Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde número de concessão R21-HL094828-01 atribuído ao Dr. Poelzing.

1. Prepare Função Ruído e Sinal de Entrada <ol><li> Crie uma função de ruído contendo os componentes de freqüência desejada. Isto pode ser feito por descrever os componentes de freqüência desejada no domínio da freqüência e depois calcular o inverso Transformada Rápida de Fourier. Neste estudo, 1 - 15 kHz foi utilizado. Todas as transformadas de Fourier e Fourier inversa transforma descritos neste estudo foram calculados utilizando Matlab FFT e IFFT funções. </li><li> Dimensionar a amplitude da função de ruído de forma adequada. Neste estudo, a função de ruído foi escalado de modo que o zero a amplitude de pico da função de ruído foi de 50 ou 100 mV. </li><li> Criar um arquivo de estímulo através de métodos apropriados para a aquisição de software a ser utilizado. Para Clampex 8, primeiro criar um arquivo de texto com o cabeçalho apropriado. Abaixo do cabeçalho, introduza os incrementos de tempo para uma única varredura na primeira coluna. Os incrementos de tempo deveria ter o mesmo espaçamento temporal como o intervalo de amostragem utilizado nas medições. Para cada varredura no protocolo de degrau de tensão inserir as tensões exato desejado em cada passo de tempo. Isto deve incluir a função de ruído. </li></ol> 2. Realizar medições de tensão Grampo <ol><li> Criar um protocolo de medição dentro do software de aquisição que é compatível com o arquivo de estímulo gerado anteriormente. Em Clampex, há um menu que permite ao usuário associar um arquivo de estímulo com o protocolo atual. </li><li> Anexar um modelo (ou biológicas) da célula para o equipamento de medição. </li><li> Realizar o experimento, como previsto. Para efeitos de controlo, certifique-se de incluir medições periódicas que não incluem todas as funções de ruído. </li></ol> 3. Análise Experimental de pós <ol><li> Calcular a curva IV de uma gravação individual. Se a gravação é no estado de equilíbrio quando a função de ruído é aplicado, a curva IV pode ser criado usando uma porção de estado estacionário da gravação temporariamente fora do intervalo da função de ruído. Se a gravação não estava em estado estacionário, a função de ruído pode interferir com o cálculo da curva IV, então uma segunda gravação deve ser feita sem a função de ruído presente. </li><li> Para cada etapa de tensão em uma gravação de calcular a Transformada Rápida de Fourier da parte da gravação em que a função do ruído foi inserido. Combine a transformada de Fourier para cada etapa de tensão em amxn matriz, onde m é o número de frequências na FFT, e n é o número de passos de tensão. Nesta configuração, cada linha da matriz representa a amplitude de uma única freqüência em todas as etapas de tensão no experimento. </li><li> Para cada freqüência (ou seja, cada linha na matriz acima) correlacionar a linha com a curva IV gerada em 3.1 e gravar o coeficiente de correlação. </li><li> Trama a correlação de frequência vs coeficiente de visualizar frequências que altamente correlacionados com a curva IV. Como o componente DC está contida dentro da primeira freqüência da FFT, o coeficiente de correlação para esta freqüência deve ser sempre&gt; 0,99. </li></ol> 4. Resultados representativos: As medições representativas braçadeira de tensão são apresentados para uma célula modelo sem (Figura 1A) e com (Figura 1B) um ruído função inserida no protocolo de degrau de tensão. A curva IV também foi calculado para a célula do modelo (Figura 1C). Para cada varredura, nas gravações da Figura 1, a FFT foi calculado sobre o período de tempo onde a função do ruído foi inserido (ver caixa vermelha nas figuras 1A, 1B). Figuras 2A e 2B