Este trabalho foi financiado pela American Heart Association (Pós-doutorado bolsa para AYS) e pelo National Institutes of Health (MH085499, EB003832 e OD006831 de DK). Agradecemos a Beth Friedman e Pablo Blinder para comentários sobre o manuscrito.

1. Preparação para Cirurgia i <ol><li> Limpe os instrumentos cirúrgicos por sonicação em uma mistura de leite Maxizyme e cirúrgica em um líquido de limpeza ultra-sônica. Autoclavar os instrumentos cirúrgicos, antes de cada experiência. </li><li> Assegurar que todos os reagentes necessários e descartáveis ​​estão disponíveis. Uma lista de reagentes e produtos descartáveis ​​é fornecido na Tabela 2. Reagentes e produtos descartáveis ​​que entram em contacto com o tecido exposto deve ser estéril, quando possível. </li><li> Induzir a anestesia. Anestésicos típicos adequados para estudos de sobrevivência estão descritos na Tabela 1. Certifique-se de plano cirúrgico de anestesia, verificando, por falta de reflexo pitada pés. A idade óptima de rato é de 3 a 6 semanas de idade. Os crânios de ratos mais jovens são mais suaves e mais difícil de fina. Ratos mais velhos têm crânios mais espessos que vai sangrar mais durante o processo de desbaste. </li><li> Proteger o animal numa moldura estereotáxico 1. Uma lista de equipamento cirúrgico é fornecido na Tabela 2. </li><li> Manter o corpo temperatura a 37 ° C usando um gabarito sonda rectal e regulada almofada de calor. </li><li> Aplicar pomada oftálmica para os olhos para reter a umidade. </li><li> Raspar o couro cabeludo com um aparelho de barbear elétrico pequeno. </li><li> Limpar o couro cabeludo com Betadine, seguido por raspagem com 70% (v / v) de álcool isopropílico. </li><li> Se desejar, verificar que a freqüência cardíaca e respiração são dentro de uma faixa normal usando um oxímetro de pulso. Para um rato, estes números devem centro cerca de 10 e 2 Hz, respectivamente. </li><li> Aquecer uma aliquota de esterilizada por filtração fluido cerebral espinal artificial (ACSF) a 37 ° C (125 mM de NaCl, 10 mM de glucose, 10 mM de HEPES, 3,1 mM de CaCl2, 1,3 mM de MgCl2, pH 7,4) (todos os produtos químicos a partir de Sigma) 2. </li></ol> 2. A montagem de uma estrutura de cabeça <ol><li> Remover o couro cabeludo sobre toda a superfície craniana dorsal com um par de pinças e tesouras cirúrgicas. Aparar a pele lateralmente para as bordas dos músculos temporais em ambos os lados do crânio e póserior para os músculos do pescoço (Fig. 1A). </li><li> Usar uma lâmina de bisturi para remover o periósteo fina a partir da superfície do crânio. </li><li> Limpe o crânio com um algodão úmido o aplicador derrubado e secar a superfície do crânio com uma corrente de ar a partir de um pó pode. Em seguida, aplicar uma fina camada de cola de cianoacrilato para toda a superfície craniana. Deixe a cola secar completamente. Esta camada de cola é necessária para a aderência adequada do cimento dentário em passos subsequentes. A cola de cianoacrilato não precisa de ser esterilizado. </li><li> Anexar um conector de metal para a superfície do crânio, para longe da área da janela desejado. Para as preparações anestesiados, uma porca de pequeno pode ser fixado ao crânio com um pouco de cola de cianoacrilato, o qual pode mais tarde ser aparafusado no configuração de imagem utilizando um parafuso (Fig. 1B, 1L e 1N). Selar a parte de trás da porca com fita para garantir que a cola não entra os fios durante a fixação ao crânio. A porca ea fita devem ser esterilizados<html> em autoclave antes da cirurgia. </li><li> Para as preparações de imagem acordados, anexar um conector mais rígida personalizada com dois pontos de fixação (Fig. 1M e 1N). Faça dois furos no crânio sobre o hemisfério contralateral cortical com uma broca de ½ mm broca e, em seguida, introduzir dois # 000 parafusos auto-atarrachantes. Estes parafusos vai