Este trabalho foi suportado por concessões R01-HL87290, R01-HL87290-S1 e R01-AI082610 dos Institutos Nacionais da Saúde para LJMC.

1. Craniotomia A craniotomia em 8 a 10 semanas de ratos velhos precisa ser feita com antecedência, uma descritos anteriormente, exceto que uma barra de titânio não é colocado na cabeça do animal. A janela crônica crânio é um exame que permite a preparação estável da microcirculação pial mesmo meses depois de ser implantado. Normalmente, realizamos nossos estudos 2-3 semanas após a implantação janela craniana. 2. Microscopia intravital <ol><li> Duas e três semanas após a craniotomia, a temperatura do corpo está marcada e, em seguida, o mouse é levemente anestesiados com isoflurano (4% para a indução, 1-2% para manutenção). Anestesia leve é ​​usado para prevenir o estresse animal e desconforto durante o procedimento experimental. </li><li> Os animais são então colocados em posição prona em uma estrutura estereotáxica ea cabeça cuidadosamente protegido usando barras de ouvido. O nível é ajustado com as alavancas esquerda e direita. Temperatura corporal é mantida através de uma almofada de aquecimento. Porque camundongos com malária cerebral desenvolver hipotermia, os ajustes de temperatura precisam ser ajustados para cada animal. </li><li> O deslizamento de capa sobre a janela do crânio é suavemente limpo com um cotonete embebido em óleo mineral e uma imagem panorâmica dos vasos sob a janela é tomado com a ajuda de um microscópio estereoscópico e uma câmera digital (Nikon Coolpix 995, Japão). A imagem é impressa, datada e identificada e será usado como um mapa para as medições do diâmetro do vaso e glóbulos vermelhos (RBC) velocidades. </li><li> O mouse é então transferido para um estágio do microscópio intravital (personalizado Leica-McBain, San Diego, CA). Uma gota de água é colocada na janela cranial aproveitando o bem formado pelo acrílico dental, o foco é ajustado. As medições são realizadas usando uma objetiva de imersão 20X (LUMPFL-WIR, abertura numérica 0.6, Olympus) de água. As mesmas embarcações são seguidos de forma que comparações diretas aos seus níveis de linha de base poderiam ser realizados permitindo mais robustas estatísticas para as populações pequena amostra. As imagens são capturadas com uma câmera digital de baixa luz da câmera de alta velocidade (Hamamatsu C9300-221, Japão), ou câmara analógica pouca luz (Cohu 4815, San Diego, CA) ligado a uma fita de vídeo (JVC, Japan), hora marcada (Vídeo MicroImage sistemas, Boyertown, PA) e um monitor colorido (PELCO, Clovis, CA). A fita está devidamente identificado antes do início da gravação, eo carimbo de tempo permite a identificação dos eventos, documentando o prazo durante o qual tais eventos foram recodificadas. </li><li> A primeira verificação dos vasos é feita para avaliar a qualidade da preparação e, se o sangue está fluindo em todos os vasos. Então, a seleção dos vasos a ser medido é feita e deve incluir vênulas e arteríolas de diferentes diâmetros (em preparações nosso mouse pial, a maioria das embarcações faixa entre 20 e 80μm) e cobre diferentes locais dentro da área exposta pela janela. Arteríolas e vênulas podem ser facilmente diferenciadas, verificando a direção do fluxo sanguíneo nas ramificações do navio (se distribui ou coleta de sangue). Em nossos estudos, as medições são feitas em 12 navios. Localização precisa de cada ponto a ser medida é anotada no quadro da vasculatura pial. </li><li> Para