O nosso trabalho foi possível graças ao apoio financeiro do Fundo de Dotação McKnight for Neuroscience (PAS), do Instituto Nacional do Abuso de Drogas (R01 DA019022; PAS) e uma pré-doutoramento NIH NRSA bolsa para PA (F31AA017042) do Instituto Nacional de Abuso do Álcool e Alcoolismo. O mutante GIRK2-L257W foi fornecido pelo Dr. Prafulla Aryal. Microscópio de fluorescência e patrocínio gentilmente cedido pela Leica Instruments.

1. Site Dirigido Mutagênese Usamos a expressão de mamíferos pcDNA3.1 plasmídeo um cDNA para GIRK2 e introduzir uma mutação pontual usando Stratagene (Agilent Technologies) Quikchange XL II sítio-dirigida mutagênese kit, de acordo com as instruções do fabricante. Seqüência de primers podem ser facilmente gerados usando o programa de design online cartilha disponível em: <a href="https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15">https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15</a> Nota: Usamos padrão Eppendorf tubos de 1,5 mL no lugar de BD 14 tubos mL descrita no protocolo. No entanto, o uso de XL10-Gold E. ultracompetent coli pré-tratados com β-mercaptoetanol, 30s tempo de choque térmico e NZY + (ou NZYM +) media são críticos para o sucesso mutagênese. Se possível, engenharia de uma mutação adicional silenciosa que cria um site nova restrição pode ser conveniente para a triagem colônias mutantes abaixo. 2. Miniprep, seqüenciamento de DNA e Maxiprep 2,1 Qiagen miniprep e seqüenciamento. Individuais colônias bacterianas são colhidos e cultivados em caldo LB com ampicilina (AMP). Seguimos as instruções do fabricante para purificar o cDNA. Um digest restrição simples pode ser usada confirmar a introdução bem sucedida da mutação, se um sítio de restrição é incorporada no passo 1 acima. Automatizados de seqüenciamento de DNA é feito fora do local, e é essencial para confirmar a presença da mutação no DNA, bem como avaliar se há qualquer mutação indesejada. Este passo é muito importante. Nós seqüência a seqüência GIRK toda codificação usando frente e verso T7 promoter BGH primers de seqüenciamento que o flanco sítio múltiplo de clonagem do plasmídeo pcDNA3.1. Nota: É importante inspeccionar cuidadosamente o electroferograma seqüenciamento suficiente para garantir a qualidade dos dados de seqüenciamento. Electroferograma de alta qualidade tem nítidas, sem sobreposição picos com ruído de fundo pouco. 2,2 maxiprep Qiagen. Seguimos as instruções do fabricante. Nota: Esta etapa é incluída em nossos experimentos para melhorar a pureza do cDNA, o que encontramos é importante para a transfecção eficiente. 3. Cultura e transfecção de células HEK293T Todas estas etapas devem ser feitas em uma capa estéreis de cultura de tecidos. 3,1 de cultura de células HEK293T células são fáceis de usar, porque eles são fáceis de cultura (37 ° C, 5% CO 2 incubadora umidificada), tem tempo de replicação rápida, a eficiência de transfecção alta e são passíveis de células inteiras eletrofisiologia patch-clamp. Células HEK293T expressar SV40 antígeno T grande que garante a replicação epissomal de pcDNA3.1 plasmídeo. HEK293T células são cultivadas em baixa de glicose DMEM meio suplementado com L-glutamina e 10% soro fetal bovino (FBS). Para as células passaging, adicionar 0,25% de tripsina / EDTA para as células confluentes (90-95%) HEK293T, espere até que as células destacar do prato tecido, então pare a atividade da enzima através da adição de novas mídias contendo FBS /. Placa ~ 1 X 10 5 células / poço em uma placa de cultura de células de 12 poços, juntamente com 1 mL de mídia livre de antibióticos cultura por poço. (1 X 10 5 células é de aproximadamente 350 mL de suspensão de células obtidas a partir frasco T25 confluentes ressuspendido com 10 mL de mídia). 3,2 Transfection Após 24/08 horas, as células HEK irá aderir ao plástico e estão prontos para transfecção. Transfecção de células com 0,2 mg canal cDNA, 0,4 g M2R YFP mg receptor cDNA e 0,04 cDNA usando Invitrogen Lipofectamine 2000. Nota: usamos uma pequena quantidade de cDNA YFP para determinar quais células são sucesso transfectadas (células verdes provavelmente irá conter ambos os canais GIRK e receptores M2). A concentração de cDNA de usar terá de ser ajustada para cada clone. 