Gostaríamos de agradecer a G. O Toole para orientação e sugestões no desenvolvimento destes modelos. Este trabalho foi financiado pela Cystic Fibrosis Foundation (ANDERS06F0 ao GGA, STANTO07RO e STANTO08GA a BAS), os Institutos Nacionais de Saúde (T32A107363 para GGA e R01-HL074175 a BAS) e do Centro Nacional de Centros de Pesquisa de Recursos para a Excelência Investigação Biomédica (COBRE P20-RR018787 a BAS).

1. Modelo Biofilm estática co-cultura <ol><li> O modelo de biofilme estática cultura Co-1 usa CFBE41o células (células CFBE), que são imortalizadas células originalmente desenvolvido a partir de um indivíduo com homozigotos CF para a mutação DF508-CFTR 2,3,4. Células CFBE deve ser semeado a uma concentração de 10 6 células / poço em uma placa de cultura de 6 bem tecido ou 2 X 10 5 em uma placa de cultura de 24 poços de tecidos em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2mM de L-glutamina, 50 U / mL de penicilina, e 50 mcg / mL estreptomicina. Usamos 1,5 mL médio por poço em placas de 6 poços e 0,5 mL médio por poço em placas de 24 poços. </li><li> Células devem ser cultivadas a 37 ° C e 5% de CO 2 do ar -95% por 7-10 dias para formar uma monocamada confluente antes da inoculação com bactérias. O meio deve ser trocada a cada 2-3 dias. Essas condições foram mostradas para levar à formação de uma monocamada confluente e tight junctions. </li><li> Crescer P. aeruginosa em 5 mL LB por 18 horas a 37 ° C num agitador estufa a 200 rpm. Sob essas condições, P. culturas aeruginosa tipicamente atingir uma densidade de 5x10 9 UFC / mL. </li><li> Para a inoculação bacteriana, remova a mídia a partir de células CFBE e adicionar igual volume de MEM sem vermelho de fenol, suplementado com 2 mM L-glutamina (médio Microscopy). Monocamadas confluentes CFBE são inoculadas com P. aeruginosa em uma multiplicidade de infecção de cerca de 30:1 em relação ao número de células CFBE originalmente semeada. Isso equivale a 2 X 10 7 UFC / mL em 1,5 mL MEM / bem para 6-bem placas e 1,2 X 10 7 UFC / mL em 0,5 mL MEM / bem para placas de 24 poços. </li><li> Incubar as placas durante 1 hora a 37 ° C e 5% CO 2% -95 ar. </li><li> Após a incubação de 1 hora, o sobrenadante deve ser removido e substituído por meio de Microscopia fresco suplementado com arginina de 0,4%. </li><li> Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 do ar 95% para vários pontos do tempo (até cerca de 8 horas) e analisar a integridade da monocamada CFBE meio de microscopia de contraste de fase. Se as células das vias aéreas não são confluentes, P. aeruginosa irá rapidamente (em minutos) ter acesso à superfície basolateral das células e destruir a integridade celular. Inoculação com P. cepas aeruginosa que constitutivamente expressa resultados GFP em microcolônias biofilme fluorescentes que podem ser visualizados por microscopia de epifluorescência ou confocal. </li><li> O CFU bacteriana no biofilme pode ser determinado através de lavagem a co-cultura 2-3 vezes com tampão fosfato (PBS) para eliminar bactérias planctônicas. Após a lavagem, o tratamento com 0,1% Triton X-100 em PBS ou MEM por 10-15 minutos para lisar as células epiteliais e dispersar o biofilme. </li><li> Vortex por 3 minutos e preparar diluições de série do lisado. Placa dessas diluições em ágar LB e incubar durante a 37 ° C. Contar as colónias no dia seguinte para determinar o UFC. </li></ol> 2. Célula de fluxo Modelo Biofilm Co-cultura <ol><li> O fluxo de células Modelo Biofilm co-cultura (ensaio de fluxo) envolve a modificação do padrão de aparelho celular biofilme fluxo para acomodar células CFBE 5. </li><li> Coloque vários de 40 mm de diâmetro lamínulas de vidro em um copo de 100 mL limpo. Cubra firmemente com duas camadas de papel alumínio e autoclave em um ciclo de seca por 20 min. </li><li> Trabalhando em uma capa de cultura de células, pegue uma lamela estéril do copo com a pinça de etanol lavados e coloque em um