ajudar a ancorar a cabeça para montar o crânio. Aplicam-se apenas uma volta completa do parafuso, a fim de evitar a aplicação de pressão para o córtex subjacente. Em seguida, coloque a barra transversal personalizado de metal com uma pequena bagatela de cola de cianoacrilato sobre o cerebelo. Deixe a cola de cianoacrilato para secar completamente. Este conector de metal reduz grandemente os graus de liberdade e simplifica relocalização do campo de imagem mesmo em estudos longitudinais. Uma barra transversal de largura dá amplo espaço para a colocação do eletrodo e estimulação de vibrissas. Planos detalhados para gerar a montagem de cabeça personalizado e dispositivo de fixação estão disponíveis online (sics / links.html &quot;&gt; http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). Os parafusos e barra transversal devem ser esterilizados em autoclave antes da cirurgia. </li><li> Cobrir toda a superfície craniana, excluindo a localização da janela, com uma camada de cimento dentário (Fig. 1C e 1D). Assegure-se que todas as arestas expostas da pele são cobertas por cimento. Os componentes do cimento dental não precisa de ser esterilizado. </li></ol> 3. A Geração de um polido e reforçado afinado crânio-Window (portas) <ol><li> Certifique-se que as rebarbas de perfuração são nítidas e evitar a reutilização los. Usando uma baixa velocidade na broca dental, fino de 2 mm por 2 mm sobre a região do córtex somatossensorial com ½ mm rebarba. Alterne entre molhar o crânio com ACSF e depois secagem da superfície do crânio com uma ligeira corrente de ar de um espanador de gás; molhado para resfriamento e seca para o desbaste. Isto requer o desbaste através da camada esponjosa do crânio, que podem sangrar, mas pode ser controlled através de lavagem com ACSF (Fig. 1E). O crânio começa a flectir sob a pressão ligeira da broca, quando ele é de ~ 50 um, e os vasos Pial deve ser visível através do osso molhado (Fig. 1F). Neste espessura, pequenas manchas brancas no interior do osso se tornarão visíveis durante alguns segundos, imediatamente após a superfície do crânio seco é humedecida. </li><li> Neste ponto, o osso fina ainda mais. Use uma velocidade de perfuração, ou seja, 1000 rpm, que raspa a superfície craniana, com apenas um leve toque. Use pequenos movimentos controlados, mantendo a broca como uma caneta e só se aplica força no sentido lateral. O osso deve ser ~~~V 10 a 15 mM, na sua espessura final (Fig. 1G). Quando o osso é suficientemente fina, as manchas brancas pequenas no osso não será mais visível quando a superfície do crânio seco é humedecido. </li><li> Polir a região janela com pó de óxido de estanho. Anexar uma broca pré-fabricada que foi mergulhado em silicone selante aquário e comtraçadas, deixando um chicote cônico (inset, fig. 1H). O chicote de silicone deve ser preparado pelo menos um dia antes da cirurgia, e esterilizadas com 70% de isopropanol antes de usar. Colocar uma pitada de pó sobre a janela, juntamente com uma gota de ACSF (Fig. 1H). Agitar a suspensão sobre a janela de até dez minutos por tocar suavemente a ponta do chicote que se deslocam para a superfície do crânio. Lave afastado o pó de óxido de estanho completamente a partir da janela usando ACSF e secar o osso cuidadosamente com uma corrente suave de ar. Irregularidades de superfície e fragmentos de ossos aderentes deixados por perfuração nas etapas anteriores deve ser removida após o polimento (Fig. 1H e 1I). O pó de óxido de estanho não precisa de ser esterilizado. </li><li> Corte pedaços quadrados de nenhuma. 