Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave, sobre o desenvolvimento de biofilmes, como como identificar as principais condições ambientais, que afetam o crescimento de biofilmes e características comportamentais durante o desenvolvimento. A principal vantagem dessa técnica é que as placas multicanalizadas e micro fluidicas permitem a rápida aquisição de resultados estatisticamente significativos. Embora este método possa fornecer insights sobre a estrutura de biofilme, ele também pode ser aplicado ao estudo de tratamentos antibióticos e bioremediação.
Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão, pois é necessária uma atenção cuidadosa aos detalhes do protocolo e às habilidades meticulosas. Para evitar um erro da conexão do instrumento com o software, ligue primeiro a estação de trabalho do PC, seguido do módulo de fluorescência. Certifique-se de que o obturador de fluorescência está ligado e ligue os controladores de hardware.
Em seguida, ligue o controlador do sistema de imagem e a câmera CCD. Então ligue a estação de imagens. Quando todo o equipamento estiver pronto, inicie a aplicação do controle e digite o número da placa, localizado na etiqueta na lateral da placa.
Para escorraçar, primeiro remova a placa micro fluidíica 48 da embalagem, sem tocar na superfície do vidro na parte inferior da placa, e limpe o deslizamento de vidro na parte inferior da placa, com um tecido de lente. Para preparar os canais micro-fluidos, pipetas 200 microliters de 37 graus celsius meio mínimo para o poço de saída, tomando cuidado para evitar bolhas. Em seguida, coloque a placa no palco da placa.
Limpe a interface com etanol, selando-a no palco da placa assim que o etanol secar. No modo manual no módulo de controle, ajuste o fluido como caldo luria-bertani a 37 graus celsius, e máximo como cinco dym por centímetro quadrado. Clique nos poços de saída para ativar o fluxo da saída para o poço de entrada, para prime os canais.
Após cinco minutos, pause o fluxo para se preparar para a semeadura e retire cuidadosamente a placa do palco. Em seguida, aspire qualquer meio residual do poço de saída sem remover qualquer meio do círculo interno que leva aos canais micro-fluidos. Para semear os canais experimentais, adicione 300 microliters de meio mínimo no poço de entrada, seguido pela adição de 300 microliters de cultura bacteriana, no poço de saída.
Volte a placa para o estágio de imagem certificando-se de limpar a interface com etanol antes de colocá-la na placa, e use o feed da câmera ao vivo para se concentrar em um único canal. Enquanto monitora visualmente a transmissão ao vivo, retome o fluxo de 1 a 2 centímetros quadrados por aproximadamente 2 a 4 segundos, para permitir que as células entrem no canal experimental, mas não nos canais serpentinos, e deixe a placa no estágio controlado pela temperatura por uma hora, para permitir que as células se conectem. No final do período de fixação, remova cuidadosamente a placa do estágio e aspire bem as bactérias da saída sem perturbar o canal.
Em seguida, use uma nova ponta de pipeta para remover o meio dos poços de entrada. No software, abra aquisição multidimensional para controlar a aquisição de imagens do microscópio e selecione o lapso de tempo, posições de estágio múltiplo e múltiplos comprimentos de onda. Na guia de salvar, crie um nome base simples, certificando-se de que o nome base de incromentos se o arquivo existir, seja verificado.
Inclua quaisquer detalhes essenciais do experimento na descrição. Clique no diretório de seleção, para selecionar a pasta em que todos os arquivos serão salvos Na guia lapso de tempo, ajuste a duração do tempo experimental, para 24 horas e defina o intervalo de tempo para adquirir imagens a cada cinco minutos ao longo do experimento. Use o feed de câmera ao vivo e o objetivo de 10x para definir as posições do palco, com foco no centro do canal, localizado acima ou abaixo dos números do canal gravados na placa.