prato de plástico estéreis de 60 mm de diâmetro. </li><li> Adicionar 3 mL de pré-aquecido meio de crescimento celular, pressionando a lamela com a ponta da pipeta para remover qualquer bolha preso debaixo e forçar a lamínula para o fundo do prato de plástico. </li><li> Semente de 2x10 6 células por prato e agitar suavemente o prato e para trás. Evitar agitação para evitar a centrifugação as células contra os lados do prato. </li><li> Coloque o prato em um 5% de CO 2 a 95% do ar incubadora a 37 ° C e alimentar as células a cada dois dias com 3 mL meio de cultura fresco para 8 a 10 dias. As células formam uma monocamada confluente na lamela de vidro. </li><li> Crescer P. aeruginosa em 5 mL LB por 18 horas a 37 ° C num agitador estufa a 200 rpm. Sob essas condições, P. culturas aeruginosa tipicamente atingir uma densidade de 5x10 9 UFC / mL. Usamos P. PAO1 tensão aeruginosa carregando o plasmídeo pSMC21 para expressão constitutiva de GFP 6. </li><li> Adicionar 1 mL da cultura bacteriana em um tubo de microcentrífuga estéril. Centrifugar a 6000 rpm por 3 min e lavar o pellet bacteriano duas vezes em 1 mL de meio de Microscopia. </li><li> Diluir 0,5 mL de bactérias lavadas e ressuspendidas em 4,5 mL de médio Microscopia para alcançar uma concentração de ~ 5x10 8 UFC / mL. </li><li> Observação de células vivasem tempo real requer uma câmara de imagem acoplado a uma bomba peristáltica (para assegurar um fluxo de nutrientes para longos períodos de tempo) e um controlador de temperatura. Usamos o FCS2 Bioptechs (Focht Live Cell) câmara ligada a um baixo fluxo de perfusão micro-bomba com 1 / 16 º corte tubos C-flex para comprimentos apropriados e autoclavada para esterilidade, e com temperatura regulada através do controlador da câmara FCS2. Mantemos a fonte de entrada de meio em banho-maria a 37 ° C situado ao lado do microscópio. </li><li> Montar a câmara de fluxo. A câmara de FCS2 inclui uma base auto-locking (que se senta no palco durante adaptador de imagem) e uma metade superior conectados aos tubos de perfusão eo controlador de câmara. A câmara é montado de cabeça para baixo antes de ser virado e colocado no adaptador palco. Segure a parte superior da câmara de cabeça para baixo, para que os tubos de perfusão são visíveis, e alinhar os furos de folga de uma junta de borracha 0,75 mm de espessura em tubos de perfusão. Stack o slide microaqueduct fornecido com a câmara em cima da vedação de borracha, certificando-se o lado da ranhura é para cima, e colocar outra junta de borracha no topo do slide. A espessura e geometria interna desta segunda vedação irá determinar o volume da câmara. Nós normalmente trabalham com uma junta de borracha 0,75 mm de espessura com 30 mm de geometria interna rodada. </li><li> Adicionar 1 mL da pré-aquecido (37 ° C) Microscopia médio no centro do slide. </li><li> Recuperar um prato de 60 mm da cultura de células incubadora, remova a mídia passou e lavar as células uma vez com 3 mL de pré-aquecido médio Microscopia. Essa etapa assegura a eliminação do vermelho de fenol e antibióticos presentes no meio de crescimento celular. Vermelho de fenol é levemente fluorescente e pode interferir com a imagem, enquanto que os antibióticos podem erradicar P. aeruginosa bactérias antes que possam estabelecer biofilmes. </li><li> Uso do etanol lavado fórceps, recuperar a lamela do prato e abaixá-lo de cabeça para baixo sobre o talão de meio de Microscopia colocado na câmara. A lamela está agora descansando sobre a junta de borracha segundo e monocamada de células das vias aéreas é voltado para baixo. </li><li> Segurando os componentes montados em uma mão, coloque a base da câmara no topo da pilha, e ligue a câmara mais rápida para que tudo fique do lado certo. Bloqueio da base no lugar, girando o anel. </li><li> Ligue o tubo de admissão do baixo fluxo de perfusão micro-bomba e iniciar o fluxo a uma taxa de 20 mL / h, este fluxo está dentro da