mostram os FFTs calculado para as gravações mostrado na Figura 1A e 1B, respectivamente. Após a inspeção visual, o componente DC (destacado em vermelho) aparece para imitar a forma da curva IV. Sem a função de ruído, todas as frequências acima DC parecem ter amplitudes próximas de zero (Figura 2A). Quando a função de ruído é inserido, as freqüências entre 1 e 15 kHz têm amplitudes visualmente perceptível (Figura 2B). A Figura 3 mostra o resultado de correlacionar amplitudes de freqüência individual sobre a gama de medidas de tensão contra a curva IV. Figura 3A-C mostra os coeficientes de correlação quando o experimento foi feito sob condições de controle (sem função de ruído) e com amplitudes de ruído de 50 e 100 mV, respectivamente. Observe em todos os casos, o componente DC parece correlacionar quase perfeitamente com a curva IV. De fato, para todas as gravações, o coeficiente de correlação para esta freqüência foi maior que 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, média ± desvio padrão). Quando olhamos para a Figura 3A (condições de controle), não existem frequências para além da componente DC, cuja amplitude significativamente correlaciona-se com a curva IV. Especificamente, nenhuma dessas freqüências têm coeficientes de correlação maior que 0,5. Após a inserção dos mais baixos da função da amplitude de ruído (50 mV), estas mesmas freqüências ainda tinha coeficientes de correlação inferior a 0,5. Os coeficientes de correlação para ofreqüências si só também não se tornou maior do que 0,5 quando a amplitude do ruído foi aumentada para 100 mV. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="Figura 1" /> . Figura 1 Modelo Recordings Cell: gravações braçadeira de tensão são apresentados para uma célula de modelo sem (1A) e com (1B) um ruído função incluída no protocolo de degrau de tensão. Para o primeiro eo último 20 ms de cada varredura, o potencial foi mantido em potencial exploração (0 mV). Cada passo de tensão foi de 80 ms de comprimento, ea função do ruído foi inserido 40 ms após o início da etapa. A função do ruído teve uma duração de 30 ms e continha freqüências entre 1 e 15 kHz. Tensão foi intensificada fro, -150 a +50 mV em incrementos de 5 mV. Uma curva IV para a célula modelo também é mostrado (1C). Para fazer as gravações mais fáceis de ler, apenas varrer toda quinta foi incluída na 1A e 1B, mas todas as varreduras foram incluídos no 1C. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 FFT de Gravações:. A FFT foi calculado para a parcela ms 30 de cada varredura, onde a função de ruído é para ser inserido (a área delimitada pela caixa vermelha nas figuras 1A, 1B). Figuras 2A e 2B mostram os FFTs calculados sem e com a função do ruído, respectivamente. Mais uma vez, para maior clareza, apenas os FFT de cada quinta varredura está incluído na figura, mas todos varre foram usados ​​nos cálculos futuros. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="Figura 3" /> . Figura 3 Correlações Frequency IV: Os resultados das correlações entre a curva IV de uma gravação ea amplitude de freqüências individuais em toda a gama de medidas de tensão é mostrado. Figuras 1A - 1C mostram o coeficiente de correlação para freqüências 0-20 kHz em condições de controle, e na presença de 50 ou 100 funções ruído mV, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4 Re-Criação da Curva IV:. A curva IV para a célula do modelo (igual à Figura 1C) ea magnitude de duas freqüências foram sobrepostos. A primeira frequência foi o componente DC (R = 0,995), eo segundo foi uma freqüência escolhidos aleatoriamente com baixa correlação (R ​​= 0,3212). As amplitudes de freqüência foram dimensionadas para aproximadamente a mesma amplitude que a curva IV.