3,3 visualização de fluorescência de células transfectadas. Coloque placa de 12 bem no palco de um microscópio invertido de fluorescência, e examinar as células de expressão YFP. Compare a imagem DIC e anote o número aproximado de células verde. Esta fornece uma estimativa da eficiência de transfecção. 3,4 Preparação de 24 poços pratos e Poly-D-lisina lamínulas revestido Limpa 12 milímetros desliza tampa de vidro (Warner, CS-12R), agitando-los durante a noite com Radiacwash, seguido por lavagem com água deionizada e agitação durante a noite em etanol 95%. Armazenar as lamínulas limpa em etanol 70% até o uso. Lugar lamínulas em placas de Petri com etanol, chama off etanol utilizando fórceps e gravador, umd lugar em um poço de uma placa 24 estéril também. Cobrir todos os poços com 250 mL de poli-D-lisina (PDL) solução [0,2 mg / mL] e deixe o lamínulas se sentar durante a noite imersos em solução PDL sob o capô estéril. Enrole a placa de 24 poços em Parafilm para evitar a evaporação. Na manhã seguinte, aspire PDL e lavar 2x com água estéril. Deixe placas aberta para secar sob o capô, em seguida, cobrir. Os 24 pratos bem com lamínulas revestido pode ser embrulhado com papel de alumínio esterilizado e armazenado em temperatura ambiente por semanas. 3,5 Plating células transfectadas HEK293T na capa desliza 24h após a separação de transfecção, as células em 24 bem-prato (~ 4 X 10 3 células / poço) contendo tampa de vidro desliza revestidas com poli-D-lisina. Nota: as células transfectadas pode ser usado até 24-72 transfecção pós hrs. As células são divididas para fornecer lamínulas individuais para correção experimento de eletrofisiologia grampo. 4. Eletrofisiologia Preparando 4,1 Solutions Solução (banho) extracelular: 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2 e 10 mM HEPES (pH 7,4 set com NaOH). Alíquota de solução de banho de 20K e adicionar moduladores apropriado <ul><li> 20K + Ba 2 +: solução contendo 1 mM BaCl 2: um inibidor específico da retificação dentro correntes </li><li> 20K + carbacol: solução com 5 mM carbacol: um agonista M2R específicos; casais M2R a G-proteínas que canais abertos GIRK </li><li> 20K + Etanol: solução de banho, contendo 100 mM EtOH para ativar canais GIRK diretamente </li></ul> Coloque soluções banho em seringas (contentores solução) do sistema de troca rápida de perfusão. Nota: Nós usamos um sistema de válvula Warner pitada de controlar as soluções de banho. Tubulação de PE é recomendado. Eletrodo solução interna /: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5,4 mM MgCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,4) com 2,5 mM K 2 ATP e 0,3 mM Li 2 GTP. Nós fazemos a solução do eletrodo sem ATP e GTP. Nós separadamente preparar alíquotas de ATP e GTP, que são armazenadas a -80 ° C, e adicionar à solução de eletrodos no dia do experimento. Mantemos seringa com a solução final sobre eletrodo de gelo para preservar o ATP / GTP. Nós filtro estéril (0,2 mm) as soluções interno / externo para inibir o crescimento microbiano e reduzir a possibilidade de entupimento dos tubos eo eletrodo. 4,2 eletrodos Pulling Usamos Narishige extrator de duas etapas vertical e eletrodo de vidro de borosilicato da Warner Instrumento (1,5 mm de diâmetro externo, 0,86 mm de diâmetro interno e 7,5 cm de comprimento) para obter eletrodos com 3-7 mohms de resistência quando preenchido com solução intracelular. Nota: É necessário determinar experimentalmente os parâmetros para o puxador de eletrodo e do tipo de vidro do eletrodo em seu laboratório. Para o nosso puxador vertical, usamos uma configuração de calor de 60,2 para a primeira puxada e ~ 43 para a atração segundo. 