capacidade de velocidade de natação do P. aeruginosa. A segunda parte de links tubulação da bomba para um balão de meio de Microscopia colocado no 37 ° C banho de água localizado ao lado do microscópio. </li><li> Anexar estéril pré-cortados 16/01 º C-Flex tubulação para a entrada e tubos de perfusão tomada da câmara, ligar o controlador de temperatura, em seguida, coloque a câmara montada no palco de um microscópio microscópio invertido de fluorescência. </li><li> Usando uma seringa descartável de 1 ml, injetar a suspensão bacteriana previamente preparado para a câmara, usando uma válvula de duas vias colocada em linha entre a bomba ea câmara. Em nosso meio particular, é preciso um volume de 0,6 mL de suspensão bacteriana para alcançar a câmara. Ajustar este volume de acordo com o seu comprimento da tubulação particular. Também achamos útil fazer um in-line descartáveis ​​0,22 mM de filtro entre a bomba ea válvula de duas vias para evitar que as bactérias de nadar contra a corrente e contaminando o balão de entrada. </li><li> Para permitir que as bactérias para anexar as células das vias aéreas, parar a bomba de 2h. O fluxo pode então ser reiniciado e mantido a 20 mL / h para o resto do experimento. </li><li> Monitorar a integridade das células das vias aéreas pelo contraste de interferência diferencial (DIC) de microscopia durante todo o experimento para verificar se há sinais de danos à monocamada. Ao mesmo tempo, acompanhar o desenvolvimento da GFP-rotulados P. biofilmes aeruginosa na superfície apical das células das vias aéreas através da aquisição de imagens com um microscópio de fluorescência confocal invertida ou wide-campo. </li></ol> 3. Resultados representante Nós usamos uma linhagem de P. aeruginosa contendo o plasmídeo pSMC21 que permite a expressão constitutiva de GFP 6. Por esta razão, GFP-rotulados biofilmes crescem em uma monocamada CFBE podem ser visualizados por microscopia de epifluorescência. Alternativamente, a visualização do biofilme pode ser alcançado através da coloração P. unlabeled aeruginosa com um 1% de solução branca calcofluor por 1 hora a 37 ° C 1. Para imagens de formação de biofilme sobre as células CFBE no ensaio de fluxo, nós usamos um adaptador de estágio feito por encomenda, mas várias empresas podem agora fornecer adaptadores palco especialmente montado. Trabalhamos com uma Olympus IX70 microscópio invertido equipado com um profundo arrefecimento ORCA-AG câmera CCD e um x60 objetivo óleo de imersão (abertura numérica 1.40). O filtro wcalcanhar é equipado com um filtro de banda 480/40 nm de excitação e um pass 535/30 nm banda do filtro de emissão passar. Imagens digitais foram adquiridas com o pacote de software OpenLab 4.0.3 (Improvisação) e volumes foram deconvolved por iterativa restauração usando o software 3.5.1 Volocity (Improvisação). Análise quantitativa de estruturas 3D biofilme foi alcançada com o pacote de software de análise de imagem COMSTAT 7,8. Para qualquer modelo de co-cultura considerada, deve-se prestar especial atenção ao desenvolvimento de citotoxicidade entre os componentes do modelo. Em ambos os estáticos e os ensaios de célula de fluxo, descobrimos que a monocamada CFBE poderia suportar a presença de P. aeruginosa por até 8 horas após a inoculação, sem qualquer sinal de alteração. Integridade monocamada epitelial pode ser avaliada por microscopia de contraste de fase utilizando um microscópio invertido 1 (Figura 1A) ou por microscopia de interferência diferencial contraste (DIC) durante todo o experimento 5. Ao longo do tempo, P. aeruginosa irá produzir toxinas e fatores de virulência que se acumulam e podem danificar a monocamada de células epiteliais na totalidade ou em seções (Figura 1B 1C). Citotoxicidade pode ser quantitativamente avaliada utilizando vários kits para medir a liberação de lactato desidrogenase (LDH) de células epiteliais. LDH é uma enzima citosólica estável lançado no meio