0 vidro de cobertura ligeiramente menor do que o tamanho da janela. Use um escriba, que gentilmente marcar separadas linhas horizontais e verticais na lamínula utilizando uma borda reta. Em seguida, coloque a lâmina de cobertura numa placa de Petri e knock o prato contra uma borda da mesa para separar as peças de vidro. A placa de petri inteira pode então ser autoclavados para assegurar a esterilidade. </li><li> Coloque uma tampa de vidro de tamanho adequado próxima janela a seco. Aplique uma pequena bagatela de cola de cianoacrilato sobre a janela com a ponta de um aplicador de ponta de madeira algodão quebrado, e rapidamente empurre a peça pré-cortados de tampa de vidro em cima da cola. Evite criar bolhas debaixo da tampa de vidro. Com cuidado, empurre a tampa de vidro contra a superfície do crânio, e segure por alguns segundos (Fig. 1J e 1O). Permitir que a cola seque completamente ao longo de 15 minutos. Cola de cianoacrilato em excesso pode ser removido da superfície superior da tampa de vidro com uma lâmina de bisturi depois é seca. Selar as extremidades da tampa de vidro com cimento dental e formar uma ligeiramente levantada bem a reter a água para a lente de imersão (Fig. 1K e 1O). </li></ol> 4. Recuperação <ol><li> Coloque o animal em uma cirurgia quente gaiola seguinte. Monitorar oanimais periodicamente até que ele se recupera totalmente da anestesia. </li><li> Se a preparação se destina a sobreviver por mais do que um dia, fornecer buprenorfina (0,03 mg por roedor g) para analgesia. Nós imagem tipicamente o animal, pelo menos, um dia após o implante inicial. </li></ol> 5. Preparação de imagens <ol><li> Estabilizar o animal em uma placa de montagem óptica para imagiologia, usando o quadro como um suporte para a cabeça (Fig. 1D e 1M). Um aparelho de retenção pode ser feita a partir de componentes disponíveis comercialmente a partir de optomechanical Qioptiq ou ThorLabs. A nossa chapa separada pode ser transportado entre conjuntos de imagem cirúrgicas e de dois fotões com o animal e todos os dispositivos de monitorização fisiológicas montados como uma unidade 3. </li><li> Se o fluxo de sangue de imagem for desejado, injectar 0,05 mL de 5% (w / v) fluorescente-dextrano corante dissolvida em solução salina estéril, quer através da veia da cauda ou da veia infraorbital para rotular do soro do sangue (Fig. 2A e 2C para 2H </strong&gt;) 4-7. Isso deve ser feito sob anestesia geral. Administração veia Infraorbital pode ser mais fácil para iniciantes, como soluções de dextrano são mais viscosos. A veia da cauda pode ser difícil localizar no escuro ratinhos coloridos, ea veia tende a colapsar após uma injecção falhou. Para imagem vasculatura com verde de emissão, usar um isotiocianato de fluoresceína dextrano. Para emissão vermelha, usar um Texas Red dextrano. Com altas dextranos de peso molecular, o corante permanecerão em circulação durante várias horas. Alternativamente, os animais com endógenos etiquetas fluorescentes podem ser visualizados directamente no comprimento de onda de excitação apropriada de dois fotões. A solução de dextrano pode ser congelada em alíquotas para utilização futura. </li><li> Limpe suavemente a superfície da janela com um algodão úmido o aplicador derrubado. </li><li> Para imagem prolongada de preparações anestesiados, injectar por via intraperitoneal de Ringer com lactato estéril da solução a um volume de 3 uL por grama a cada 2 horas para manter fluidos corporais e requisitos de energia. &lt;/ Li&gt; <li> Quando os animais de imagem no estado de vigília, limitar apoio de cabeça para apenas algumas horas em um momento de reduzir os níveis de estresse. Retornar o animal na gaiola casa entre as sessões de imagem por comida e água. </li></ol> 6. Os resultados representativos Uma janela de sucesso vai permitir profundidades de imagem até 250 uM abaixo da superfície pial durante vários meses. Este método tem sido utilizada para estudar in vivo o fluxo de sangue capilar 4, 8, a activação da microglia 8, 9, e uma estrutura dendrítica dentro do parênquima cortical 8. Num exemplo, usamos dois fotões de imagem para mostrar a vasculatura