography (qEEG). However, the test battery is adaptive in nature, meaning that it can be composed and adjusted with tests fit to investigate specific drug classes, or even specific receptors.
Showing effects of new cholinergic drugs designed to have a pro-cognitive outcome has been difficult. The pharmacological challenge model is a tool for early proof-of-pharmacology. Here, a marketed drug is used to induce temporary and reversible disease-like symptoms in healthy subjects, via a pharmacological mechanism related to the disease that is targeted as indication for the new compound. The test battery was implemented to investigate the potential of the nicotinic receptor antagonist mecamylamine to be used as a challenge model for cholinergic dysfunction, as seen in neurodegenerative disorders.
A worsening of scores in a dose dependent manner on the visual verbal learning test (VVLT; a test for learning and memory abilities) and the adaptive tracking test (a measure of visuomotor control and arousal), in particular, showed that the test battery is sensitive to showing acute pharmacodynamic effect after administration of anti-cholinergic drugs.

A validated computerized battery of neuropsychological and neurophysiological tests is used to study pharmacodynamic effects on the central nervous system of newly developed drugs in early phase development. To demonstrate the test battery, the acute effects of mecamylamine and the reversal of these effects by two agonist drugs are described.

Uma bateria de testes informatizados para estudar os efeitos farmacodinâmicos no sistema nervoso Central de drogas colinérgicas em fase inicial de desenvolvimento de drogas

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...