4,3 Whole-cell patch de fixação <ol><li> Montagem tampa de deslizamento em um prato de 35 milímetros usando pequena quantidade de vaselina, cubra com solução externa e antena lugar no palco de um microscópio invertido de fluorescência. Use DIC para se concentrar e encontrar células, mudar para YFP fluorescência para localizar YFP células positivas. </li><li> Ponta posição do colector de perfusão perto de uma célula verde (20-30 M a partir da célula de interesse comprimento celular = 2-3 intervalo). </li><li> Preencha eletrodos com solução, anexá-lo ao headstage de Axopatch amplificador 200B (Axon Instruments) com as seguintes configurações iniciais: Ganhe 1, Configuração: conjunto de células β = 1, o modo V-clamp. </li><li> Aplique uma pressão positiva sobre eletrodo para evitar o entupimento da pipeta, e usar o manipulador de colocar ponta do eletrodo apenas acima da célula. </li><li> Para o potencial Zero pipeta, selecione o botão de teste Seal para entregar um passo tensão de teste. A tensão de 5 mV passo retangular aparecerá na janela de teste Selo de Clampex. Ajuste o potenciômetro Pipetar offset do amplificador para trazer a linha de base atual a 0 nA. Alternativamente, zero o potencial pipeta mudando o modo de amplificador seletor para V-track modo eo botão medidor para Vtrack e utilizar o potenciômetro Pipetar offset do amplificador para elevar a tensão no visor metros amplificador para &quot;0.00&quot;. </li><li> Verifique a resistência do eletrodo usando o comando selo teste do 8,2 Clampex software (deve ser mohms 07/03). </li><li> Abrir um arquivo salvo protocolo ou criar um novo protocolo. Para abrir o arquivo protocolo selecionar no menu principal Adquirir Protocolo, em seguida, Abrir e escolha um arquivo salvo protocolo de tensão. Para este experimento, o protocolo foi criado para conter o potencial de membrana de-40mV, entregar um único passo de tensão 50 ms a -100 mV e 40 mV rampa de acesso para mais de 200 ms. Este protocolo é executado a cada 2 segundos. O protocolo de rampa permite a observação da rectificação reversão em potencial e para dentro de canais GIRK. Para os canais iónicos dependentes de voltagem, um degrau de tensão retangular pode ser mais apropriado. </li><li> Célula abordagem utilizando o ajuste fino do manipulador, a liberação de pressão positiva, depois de tocar a superfície da célula aplicar pressão negativa, e monitorar aumento da resistência na janela osciloscópio Seal Test. Uma vez que a resistência está na faixa GÊ, o eletrodo foi selado membrana (Gigaseal formou). </li><li> Aplicar um pulso de pressão negativa para quebrar a membrana celular e tenha acesso na célula. Uma vez em toda a configuração de célula, você irá registrar aumento correntes capacitivas. </li><li> Mude para o Teste de Membrana em Clampex e anote o acesso a resistência Ra, Rm resistência da membrana, Cm capacitância de membrana e verificar pelo olho do ajuste exponencial da curva teórica para a corrente capacitiva reais. Capacitância da membrana é proporcional ao tamanho da célula e serão utilizadas posteriormente para calcular a densidade de corrente. </li><li> Voltar para o Selo de teste, conjunto V-Out (potencial de membrana) a -40 mV e filtro de 10 kHz </li><li> Compensar a capacitância de membrana e resistência em série no amplificador com as seguintes etapas: <ol class="lalpha"><li> Mudar o interruptor CAP TODO celular. Ajuste CAP células inteiras e mostradores resistência em série e para trás, até obter um pulso de teste plana. Você também pode precisar de ajustar capacitância pipeta botão CAP FAST. </li><li> Ligue o botão PREVISÃO% para cerca de 60-80%, novamente re-ajustando CAP células inteiras ea marcação resistência em série (você pode ter que ajustar a compensação de capacitância pipeta botão CAP rápido também). </li><li> Ligue% COMP-a 100%, sem oscilação da célula, enquanto tenta manter o pulso flat reajustando CAP células inteiras e resistência em série (você pode ter que ajustar a compensação de capacitância pipeta botão CAP rápido também). Ajustar o lag, reduzindo o tempo constante. </li><li> Anote os valores de Cm (capacitância de membrana), Rs (resistência em série), COMP%, PRED% e tempo de atraso definido no amplificador no notebook. O Cm e Rs deve ser aproximadamente o mesmo que o Cm e Rm medido no teste de membrana acima. </li></ol></li><li> Ligue válvula solução externa para controlar a solução do banho. Definir o amplificador de 8 pólos do filtro de Bessel de 2kHz, abra um protocolo de fixação de tensão e correntes começar a gravação. </li><li> Gravamos correntes GIRK usando um protocolo de rampa que os passos a -100 mV