cada local, o diâmetro do vaso é medida usando um dispositivo de corte de imagem (imagem ao cisalhamento, Vista Electronics, San Diego, CA) 2. Uma vez que o local é selecionado, a imagem do navio está alinhado na posição vertical ea imagem é cortado até os extremos opostos estão alinhados ea leitura está documentado. Este valor pode ser traduzido em micrômetros pela calibração anterior para cada ampliação específico usando um micrômetro Stage Retículo Calibração (Edmund Optics Inc., Barrington, NJ). </li><li> Cada ponto é gravado durante pelo menos 30 segundos para o rastreamento de eritrócitos. Para o rastreamento, uma amostra de sangue coletado, e eritrócitos são fluorescente etiquetado com o corante carbocyanine Dil (Molecular Probes, Carlsbad, CA) e infundido através da veia caudal para obter uma concentração em vivo de ~% ,4-,5 3. Em animais infectados com Plasmodium berghei ANKA (PBA) expressando a proteína fluorescente verde (GFP-PBA, uma doação da Pesquisa em Malária e de reagente de referência Resource Center MR4, Manassas, VA; depositado por CJ Janse e Águas AP), não infusão de rotulados célula é necessário. As imagens de vídeo são gravados em 150 frames por segundo. Esta taxa é definida para obter 1-6 imagens de uma célula em um quadro de vídeo para a determinação das velocidades de até 8 mm / s. As imagens de vídeo são digitalizados com um computador pessoal usando o Adobe Premier software 4.0, e os dados de coordenadas xy para cada imagem células são obtidos utilizando SigmaScan Pro 4.0 (SPSS Chicago, IL) 4. Posições célula são determinadas manualmente e não por análise de imagem, dado que o olho de um observador treinado foi mostrado para dar uma boa estimativa da localização do centro de uma célula, queh, em geral, corresponde à localização da fluorescência máxima observada para orientações mais células. Múltiplas determinações de posição e velocidade são feitos para cada célula e em média para obter a velocidade média de RBC. </li><li> Quando as medições de velocidade RBC são realizadas offline, o tempo de observação total para cada rato não exceda 10-15 minutos minimizar os efeitos cardiodepressoras da anestesia. </li><li> Uma vez que o diâmetro dos vasos e medições de velocidade RBC estão disponíveis, o cálculo do fluxo de sangue em cada embarcação pode ser feita usando a fórmula: Q = V x π (D / 2) 2, onde Q = fluxo de sangue, V = RBC velocidade e D = diâmetro do vaso. </li><li> Estes procedimentos podem ser repetidos ao longo do tempo. Por exemplo, no modelo do rato de malária cerebral, realizamos medições diárias, começando no dia 4 de infecção. Os valores obtidos a cada dia para cada rato são normalizados em relação ao dia 0 (pré-infecção), que é considerado 100%. </li><li> Além de diâmetro do vaso e medições de fluxo de sangue, avaliações adicionais podem ser realizados, por exemplo, melhorou a avaliação da perfusão e da análise de rolling de leucócitos e / ou plaquetas e adesão nos vasos pial. Essas medições são realizadas com a ajuda de marcadores fluorescentes marcado. No caso da malária, também podemos detectar parasitas circulantes ou aderentes por meio do uso da cepa PBA que expressa GFP. </li><li> Para avaliação da perfusão usamos uma solução de FITC-albumina marcada (Sigma, St Louis, MO 50μg/mouse), e para quantificar a adesão de leucócitos aos navios pial usamos anticorpos contra o marcador pan-leucócitos CD45 marcado com Texas Red (TXR) ( Invitrogen, Carlsbad, CA 