cortical de um rato anestesiado fluorescente proteína Thy1-amarelo (YFP), após o soro do sangue é rotulado por injecção intravenosa de Texas Red dextrano (Fig. 2A). Vasos durais muitas vezes são visíveis ligeiramente acima da superfície cortical na dura-máter (Fig. 2C, seta). Grandes arteríolas e vênulas Pial lie na superfície cortical (Fig. 2D). Ramo vasos penetrantes desta rede superfície e mergulhar no córtex, onde se ramificam em uma cama densa capilar que alimenta o tecido cortical (Fig. 2E a 2H). Arbors dendríticas de YFP profundo expressando neurônios corticais, um sinal endógeno para esta linha de mouse, podem ser visualizados simultaneamente em um segundo canal 10 (Fig. 2B a 2H). O sinal de segunda harmónica do osso foi recolhido num terceiro canal, e pode ser usado para medir a espessura do crânio diluído após a recolha de pilhas de imagens (Fig. 2A a 2C). Corticais dinâmica vasculares são profundamente afetados pelos anestésicos 11. Em um segundo exemplo, vamos mostrar um vídeo de vasoactivity espontânea coletados por microscopia de dois fótons de um rato habituado acordado. Oscilações vasomotores proeminentes no diâmetro do lúmen são vistos com uma arteríola pial, mas não com um vénula vizinho. Estefaixa basal de vasoactivity é diminuída com 4 anestesia com uretana. Para quantificar as mudanças espontâneas e evocadas no fluxo sanguíneo, usamos técnicas de exploração de linha adaptados para capturar tanto o diâmetro vascular e velocidade de células vermelhas do sangue dos vasos individuais. Detalhadas sobre recursos de imagem quantitativa do fluxo sanguíneo usando microscopia de dois fótons estão disponíveis 3, 12. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig1.jpg" /> Figura 1. Procedimento para uma janela Portas. (A K a) Imagens de passos seqüenciais no processo para gerar uma janela Portas. Veja o texto para instruções detalhadas. β = bregma e λ = lambda. (L) sistema de parafusos e porcas para fixar a cabeça durante o exame de preparações anestesiados. (M) Custom usinado montagem da cruzeta bar para os preparativos acordados. Neste exemplo, um conector também foi implantado para gravações electrocorticogram repetidas. (N)Diagrama esquemático mostrando a vista dorsal da cabeça e posição de montagem de vários componentes. A porca utilizada em L painel se entende como alternativa para a barra transversal usando no painel M. Dois # 000 parafusos auto-atarrachantes são adicionados com a barra transversal de montagem para maior estabilidade com os preparativos de imagem acordados. (O) Diagrama esquemático mostrando corte transversal de uma janela Portas. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem de dois fótons de estrutura vascular e neuronal no córtex do rato. Todas as imagens foram coletadas através de uma janela portas em um rato Thy1-YFP até 2 dias após o implante de janela 10. Projecção máxima mais de 150 uM de tecido na orientação coronal mostrando o crânio diluído em relação à vasculatura (A) e dendritos (B). O osso (azul) foi detectada através da recolha de fluorescência a segunda harmónica a 450 nm de emissão com 900 nm de excitação <sup&gt; 8. A vasculatura (vermelho) foi marcado por via endovenosa 70 kDa Texas Red dextrano 6. Os campos dendríticos de neurônios (verde) são endógenos para a linha do mouse Thy1-YFP transgênico. (CH) projeções máximas acima de 50 mM de tecido na orientação horizontal em diferentes profundidades abaixo da pia. De dados é a partir da pilha mesma imagem mostrada na Painéis A e B. vasos máter pode ser visível um pouco acima da superfície cortical (seta em C). Abreviaturas ACSF = fluido espinhal cerebral artificial PORTOS = janela crânio polido e reforçado diluído YFP = proteína amarelo fluorescente i Assegurar que os procedimentos descritos são aprovados por seu Animal Care institucional local e usar Comitê.