para 50 ms, em seguida, rampas de 100 mV a 40 mV mais de 200 ms e é entregue a cada 2 segundos. O protocolo de rampa permite a observação do potencial de reversão e de propriedade de retificação para dentro de canais GIRK. À temperatura ambiente (22-25 ° C), o GIRK atual deve reverter perto -50 mV (com 20 mM KCl no banho), que está perto do potencial de equilíbrio calculado para K (E K = -50 mV), então permanecem bastante plana em potenciais positivos para E-K. </li><li> Protocolo experimental: Após a gravação de uma linha de base estável, mude para solução de 20K + carbacol e aguarde pico de resposta, voltar para 20K solução de banho, em seguida, aplicar 20K + Etanol e aguardar resposta de pico, em seguida, mudar para 20K solução do banho e, finalmente, 20K + Ba 2 + solução. Durante a aplicação destas drogas você verá mudanças na amplitude de GIRK correntes (mais pronunciada a -100 mV). Anote o número do traço correspondente à aplicação de diferentes soluções extracelular no notebook. Um arquivo Clampfit único conterá todas as varreduras em busca de todo o experimento. </li></ol> 5. Análise de Dados Usamos Clampfit software 9.2 para analisar os dados correntes GIRK a -100 mV. <ol><li> Abra o arquivo com a gravação, conjunto cursor a -100 mV. Por padrão, você verá todos os traços sobrepostos na tela. Ao pressionar &quot;Write cursores&quot; ícone que você irá criar Excel-como planilha com dados numéricos. </li><li> Através da atribuição de X para a coluna número de rastreamento e Y para a coluna de cursor e pressionando &quot;Criar Gráfico&quot; ícone você pode rapidamente desenhar um gráfico tempo-curso do experimento. </li><li> Calcular corrente basal subtraindo atual em presença de Ba 2 + a partir de corrente registou em solução de perfusão externo sozinho (&quot;20K atual&quot; minus &quot;20K + Ba 2 + atual&quot;). Calcular as correntes induzidas subtraindo atual basal em 20K das correntes ativadas (&quot;20K + carbacol atual&quot; minus &quot;20K atual&quot;, &quot;Etanol 20K + atual&quot; minus &quot;20K atual&quot;). Calcular a densidade de corrente (pA / pF) dividindo-se a corrente pela capacitância de membrana (leia-se directamente a partir do amplificador). Calcular a ativação por cento dividindo correntes induzidas por correntes basal e multiplicando por 100. </li></ol> 6. Resultados representante Você deve ser capaz de registro atual a partir de células transfectadas com canais do tipo selvagem. Para GIRK medida canaisd na solução extracelular contendo 20 mM K + (e 145 mM K + intracelular) que deve apresentar retificação interna forte e um potencial de reversão de ~ -50 mV, que é uma propriedade essencial de canais de potássio. A corrente do tipo selvagem vai aumentar fortemente sobre carbacol aplicação (3-5 vezes ao longo aumentar atual basal) e responder de forma semelhante ao etanol 100 mM. Nota: a convenção de sinais para eletrofisiologia é que a corrente é negativa para dentro e para fora atual é positivo. Para a mutação L257W no bolso álcool ligação de GIRK2, você vai ver as respostas atenuadas a ambos carbacol e etanol. Isto sugere que a L 257 está envolvido em álcool e ativação da proteína G de GIRK2 canais. Para mais exemplos dos resultados da GIRK2 mutagênese, consulte a publicação recente de Aryal et al. 1. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Janela de 8,0 Clampfit arquivo de dados para shows do tipo selvagem de gravação GIRK2. Painel superior esquerdo mostra sobreposta registros gravados em resposta a um protocolo de rampa de tensão na presença de diferentes soluções externas bah. Cursor é posicionado em um -100 mV. Os valores de cursor são escritos para a planilha (painel direito). Painel inferior esquerdo mostra o gráfico do número de varredura contra, atual. Observe o aumento da corrente (deflexão para baixo) com etanol (EtOH) e carbacol (Carb) e inibição atual com Ba 2 +. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Descrições de janela de 8,0 Clampfit arquivo de dados para uma gravação mostra GIRK2-L257W mutante. São os mesmos que na Figura 1. Observe a perda de carbacol ativação (Carb) e redução de EtOH induzida por correntes nos canais de mutantes.