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	<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Ukomadu, C., Zhou, J., Sigworth, F. J., Agnew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mu]l+Na++channels+expressed+transiently+in+human+embryonic+kidney+cells:+Biochemical+and+biophysical+properties.">mu]l Na+ channels expressed transiently in human embryonic kidney cells: Biochemical and biophysical properties.</a> Neuron. 8, 663-676 (1992).</li><li>Abriel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Arrhythmogenic+Mechanism+Revealed+by+a+Long-QT+Syndrome+Mutation+in+the+Cardiac+Na++Channel.">Novel Arrhythmogenic Mechanism Revealed by a Long-QT Syndrome Mutation in the Cardiac Na+ Channel.</a> Circ Res. 88, 740-745 (2001).</li><li>Giles, W. R., Imaizumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+potassium+currents+in+rabbit+atrial+and+ventricular+cells.">Comparison of potassium currents in rabbit atrial and ventricular cells.</a> J Physiol. 405, 123-145 (1988).</li><li>Lee, K. S., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+calcium+channel+blockade+by+verapamil,+D600,+diltiazem+and+nitrendipine+in+single+dialysed+heart+cells.">Mechanism of calcium channel blockade by verapamil, D600, diltiazem and nitrendipine in single dialysed heart cells.</a> Nature. 302, 790-794 (1983).</li><li>Ozdemir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Inhibition+of+Na/Ca+Exchange+Results+in+Increased+Cellular+Ca2++Load+Attributable+to+the+Predominance+of+Forward+Mode+Block.">Pharmacological Inhibition of Na/Ca Exchange Results in Increased Cellular Ca2+ Load Attributable to the Predominance of Forward Mode Block.</a> Circ Res. 102, 1398-1405 (2008).</li><li>Zhang, S., Zhou, Z., Gong, Q., Makielski, J. C., January, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Block+and+Identification+of+the+Verapamil+Binding+Domain+to+HERG+Potassium+Channels.">Mechanism of Block and Identification of the Verapamil Binding Domain to HERG Potassium Channels.</a> Circ Res. 84, 989-998 (1999).</li><li>Veeraraghavan, R., Poelzing, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+increased+right+ventricular+conduction+sensitivity+to+flecainide+challenge.">Mechanisms underlying increased right ventricular conduction sensitivity to flecainide challenge.</a> Cardiovasc. Res. 77, 749-756 (2008).</li><li>Goodman, M., Art, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+feedback+by+a+potassium-selective+inward+rectifier+enhances+tuning+in+vertebrate+hair+cells.">Positive feedback by a potassium-selective inward rectifier enhances tuning in vertebrate hair cells.</a> Biophysical Journal. 71, 430-442 (1996).</li><li>Han, A., Frazier, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+characterization+using+single+cell+impedance+spectroscopy.">Ion channel characterization using single cell impedance spectroscopy.</a> Lab Chip. 6, 1412-1414 (2006).</li><li>Hayashi, H., Fishman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifier+K+-channel+kinetics+from+analysis+of+the+complex+conductance+of+Aplysia+neuronal+membrane.">Inward rectifier K+-channel kinetics from analysis of the complex conductance of Aplysia neuronal membrane.</a> Biophysical Journal. 53, 747-757 (1988).</li><li>Millonas, M. M., Hanck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+response+spectroscopy+of+voltage-sensitive+ion+channel+gating.">Nonequilibrium response spectroscopy of voltage-sensitive ion channel gating.</a> Biophys. J. 74, 210-229 (1998).</li><li>Misakian, M., Kasianowicz, J., Robertson, B., Petersons, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+response+of+alternating+currents+through+the+Staphylococcus+aureus+alpha-hemolysin+ion+channel.">Frequency response of alternating currents through the Staphylococcus aureus alpha-hemolysin ion channel.</a> Bioelectromagnetics. 22, 487-493 (2001).</li><li>Sale, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Properties+of+hERG+1a/1b+Heteromeric+Currents+and+a+hERG+1b-Specific+Mutation+Associated+With+Long-QT+Syndrome.">Physiological Properties of hERG 1a/1b Heteromeric Currents and a hERG 1b-Specific Mutation Associated With Long-QT Syndrome.