4μg/mouse). Para isso, 25μL da albumina-FITC (2mg/ml) e 20μL de anticorpos anti-CD45-PE (200μg/mL) são misturados e injetados na veia da cauda pré-aquecido. O mouse pode ser fotografada de imediato, no entanto, se as medições de fuga terá albumina-FITC é permitido circular por 15 minutos. Fluorescência verde (518nm) emitida pela albumina-FITC e GFP (PBA-GFP CGV) é capturado e usando ALPHA Vivid: XF100-2 (Omega Optical, Brattleboro, VT), e anti-CD45-TXR fluorescência (615nm) e é encerrado capturados com um padrão Vivid: XF42. </li><li> A albumina marcado com fluorescentes permite uma melhor visualização da rede vascular, incluindo vasos penetrantes, e é particularmente útil em estados de doença como a malária cerebral para verificar se há vasos não-perfundidos ou sub-perfundidos. Também pode ser usado para medir derrame vascular 5. </li><li> O fluorescentes marcado anti-CD45 anticorpos se torna mais fácil identificar e quantificar rolling de leucócitos e adesão aos navios pial. Para evitar distorções na quantificação, quantificamos rolling e aderência nos mesmos pontos pré-definidos para medir o fluxo sanguíneo. Quantificação da adesão de leucócitos é feita pela contagem do número de leucócitos em um comprimento 100μm navio. Rolando é quantificado pela contagem do número de leucócitos viajando a uma velocidade significativamente mais lento do que velocidade do sangue no mesmo comprimento 100μm, durante 30 segundos. </li></ol> 3. Resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. (Passo 2.6) Imagens da rede vascular do mouse pial acessível através da janela do crânio. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. (Passos 3,1-3,5) display esquemática do set up para microscopia intravital da microcirculação do mouse pial. 1: microscópio intravital; 2: 20X objetivo imersão em água; 3: fonte de luz; 4a: digital low-luz da câmera de alta velocidade; 4b: câmera analógica; 5: mouse na moldura estereotáxica; 6: monitor de computador; 7: analógico tosquiador monitor mostrando como o corte da imagem (seta) é feito para medir o diâmetro do vaso. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. (Passo 3,6-3,8) Microvascular glóbulos vermelhos medições de velocidade através do rastreamento de celular de alta velocidade gravações de vídeo de fluorescência. Fotos de A a F são imagens sequência de um navio pial, mostrando um RBC único movimento cruzando o campo microscópico delimitado pela câmera. Determinação manual de frame por frame de 15 posições ou mais células cruzando o campo, com sua distância pré-calibrado, permite o cálculo da velocidade média na RBC cada navio com a ajuda de uma planilha do Excel. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. (Passo 3.9) Dados de um experimento representativo mostrando as mudanças no fluxo sanguíneo pial ao longo do tempo em Plasmodium berghei ANKA (PBA) camundongos infectados (n = 5) e em camundongos de controle não infectados (n = 5). Considerando que, em camundongos de controle do fluxo sanguíneo pial é relativamente estável ao longo do tempo, o PBA infectados camundongos mostram uma acentuada diminuição do fluxo sanguíneono momento da evolução da malária cerebral (dia 6). Dados são a média ± SEM. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. (Passo 4.3) Um grande número de leucócitos aderentes aos navios pial de um mouse infectados com Plasmodium berghei ANKA, como revelado pela coloração com anticorpos anti-CD45-Texas Red fluorescente.