<ol>
	<li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation.">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li><li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K++channels+examined+by+scanning+mutagenesis.">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li><li>Doyle, D. A., Cabral, M. o. r. a. i. s., Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp;amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+potassium+channel:+molecular+basis+of+K++conduction+and+selectivity.">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li><li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera.">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li><li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K++channel+Kir2.2+at+3.1+&amp;Aring;+resolution.">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &amp;Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Sítio-dirigida mutagênese é uma abordagem clássica para estudar as relações estrutura-função de canais iônicos. Ele é baseado na premissa de que mudando um resíduo crítico do canal iônico deve ser capaz de observar as mudanças pronunciadas na função de canal. Em contraste, muitas mutações na posição de não-críticas podem ser introduzidas sem perturbações importantes para a função de canal. Normalmente, o resíduo em questão é o primeiro mutante a alanina, um ácido não-polar pequena amino, seguida por mutações triptofano, o maior de aminoácidos 2. Se o resíduo é importante para a função de canal, ambas as mutações modifica a atividade do canal. Se um resíduo menos essencial é mutante, os efeitos da mutação, especialmente a alanina são muitas vezes banal. Triptofano mutações são mais propensos a provocar alterações devido a impedimentos estéricos associados com o tamanho do triptofano. Muitas vezes, quando a informação estrutural está faltando mutação, sistemática para alanina ou triptofano dentro de um fragmento do canal (chamado alanina ou triptofano scan) pode ser usado para localizar os resíduos críticos. É importante notar que vários clones com diferentes mutações pontuais podem ser preparadas em paralelo permitindo testes de resíduos múltiplos dentro de um prazo relativamente curto. Recentemente, várias estruturas cristalinas dos canais tornaram-se disponíveis 3,4,5. Elas podem ser usadas para propor possíveis resíduos de chave a ser testada utilizando a abordagem descrita neste protocolo. Medições em tipo selvagem canal deve sempre acompanhar a medição de um canal de mutantes para servir como um controle positivo para assegurar que os experimentos de transfecção e eletrofisiológicas foram feitas corretamente. Mutações pontuais pode levar à falta de uma corrente funcional, semelhante à atual regulamentação do tipo selvagem ou alterados da atividade do canal. Falta de corrente mensurável pode ser devido ao tráfico de dobrar ou alterados impróprio. Nesse caso, pode ser útil para descobrir se o canal de tráfegos corretamente para a superfície através de um ensaio Biotinilação ou imunofluorescência contra tag extracelular (sem permeabilização celular) para distinguir entre não-funcionais canais na membrana plasmática e canais retidos no interior da célula . Finalmente, é aconselhável investigar não apenas a atividade basal do canal, mas também as consequências da mutação sobre a regulamentação do canal. Diferentes mecanismos de modulação da função de canal poderia ser estudada, dependendo do canal de íon de interesse, incluindo regulação por proteínas G, PIP2, íons, a concentração de ATP, a fosforilação (usando serina tirosina, treonina ou mutação), ubiquitinação ou sumoylation (através de mutação de lisina) e abridores de canal direto ou bloqueadores.