</a> Circ Res. 103, 81-95 (2008).</li><li>Blatz, A. L., Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+description+of+three+modes+of+activity+of+fast+chloride+channels+from+rat+skeletal+muscle.">Quantitative description of three modes of activity of fast chloride channels from rat skeletal muscle.</a> J Physiol. 378, 141-174 (1986).</li><li>Kuo, J. J., Lee, R. H., Zhang, L., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+the+persistent+sodium+current+in+spike+initiation+during+slowly+rising+inputs+in+mouse+spinal+neurones.">Essential role of the persistent sodium current in spike initiation during slowly rising inputs in mouse spinal neurones.</a> The Journal of Physiology. 574, 819-834 (2006).</li><li>Thompson, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+potassium-channel+selectivity+revealed+by+Na(+)+and+Li(+)+binding+sites+within+the+KcsA+pore.">Mechanism of potassium-channel selectivity revealed by Na(+) and Li(+) binding sites within the KcsA pore.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1317-1324 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Existem obstáculos técnicos que atualmente impedem os investigadores de medir tipos múltiplos canais de íon simultaneamente com a intenção de posteriormente determinar a quantidade de corrente deve ser atribuída a cada tipo de canal. Devido a esta limitação, canais iônicos são geralmente estudadas individualmente usando técnicas como tensão, corrente, acção e clamp potencial. Para um estudo tipos de canais individuais, sistemas de expressão heteróloga são usadas frequentemente. 2 Ao trabalhar com células isoladas de tecido, tais como cardiomiócitos , outros meios devem ser usados ​​para bloquear os canais de íons diferentes. Por exemplo, os canais de sódio podem ser inativados por uma rampa de tensão lenta despolarizantes, 3 canais de potássio para dentro de retificação pode ser bloqueado com BaCl2 extracelular, 4 e canais de cálcio pode ser bloqueado utilizando verapamil 5. Um método utilizado que parcialmente supera essa limitação é medir o fluxo de corrente através de dois tipos de canais em simultâneo, em seguida, repita a medição após seletivamente bloqueando um tipo de canal com um agente apropriado. Subtração das duas medições pode então ser usada para estimar a quantidade de atribuíveis atual para o tipo de canal que foi bloqueado. 6 No entanto, existem duas grandes limitações a esta técnica. Primeiro, agentes químicos não foram identificados que podem bloquear seletivamente cada canal iônico, e algumas drogas amplamente utilizadas têm interacções não específicas com os tipos de outro canal. 5,7 segundo lugar, não pode ser determinada a partir desta técnica se um canal é modulado por um outro canal. Por exemplo, a expressão heterogênea de Nav 1.5 e Kir 2.1 foi mostrado na ventrículos cobaia, e tem sido sugerido que existe uma relação sinérgica entre os dois canais, tais que a maior Kir 2,1 expressão no ventrículo direito deprime velocidade de condução. 8 Atualmente , isto não pode ser verificada. Neste estudo, sugerimos que a espectroscopia de impedância pode ser uma ferramenta útil para estudar os tipos de iões de vários canais medidos simultaneamente. Embora o método apresentado nunca foi usado para discernir as correntes a partir de dois tipos de canais medidos simultaneamente, espectroscopia de impedância tem sido usado para estudar uma série de outros aspectos da função do canal de íon. Goodman e Arte mostrou tartaruga usando células ciliadas auditivas que os protocolos de pinça de corrente pode ser modificado para sintonizar uma célula para diferentes freqüências, e as oscilações no potencial transmembrana é devido a uma interação entre um retificador interno da K + e um canal de Ca 2 + canal. 9 Han e Frazier demonstrado que a impedância pode ser medida em uma única célula em uma ampla faixa de freqüências (100 Hz a 5 MHz), eo aumento da impedância observada quando K + ou Ca 2 + canais foram bloqueados poderia ser um meio simples de detectar bloco do canal em telas de drogas de alto throughput. 