extracelular sobre a lise celular ou morte celular. Quando a integridade da monocamada das vias aéreas não seja comprometida (normalmente para a inoculação h ~ 8 seguinte), P. biofilmes aeruginosa pode formar e desenvolver com sucesso na superfície apical das células das vias respiratórias em ambos os co-cultura modelos descritos (Figura 2A-2B). Após a reconstrução 3D (Figura 2C) e quantificação, acúmulo de biomassa pode ser determinada com precisão. Temos também usou esses biofilmes co-cultura em vários ensaios fenotípicos. Por exemplo, como mencionado acima, biofilme UFC pode ser facilmente determinado pela lise das células epiteliais, em série diluir o lisado, e plaqueamento em placas de ágar. Nós descobrimos que esta técnica vantajosa em determinar a resistência de diferentes linhagens ao tratamento com antibióticos. Além disso, o biofilme toxicidade para as células epiteliais podem ser medidos utilizando kits de detecção disponíveis comercialmente LDH. Desta forma, o papel de fatores de virulência em toxicidade de biofilmes pode ser avaliado. Estes sistemas modelo também apoiar uma série de aplicações de expressão gênica, incluindo estudos de promotor de fusão, RT-PCR e análise de microarray 1,5,9. <img src="/files/ftp_upload/2186/2186fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Monocamada de células CFBE e imagens representativas de comprometida e danificada monocamadas de células das vias aéreas devido a P. aeruginosa crescimento do biofilme. (A) Imagem representativa de uma monocamada confluente de células cultivadas em placas CFBE cultura de tecidos, avaliada por microscopia de contraste de fase. Barra de escala, 120 mM. (B) Exemplo de uma monocamada CFBE comprometida. Mesmo que a monocamada não exibe óbvio sinais visíveis de danos ainda, P. bactérias aeruginosa são vistos espalhando entre o tight junctions das células epiteliais e de acesso a ganhar para as membranas basolateral. Formação de biofilme normalmente não é alcançado sob essas condições, devido à deterioração da monocamada. Barra de escala, 20 mM. (C) Exemplo de uma p. overgrown biofilme aeruginosa observadas 24 h após a inoculação. Após o sucesso de apoiar a formação de biofilme, a monocamada CFBE foi danificado além do reparo e agora está praticamente ausente. Biofilme residual, crescendo como uma camada lisa de bactérias, é mostrado inerentes às lamela de vidro. Barra de escala, 20 mM. <img src="/files/ftp_upload/2186/2186fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. P. biofilmes aeruginosa cresceu na superfície apical das células confluentes CFBE usando o modelo de biofilme estática co-cultura e do fluxo de células Modelo Biofilm Co-cultura. imagem (A) Representante de uma p. expressando GFP- biofilme aeruginosa cultivada em uma monocamada confluente de células CFBE usando o modelo de biofilme estática Co-cultura, avaliada por microscopia de epifluorescência. Imagem é uma sobreposição do canal de contraste de fase eo canal de fluorescência. Barra de escala, 35 mM. (B) Imagem representativa de um P. GFP-rotulados biofilme aeruginosa cresceu para 6 h em uma monocamada confluente de células CFBE usando o fluxo de células Modelo Biofilm Co-cultura. Para facilitar a visualização da monocamada das vias aéreas, os núcleos foram corados com 10 mcg / mL Hoechst 33342 (Molecular Probes) por 30 min antes da inoculação com P. aeruginosa. Imagens fundidas e pseudocolored eram vistos por contraste de interferência diferencial (DIC), e as imagens correspondentes fluorescentes são mostrados. Biofilmes, apresentando-se como aglomerados verdes junto à superfície apical das células CFBE, estão dispersos através das células das vias aéreas. Barra de escala, 20 mM. (C) reconstrução tridimensionalção de pilhas z-series imagem que mostra o típico cogumelo-como estruturas de 6 h de idade P. biofilmes aeruginosa formando sobre uma monocamada de células CFBE. Barra de escala, 10 mM.