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Nada de divulgar.

Dois fótons de imagens através de uma janela Portas exige transmissão através do osso diluído e dura-máter, que atenua a luz do laser e adiciona aberrações ópticas em profundidades maiores 8. No entanto, apesar de este inconveniente, a profundidade de imagem até 250 um abaixo da superfície pial pode ser conseguido com 900 nm de excitação. Maiores profundidades de imagem podem, em princípio, seria possível com comprimentos de onda mais longos de excitação 13. Uma grande vantagem des...

<table border="1"><tbody><tr><td> Agente </td><td> Via de parto </td><td> Dose para mouse </td><td> Duração </td><td> Notas </td><td> Fonte </td><td> Ref Ref </td></tr><tr><td> Pentobarbital (Nembutal) </td><td> IP </td><td> 90 ug / g </td><td> 15-60 min </td><td> Estreita margem de segurança. Trabalhe até a dose adequada de anestesia lentamente. Suplemento de 10% da dose de indução, conforme necessário. </td><td> 036093; Butler Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Ketamina (Ketaset) misturado com Xilazina (Anased) </td><td> IP </td><td> 60 ug / g (K) 10 mg / g (X) (mistura na mesma seringa) </td><td> 20-30 min </td><td> Xilazina é co-injetado como um relaxante muscular e analgésico. Suplemento apenas Cetamina menos 50% da dose de indução, conforme necessário. </td><td> (K) 010,177, (X) 033,198; Butler Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Isoflurano (Isothesia) </td><td> Inalação </td><td> 4% significa a concentração alveolar (MAC) para a indução; 1-2% MAC para manutenção </td><td> 4-6 h. </td><td> Fornecidas em mistura de oxigénio de 70% e 30% de óxido nitroso. Anestesia prolongada leva a retardar a recuperação. </td><td> 029403; Butler Schein </td><td> 26 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Sugerida agentes anestésicos para estudos de sobrevida. <table border="1"><tbody><tr><td> ITEM </td><td> EMPRESA </td><td><strong&gt; catalogo MODELO / </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Butler Schein </td><td> 6906950 </td></tr><tr><td> Buprenorfina (Buprenex) </td><td> Butler Schein </td><td> 031919 </td></tr><tr><td> Isotiocianato de fluoresceína dextrano, 2 peso molecular MDa </td><td> Sigma </td><td> FD2000S </td></tr><tr><td> Álcool isopropílico </td><td> Pescador </td><td> AC42383-0010 </td></tr><tr><td> Solução de Ringer com lactato </td><td> Butler Schein </td><td> 009846; </td></tr><tr><td> Solução de lidocaína, 2% (v / v) </td><td> Butler Schein </td><td> 002468 </td></tr><tr><td> Salina </td><td> Butler Schein </td><td> 009861 </td></tr><tr><td> Leite cirúrgico </td><td> Butler Schein </td><td&gt; 014325 </td></tr><tr><td> Texas Red dextrano, 70 kDa de peso molecular </td><td> Invitrogen </td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Maxizyme </td><td> Butler Schein </td><td> 035646 </td></tr><tr><td> Descartáveis </td></tr><tr><td> Carbide rebarbas, tamanho do bico 1/2 mm </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 19007-05 </td></tr><tr><td> Cottoned aplicadores ponta </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-400-100 </td></tr><tr><td> Tampa de vidro, não. 0 espessura </td><td> Thomas Scientific </td><td> 6661B40 </td></tr><tr><td> Cola de cianoacrilato </td><td> ND Indústrias </td><td> 31428 H04308 </td></tr><tr><td> Espanador de gás </td><td> Newegg </td><td> N82E16848043429 </td></tr><tr><td> Pó de cimento aderência </td><td> Dentsply </td><td> 675571 </td></tr><tr><td> Punho de cimento solvente </td><td> Dentsply </td><td> 675572 </td></tr><tr><td> Seringa de insulina, 0,3 ml de volume com 29,5 agulha de calibre </td><td> Butler Schein </td><td> 018384 </td></tr><tr><td> Porcas e parafusos para fixar a cabeça </td><td> Digikey </td><td> Nut, H723-ND; parafuso, R2-56X1/4-ND </td></tr><tr><td> Pomada oftálmica </td><td> Butler Schein </td><td> 039886 </td></tr><tr><td> Lâminas de bisturi </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-460-448 </td></tr><tr><td> Parafusos, self-tapping # 000 </td><td> JI Empresa Morris </td><td> FF000CE125 </td></tr><tr><td> Selante de Silicone para aquário </td><td> Perfecto Manufacturing </td><td> 31001 </td></tr><tr><td> Pó de óxido de estanho </td><td> Minerais Mama </td><td> EQT-TINOX </td></tr><tr><td> EQUIPAMENTO </td></tr><tr><td> Escriba de vidro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-675 </td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção </td><td> Carl Zeiss </td><td> OPMI-1 FC </td></tr><tr><td> Broca elétrico movido a </td><td> Foredom ou Osada </td><td> K.1020 (Foredom) ou EXL-M40 (Osada) </td></tr><tr><td> Navalha elétrica </td><td> Wahl </td><td> Série 8900 </td></tr><tr><td> Fórceps, Dumont não. 55 </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Comentários almofada térmica regulada </td><td> FHC </td><td> 40-90-8 (termistor rectal, 40-90-5D-02; hcomer pad, 40-90-2-07) </td></tr><tr><td> Vaporizador de isoflurano </td><td> Ohmeda </td><td> IsoTec4 </td></tr><tr><td> Oxímetro de pulso </td><td> Starr Ciências da Vida </td><td> MouseOx </td></tr><tr><td> Chave de fenda, em miniatura </td><td> Garret Wade </td><td> 26B09.01 </td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> Kopf Instruments </td><td> Modelo 900 (com máscara de rato anestesia e não-ruptura barras de ouvido) </td></tr><tr><td> Tesoura cirúrgica, ponta romba </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 14078-10 </td></tr><tr><td> Limpador ultra-sônico </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-335-30 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Lista de reagentes específicos, descartáveis ​​e equipamentos.

a polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain

In vivo de imagem da função cortical requer acesso óptico para o cérebro sem interrupção do ambiente intracraniana. Nós apresentamos um método para formar um crânio polido e reforçado diluído (portas) janela no crânio do rato que se estende por vários milímetros de diâmetro e é estável durante meses. O crânio é diluído para 10 a 15 uM de espessura com uma mão de broca para alcançar claridade óptica, e é então revestida com cola de cianoacrilato e uma tampa de vidro para: 1) proporcionar rigidez, 2) inibir crescimento do osso e 3) reduzir a dispersão de luz a partir de irregularidades na superfície do osso. Uma vez que o crânio não seja ultrapassado, qualquer inflamação que pode afetar o processo que está sendo estudado é bastante reduzido. Profundidades de imagem de até 250 uM abaixo da superfície cortical pode ser conseguido usando dois-fotão microscopia laser scanning. Esta janela é bem adequado para estudar o fluxo sanguíneo cerebral e da função celular, tanto em preparações anestesiados e acordado. Além disso, oferece a optunidade para manipular a atividade das células usando optogenetics ou para interromper o fluxo de sangue nos vasos alvo de irradiação de fotossensibilizadores circulando.

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A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

Nós apresentar um método para formar uma janela de imagem no crânio do rato que se estende por milímetro e é estável durante meses sem inflamação do cérebro. Este método é bem adequado para estudos longitudinais de fluxo de sangue, a dinâmica celular, e as células / estrutura vascular utilizando dois fotões microscopia.

A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

a-polished-reinforced-thinned-skull-window-for-long-term-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.7K visualizações.  University of California, San Diego. Nós apresentar um método para formar uma janela de imagem no crânio do rato que se estende por milímetro e é estável durante meses sem inflamação do cérebro. Este método é bem adequado para estudos longitudinais de fluxo de sangue, a dinâmica celular, e as células / estrutura vascular utilizando dois fotões microscopia.

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imagem crônica de rato Visual Cortex usando uma preparação diluída crânio-

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Neurociência

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Microscopia intravital da Microcirculação cérebro de camundongo usando uma janela fechada Cranial

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiplas mouse-Imagem por Ressonância Magnética neuroanatômicos

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

Formação extinção durante a janela de reconsolidação impede a recuperação do Medo

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Diluído crânio-técnica de janela cortical para<em&gt; Em Vivo</em&gt; Tomografia de coerência óptica

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

Melhoria da preparação e preservação de fatias do hipocampo de camundongos para uma gravação muito estável e reprodutível de potenciação de longa duração

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...