<ol>
	<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li><li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting.">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li><li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile.">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li><li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules.">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li><li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery.">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li><li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction,+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine.">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de microscopia intravital aqui descrito fornece uma ferramenta única e poderosa para a observação detalhada da microcirculação pial no mouse. Ele permite destacar arteríolas e vênulas individuais e medir as mudanças de uma série de parâmetros como diâmetro do vaso, RBC velocidades, o fluxo sanguíneo, a adesão e rolamento de leucócitos, plaquetas e outros elementos do sangue, derrame vascular, pH e pO2 tecidual e potencialmente muitos outros aplicações. O em resposta vascular in viv...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>FDG9623</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbocyanine dye Dil </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>D306</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin-FITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A9771</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-CD45-TxR Ab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>MCD4517</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P. berghei ANKA-GFP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MR4</td>
<td>MRA-865</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window

Este modelo experimental foi desenhado para avaliar a microcirculação do mouse pial durante aguda e crônica hemodinâmicos, fisiológicos e fisiopatológicos, condições inflamatórias e metabólicas, utilizando em microscopia de fluorescência in vivo. A janela fechada do crânio é colocado sobre o córtex parieto-occipital esquerdo do mouse. Microcirculação local é registrado em tempo real através da janela usando epi e iluminação de fluorescência, e as medições de diâmetros e vasos de glóbulos vermelhos (RBC) velocidades são executadas. RBC velocidade é medida em tempo real, utilizando correlação cruzada e / ou eritrócitos fluorescente etiquetados. Adesão de leucócitos e plaquetas aos navios pial e avaliação de perfusão e derrame vascular são feitos com a ajuda de marcadores de fluorescência rotulados como anticorpos Albumina-FITC e anti-CD45-TXR. Microcirculação podem ser repetidamente vídeo-gravadas durante vários dias. Que usamos para a primeira vez que o cérebro de microscopia intravital fechar a janela para o estudo da microcirculação pial seguir mudanças dinâmicas durante o curso da infecção por Plasmodium berghei ANKA em camundongos e mostram que a expressão da CM está associada a disfunções da microcirculação caracteriza-se por vasoconstrição, diminuição profunda no sangue fluxo e, eventualmente, colapso vascular.

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Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Microscopia intravital para seguir temporal e espacial eventos inflamatória e hemodinâmica na microcirculação pial.

Microscopia intravital da Microcirculação cérebro de camundongo usando uma janela fechada Cranial

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

intravital-microscopy-mouse-brain-microcirculation-using-closed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.2K visualizações.  University of California, San Diego. Microscopia intravital para seguir temporal e espacial eventos inflamatória e hemodinâmica na microcirculação pial.

Vídeo: Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

An Experimental Platform to Study the Closed-loop Performance of Brain-machine Interfaces

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine interface to assess the robustness of different control-laws applied to a closed-loop image stabilization task. Taking advantage of the well-characterized fly visuomotor pathway we record the electrical activity from an identified, motion-sensitive neuron, H1, to control the yaw rotation of a two-wheeled robot. The robot is equipped with 2 high-speed video cameras providing visual motion input to a fly placed in front of 2 CRT computer monitors. The activity of the H1 neuron indicates the direction and relative speed of the robot's rotation. The neural activity is filtered and fed back into the steering system of the robot by means of proportional and proportional/adaptive control. Our goal is to test and optimize the performance of various control laws under closed-loop conditions for a broader application also in other brain machine interfaces.

We use a closed-loop fly-machine interface to investigate general principles in neuronal control.

Uma Plataforma Experimental para Estudo de Desempenho de circuito fechado de interfaces cérebro-máquina

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine ...

Neurociência

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Microscopia multifotônica do cérebro do rato Cleared Expressando YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

Formação extinção durante a janela de reconsolidação impede a recuperação do Medo

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

O Sistema Olfativo como um modelo para estudar os padrões de crescimento axonal e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

Um Método para infligir Cabeça Fechada Lesão cerebral traumático em<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated thinning of the skull. Cranial window surgery is typically performed with a high speed rotary drill, and many investigators find it challenging to prevent the drill from damaging the delicate dura and blood vessels. Extensive training and practice is required to remove the bone without damage to underlying tissue and thus cranial window surgery can be difficult, time consuming, and produce tissue damage. Piezoelectric surgery, which is extensively used for maxillofacial and dental surgery, utilizes ultrasonic vibrations to remove bone without damaging soft tissues. We have developed a method applying piezoelectric surgery to improve cranial window surgery in mice in preparation for multiphoton imaging. Comparisons within our lab find that the method requires less surgery time and has a lower average rate of complications due to dural bleeding than cranial window surgery with a rotary drill.

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezoelectric surgery has led to improvements in human maxillofacial and dental surgery. We have developed a protocol to optimize piezoelectric surgery for cranial window surgery in mice.

Piezo de alta precisão Osteal extirpação (PHASOR): Uma técnica para cirurgia melhorada janela Cranial em ratos

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Implante de janela de laminectomia e medula espinhal no mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

Quantificar a distribuição heterogênea de uma proteína sináptica no cérebro do rato utilizando imunofluorescência

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...