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

Biofilmes são comunidades de bactérias que se formam em resposta a estímulos ambientais. Estes sinais ambientais globais levar a mudanças regulatórias dentro de cada bactéria, resultando na ligação a uma superfície, de agregação, a produção de exopolissacarídeos, e outros fenótipos, tais como aumento da resistência aos antibióticos 10. Ao longo das duas últimas décadas, muitas provas apoiou a hipótese de que biofilmes desempenham um grande papel na patogênese das infecções crônicas. Po...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FCS2 (Focht Live-Cell) chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>060319131616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FCS2 chamber controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>060319-2-0303</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40 mm glass coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>PH 40-1313-0319</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>#10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM without phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

co-culture models of pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells

Biofilme bacteriano têm sido associados com um número de diferentes doenças humanas, mas o desenvolvimento de biofilme geralmente tem sido estudada em superfícies não-vivos. Neste artigo, descrevemos os protocolos para formar biofilmes de Pseudomonas aeruginosa nas células epiteliais das vias aéreas humanas (células CFBE) cultivadas em cultura. No primeiro método (chamado de modelo de biofilme estática Co-cultura), P. aeruginosa é incubada com células CFBE crescido como monocamadas confluentes em placas de cultura de tecido normal. Embora a bactéria é muito tóxico para as células epiteliais, a adição de atrasos arginina a destruição da monocamada tempo suficiente para formar biofilmes sobre as células CFBE. O segundo método (chamado de fluxo de células Modelo Biofilm Co-cultura), envolve a adaptação de um aparelho celular biofilme fluxo, que é frequentemente usado em biofilme de pesquisa, para acomodar uma lamela de vidro apoiar uma monocamada confluente de células CFBE. Este monocamada é inoculado com P. aeruginosa e uma bomba peristáltica, então, flui meio fresco através das células. Em ambos os sistemas, biofilme bacteriano forma dentro de 6-8 horas após a inoculação. Visualização do biofilme é reforçada pelo uso de P. cepas aeruginosa constitutivamente expressando a proteína verde fluorescente (GFP). A estática e fluxo de células ensaios Co-cultura de biofilme são sistemas modelo para P. início aeruginosa infecção do pulmão da fibrose cística (CF), e estas técnicas permitem diferentes aspectos da P. formação de biofilme e virulência aeruginosa a ser estudado, incluindo a citotoxicidade biofilme, a medição do biofilme UFC, e de coloração e visualização do biofilme.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Este artigo descreve métodos diferentes de crescimento<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Biofilmes em cultura de células epiteliais das vias aéreas humanas. Estes protocolos podem ser adaptados para estudar diferentes aspectos da formação de biofilme, incluindo a visualização do biofilme, a coloração do biofilme, medindo a unidades formadoras de colônias (CFU) do biofilme e estudar a citotoxicidade biofilme.

Co-cultura de Modelos Pseudomonas aeruginosa Biofilmes Grown no Live Células Airway Humanos

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

co-culture-models-pseudomonas-aeruginosa-biofilms-grown-on-live-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

22.1K visualizações.  Dartmouth College. Este artigo descreve métodos diferentes de crescimento Pseudomonas aeruginosa Biofilmes em cultura de células epiteliais das vias aéreas humanas. Estes protocolos podem ser adaptados para estudar diferentes aspectos da formação de biofilme, incluindo a visualização do biofilme, a coloração do biofilme, medindo a unidades formadoras de colônias (CFU) do biofilme e estudar a citotoxicidade biofilme.

Vídeo: Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa e Saccharomyces cerevisiae Biofilme em Células de Fluxo

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Imunologia e Infecção

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolamento de RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizar o trato gastrointestinal Murino

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Lesão Pulmonar Induzida Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

Replicação do requisitado, biblioteca não redundante de estirpe Pseudomonas aeruginosa PA14 Transposon mutantes de inserção

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Métodos para detecção de citotóxicos amiloides seguir infecção de pulmonar células endoteliais por Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

Cultura de Variante de Pequena Colônia de Pseudomonas aeruginosa e Quantitação de seu Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica de pseudomonas aeruginosa ferida

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. aeruginosa Co-Cultura 3D infectada de células epiteliais e macrófagos bronquiais na interface ar-líquida para avaliação pré-clínico de anti-infecciosos

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Co-cultura de Modelos Pseudomonas aeruginosa Biofilmes Grown no Live Células Airway Humanos

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