10 Hayashi e Fishman usaram condutância complexos para estudar propriedades cinéticas de um retificador interno da K + canal 11. Outros grupos têm introduzido uma única freqüência no protocolo de fixação de voltagem de tipos de canais diferentes e mostraram que o resposta de freqüência observada concordou com a resposta esperada para algumas freqüências, mas outros não. 12,13 Millonas Hanck e sugeriu a razão algumas freqüências não produzir a resposta esperada é a presença de constantes de taxa múltipla no modelo de Markov. 12 Estudos como estes, bem como outros, têm demonstrado que existem casos em que as correntes iónicas medidas de canais iônicos, enquanto usando espectroscopia de impedância não concordar com a resposta de freqüência teórica. Esta não é uma preocupação neste estudo porque o objetivo do método neste estudo é identificar as freqüências que se correlacionam com a amplitude da corrente independente dos pressupostos subjacentes do circuito elétrico da membrana. Furtheremore, a amplitude da corrente é calculado a partir de partes das gravações que não têm qualquer função do ruído inserido dentro deles. Uma série de outros estudos também apresentam modelos de canais iônicos numerosas exibindo numerosos estados condução e não condução, todos com suas constantes próprio ritmo. 14,15,16 Thompson et al mostraram que o filtro de seletividade do canal KcsA tem diferentes sítios de ligação para o Na +, Li + e K +, e os custos energéticos de que se deslocam de um sítio de ligação para outro como se move de íons através do filtro de seletividade é o que faz o canal preferencialmente conduta K + íons através de seu poros. 17 Neste trabalho, inserido uma ampla de freqüências (função de ruído) em um protocolo de degrau de tensão e olhou para as frequências cuja amplitude altamente correlacionados com a amplitude total de corrente. Desde forte evidência foi apresentada sugerindo constantes de taxa múltipla desempenhar um papel na condução de íons através different canais, a introdução das freqüências associadas com estas constantes de velocidade podem causar certas freqüências de vibração ou altamente correlacionados com a amplitude da corrente, que não teria de outra forma. A técnica demonstrada neste estudo é realizado em uma célula de modelo, que é um circuito paralelo RC que é normalmente usado para testar o circuito braçadeira de tensão e equipamento de aquisição. Não se espera que qualquer freqüências além DC teria correlação com a magnitude atual, e isso é mostrado em nossos dados. Mostramos também que além da função de ruído não causa nenhum freqüências para altamente correlacionados com a amplitude da corrente. Esses dois achados são fundamentais porque mostram que o equipamento de medição e função de ruído não por si só causa qualquer freqüências para correlacionar com a amplitude atual. Quando estudos futuros fazer medições utilizando membranas contendo canais iônicos, espera-se que, dependendo do canal utilizado, as freqüências que correspondem às constantes de velocidade no filtro de seletividade ou, possivelmente, os poros irão influenciar a resposta de freqüência do canal e do afeto que têm freqüências altas ou baixa correlação com a amplitude atual. Uma vez que este método é uma nova técnica para estudar canais iônicos, há uma série de direções estudos futuros poderia seguir. Primeiro, a técnica deve ser usada para caracterizar a resposta de freqüência de canais específicos isolados. Trabalho adicional também precisa ser feito para calibrar as amplitudes de freqüência para as amplitudes atual. Uma vez que múltiplos canais são caracterizados individualmente, tipos de canais múltiplos devem ser medidos simultaneamente. A técnica também poderia ser adaptado para uso em grampo do potencial de ação, pinça de corrente, e estudos de estimulação de campo. Embora esta seja uma nova técnica, ele mostra o que pode ser uma forma poderosa de fazer medições eletrofisiológicas que anteriormente não eram possíveis e fornecer valiosas novos insights sobre o papel fisiológico dos canais de íons.