Mude para o objetivo de 20x, e localize a área de visualização ideal e o plano focal dentro do canal. Em seguida, adicione a posição do palco à lista com as novas configurações. Sob o menu de comprimentos de onda, defina o número de comprimentos de onda para 3, e defina o primeiro comprimento de onda para a câmera FITC 100%, com um tempo de exposição de dez milissegundos, o segundo comprimento de onda para brightfield 50% câmera 50% visível, com um tempo mínimo de exposição de 3 milivrégus e o terceiro comprimento de onda para todos fechados, de modo que nenhuma luz permanece no último canal entre os tempos de aquisição.
No menu editar AutoRun, abra a guia de configuração do protocolo e defina um novo protocolo com uma duração de 24 horas com o fluxo definido na direção dianteira na taxa de cisalhamento experimental apropriada. Clique em adicionar e salvar para salvar o protocolo e abra a guia de configuração de sequência. Para configurar uma nova sequência, selecione o caldo Luria-Bertani a 37 graus, como o fluido padrão para todos os canais.
Sob a iteração passo 1 para os canais 1 a 12, selecione o protocolo com a primeira taxa de tesoura experimental e habilite todos os canais. Para os canais 13 a 24, selecione o protocolo com a segunda taxa de tesoura experimental e habilite todos os canais. Em seguida, selecione Aplicar e Salvar Como, para salvar a sequência e abrir o menu AutoRun para selecionar a sequência salva a ser usada para o AutoRun.
Para configurar o experimento de biofilme de crescimento cronometrado, adicione até 1300 microliters de meio mínimo estéril no poço de entrada da placa micro-fluidica, e devolva a placa ao estágio de imagem. Em seguida, limpe a interface com etanol e sele a placa. Confirme se os protocolos e sequências estão configurando corretamente.
Selecione iniciar, iniciar o AutoRun e clique imediatamente em adquirir para iniciar a coleção de imagens do microscópio. No final da primeira aquisição de imagem, clique em pausa e selecione o modo de imagem ao vivo no comprimento de onda brightfield. Selecione ir para visualizar cada posição do estágio e selecione definir para corrente, para definir as novas configurações.
Em seguida, clique em retomar, antes de iniciar a próxima aquisição programada. Neste experimento representativo de crescimento de biofilmes cronometrado, a cobertura de biofilm, ou área de superfície de limiar percentual, foi diferente para todas as três configurações de tesoura, indicando que a tesoura teve influência direta na cobertura da superfície do biofilme. A medição relativa total do acúmulo de biofilme, aumentou em função do tempo, com a taxa de crescimento caindo do maior estresse de tesoura para o menor estresse de tesoura.
Em cada condição, houve também um período claro de crescimento exponencial a partir do qual uma taxa de crescimento quantitativo poderia ser calculada. No geral, o coeficiente de rugosidade diminuiu ao longo do tempo em todas as condições de corte, indicando que todas as superfícies do biofilme ficaram mais suaves. No entanto, em comparação com a cisalhamento mais baixo, as configurações mais altas da cisalhamento resultaram em uma superfície mais lisa ao longo do tempo, indicando que um fluxo de cisalhamento mais rápido contribui para uma superfície mais suave e uniforme.
Além disso, a entropia textural, ou a aleatoriedade na morfologia, aumentou ao longo do tempo para todas as condições de tesoura. Ao realizar este procedimento é importante lembrar de seguir a sequência especificada e aproveitar o tempo para realizar cada passo com precisão. As habilidades necessárias podem levar algumas corridas para dominar.
Após esse procedimento, outros métodos, como HBLC ou GCMS, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre as concentrações de substraís, como a glicose, sendo consumidas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo dos biofilmes explorarem ambientes de fluxo geral em tempo real com condições experimentais controladas e amostragem de hidroterapia. Não se esqueça, que trabalhar com cepas bacterianas BSL2 pode ser extremamente perigoso, e que precauções como usar equipamentos de proteção adequados e usar protocolos de resíduos adequados devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