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 <div>
 <table border="1">
 <thead>
 <tr>
 <td>Material Name</td>
 <td>Type</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 </thead>
 <tbody>
 
<tr>
<td>Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Varies</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Prep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>27104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Radiacwash</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biodex</td>
<td>005-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>CB40210</td>
<td>Poly-L-lysine can also be used</td>
</tr>
<tr>
<td>Maxi Prep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>200512-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips &#x02C6;&#x2026; 12 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>CS-12R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary Glass Tubing Borosilicate-standard wall</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>G150-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank">Inverted fluorescence microscope</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMI3000 B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrophysiology</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon/ Leica/ Zeiss</td>
<td>Any inverted DIC (Hoffmann) microscope with fluorescence</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Axon Axopatch 200B amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>VC-6 Perfusion MM-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digitizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Digidata 1320 digitizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Manipulator: MP-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrode Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>PC10 vertical electrode puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isolation Table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Manufacturing Corporation</td>
<td>Air table</td>
<td>&nbsp;</td> </tbody>
 </table>
 </div>

mutagenesis and functional analysis of ion channels heterologously expressed in mammalian cells

Vamos demonstrar como estudar os efeitos funcionais da introdução de uma mutação pontual em um canal iônico. Estudamos proteína G-gated de potássio dentro de retificação (referido como GIRK) canais, que são importantes para a regulação da excitabilidade dos neurônios. Há quatro diferentes subunidades GIRK mamíferos canal (GIRK1-GIRK4) - nos concentramos em GIRK2 porque forma uma homotetramer. A estimulação de diferentes tipos de G receptores acoplados à proteína (GPCRs), tais como os receptores muscarínicos (M2R), leva à ativação de canais GIRK. O álcool também ativa diretamente os canais GIRK. Vamos mostrar como a mutar um aminoácido por especificamente alterando um ou mais nucleotídeos no cDNA para o canal GIRK. Esta seqüência mutada cDNA será amplificado em bactérias, purificado, ea presença da mutação de ponto será confirmada por seqüenciamento de DNA. Os cDNAs para os canais de mutantes e do tipo selvagem GIRK serão transfectadas em células embrionárias do rim HEK293T cultivadas in vitro. Por último, de célula inteira patch-clamp eletrofisiologia será usado para estudar as correntes macroscópicas de potássio através da ectopicamente expressa canais GIRK do tipo selvagem ou mutado. Nesta experiência, vamos examinar o efeito de uma mutação no L257W GIRK2 canais na ativação M2R-dependentes e dependentes de álcool.

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Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Vamos demonstrar como estudar o efeito de uma única mutação de ponto na função de um canal iônico.

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

mutagenesis-functional-analysis-ion-channels-heterologously-expressed

Research

JoVE Journal

Biology

17.3K visualizações.  Salk Institute for Biological Studies. Vamos demonstrar como estudar o efeito de uma única mutação de ponto na função de um canal iônico.

Vídeo: Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Biologia

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulso-chase Análise de Cadeias N-linked Açúcar de Glicoproteínas em células de mamíferos

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Análise de DNA dupla fita-Break Repair (DSB) em células de mamíferos

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...