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		<th>Comment</th>
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<tr>
<td>Matlab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>n/a</td>
<td>Natick, MA</td>
</tr>
<tr>
<td>Clampex 8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Clampex 8</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Integrating Patch Clamp Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Axopatch 200</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Headstage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>CV202</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>16-Bit Data Acquisition System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Digidata 1322A</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Model Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Patch 1 Model Cell</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

recapitulation of an ion channel iv curve using frequency components

INTRODUÇÃO: Atualmente, não existem métodos estabelecidos para medir tipos múltiplos canais de íon simultaneamente e decompor a corrente medida em porções atribuível a cada tipo de canal. Este estudo demonstra como espectroscopia de impedância pode ser usado para identificar freqüências específicas que altamente correlacionados com a amplitude estado estacionário corrente medida durante as experiências braçadeira de tensão. O método envolve a inserção de uma função de ruído contendo freqüências específicas para o protocolo de degrau de tensão. No trabalho apresentado, uma célula de modelo é usado para demonstrar que não altas correlações são introduzidas pelo circuito braçadeira de tensão, e também que a função do ruído em si não introduzir qualquer altas correlações quando não canais iônicos estão presentes. Esta validação é necessária antes que a técnica pode ser aplicada às preparações que contêm canais iônicos. O objetivo do protocolo apresentado é demonstrar como para caracterizar a resposta de freqüência de um único tipo de canal iônico para uma função de ruído. Uma vez freqüências específicas foram identificadas em um tipo de canal individual, eles podem ser usados ​​para reproduzir o constante estado atual tensão curva (IV). Freqüências que altamente correlacionados com um tipo de canal e minimamente se correlacionam com os tipos de outro canal pode então ser usada para estimar a contribuição atual de tipos de canais múltiplos medidos simultaneamente. MÉTODOS: medições braçadeira de tensão foram realizadas em uma célula modelo usando um protocolo passo padrão de tensão (-150 a +50 mV, 5mV passos). Funções de ruído contendo magnitudes iguais de 15/01 kHz (zero ao pico amplitudes: 50 ou 100mV) foram inseridos em cada etapa de tensão. A componente real da Fast Fourier Transform (FFT) do sinal de saída foi calculado com e sem ruído para cada potencial passo. A magnitude de cada freqüência como uma função de degrau de tensão foi correlacionada com a amplitude da corrente nas tensões correspondentes. RESULTADOS E CONCLUSÕES: Na ausência de ruído (controle), magnitudes de todas as freqüências, exceto o componente DC correlacionados mal (| R | &lt;0,5) com a curva IV, enquanto que o componente DC teve um coeficiente de correlação maior que 0,999 em todas as medições. A qualidade da correlação entre as freqüências individuais e da curva IV não se alterou quando uma função de ruído foi adicionada ao protocolo passo de tensão. Da mesma forma, aumentando a amplitude da função de ruído também não aumentou a correlação. Medidas de controle demonstram que o circuito clamp tensão por si só não causa qualquer freqüências acima de 0 Hz a alta correlação com a curva IV steady-state. Da mesma forma, as medições na presença de ruído a função demonstrar que a função de ruído não causa qualquer freqüências acima de 0 Hz para correlacionar com a curva IV steady-state quando não há canais de íons estão presentes. Com base nesta constatação, o método já pode ser aplicado a preparações contendo um tipo único canal de íons com a intenção de identificar as freqüências cujos amplitudes correlacionam especificamente com esse tipo de canal.

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Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

Existem obstáculos técnicos para a medição do fluxo de corrente através de canais iónicos simultaneamente, e mais tarde discernir o que parte da corrente transmembrana é devido a cada tipo de canal. Para atender a essa necessidade, este método apresenta uma forma para gerar a curva IV de tipos de canais individuais usando componentes de freqüência específica.

Recapitulação de um Curve Ion IV Canal Usando componentes de freqüência

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

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Biology

13.4K visualizações.  University of Utah. Existem obstáculos técnicos para a medição do fluxo de corrente através de canais iónicos simultaneamente, e mais tarde discernir o que parte da corrente transmembrana é devido a cada tipo de canal. Para atender a essa necessidade, este método apresenta uma forma para gerar a curva IV de tipos de canais individuais usando componentes de freqüência específica.

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

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The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagênese do site caseiros Direção de Plasmids Whole

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Quantificar a freqüência de Tumor-propagação células usando Transplante de Células Limitando diluição em singênicos Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Explorando Arterial Músculo Liso KV7 função dos canais de potássio utilizando electrofisiologia patch clamp e Miografia Pressão

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Caracterização funcional de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Trocadores de intracelular compartimentos usando a Seleção Proton-matança de expressá-las na membrana plasmática

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Medição de Extracelular Ion Fluxos Usando a técnica microeletrodos de auto-referência íon-seletivo

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizando Frequency Stromule com microscopia de fluorescência

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...