O protocolo permite a avaliação das respostas do hospedeiro a uma variedade de patógenos e formulações de vacinas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a avaliação da carga bacteriana e das respostas imunes in vivo, utilizando um modelo animal tratável. Demonstrando este procedimento está Kacy Yount, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Para a imunização, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do sol em um rato anestesiado de seis a doze semanas de idade, e carregue uma seringa de insulina de um mililitro, equipada com uma agulha calibre 28,5 com um mililitro de 0,1 mililitro da vacina de interesse. Segurando a seringa em um ângulo de 45 graus, com o bisel voltado para cima, insira a agulha aproximadamente cinco milímetros no deltoide do camundongo e injete a vacina. Mantenha a agulha inserida no músculo por cinco a dez segundos, depois gire a seringa 180 graus, de modo que o chanfrado esteja virado para baixo para criar uma vedação, e para evitar o vazamento da vacina, antes de retirar lentamente a agulha do local da injeção.
Em seguida, devolva o mouse para sua gaiola, com monitoramento, até a recuperação completa. Cerca de duas semanas depois de impulsionar, infectar camundongos imunizados. Segure um rato anestesiado pelo escroto do tórax dorsal, atrás das omoplatas e pescoço, e posicione o mouse ereto para acessar o nariz.
Usando uma ponta de pipeta de 200 microliteres, aplique lentamente de 20 a 25 microlitrais do inóculo bacteriano de interesse a cada nare do animal, segurando o rato até que todo o inóculo tenha sido inalado. Em seguida, entregue um volume igual de PBS estéril a um grupo de ratos como um controle negativo. No ponto final experimental apropriado, coloque um lado ventral do rato infectado em uma placa de dissecção e proteja os membros.
Molhe o corpo com 70% de etanol, e use fórceps para apertar a pele abaixo do abdômen no centro da pelve. Usando uma tesoura afiada, faça um corte vertical até a mandíbula, e disseca a pele da parede peritoneal. Mova a pele para os lados da carcaça para criar um campo desobstruído para a colheita de órgãos estéreis, e segure o peritônio intacto abaixo da caixa torácica, em ou perto do fígado.
Corte o peritônio em direção à caixa torácica para expor o trato digestivo inferior, e mova o cólon para a esquerda para revelar o baço. Usando fórceps curvas, segure o baço e disseca o tecido conjuntivo com uma tesoura. Em seguida, coloque o baço em um tubo cônico de 15 mililitros contendo 3 mililitros de RPMI, e 5% de soro bovino fetal no gelo.
Use fórceps para estabilizar a caixa torácica no processo xifoide e abra o diafragma. Os pulmões devem esvaziar, e cair em direção à coluna. Corte a caixa torácica nas laterais para remover o peitoril, e corte as artérias e veias pulmonares para isolar e remover o lobo superior do pulmão direito.
Fixar o lobo em um tubo cônico de 15 mililitros de formalina tamponada 10% neutra à temperatura ambiente por pelo menos 24 horas, e isolar os lóbulos restantes dos pulmões direito e esquerdo. Em seguida, coloque lóbulos em um tubo cônico de 15 mililitros, contendo dois mililitros de 1% de caseína em PBS no gelo. Use um pipetman de um mililitro com ponta para coletar o sangue que preenche a cavidade torácica, e transfira o sangue para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro no gelo.
Remova as glândulas e linfonodos parótidas, sublinguais e submaxilares que cobrem a traqueia, e abra e remova as membranas protetoras ao redor da traqueia. Usando fórceps finos e tesouras, separe cuidadosamente a traqueia do esôfago, e qualquer outro tecido conjuntivo do topo das clavículas até a parte inferior da mandíbula. Use fórceps para segurar a traqueia, e corte a traqueia no topo da clavícula.
Puxe a traqueia para maximizar a elasticidade, e corte a traqueia na parte inferior da mandíbula, bem acima da laringe, isolando cerca de um centímetro de tecido. Em seguida, coloque o órgão em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro pré-rotulado, contendo 0,3 mililitros de 1% de caseína em PBS no gelo. Agora gire o mouse para acesso claro ao nariz, e pulverize a cabeça com 70% de etanol.
Segure manualmente o animal diretamente atrás do crânio, e use uma tesoura para cortar a carne macia do focinho, começando da parte inferior do nariz e movendo-se para cima. Retire a pele, a pele e os bigodes ao redor do nariz, e insira as pontas de um par de tesouras curvas nas nares com as curvas apontadas para baixo. Abra a passagem nasal em direção aos olhos, criando uma formação em v.
Em seguida, use fórceps finos para coletar o septo nasal e tecido mole dentro da formação, e coloque o tecido em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros pré-rotulado contendo 0,3 mililitros de 1% de caseína em PBS, no gelo. Para processar o tecido pulmonar, transfira todo o conteúdo do tubo da amostra pulmonar em um homogeneizador do Dounce de 15 mililitros e use um pilão para homogeneizar o tecido. Dissociar a amostra até que não permaneçam grandes partículas de tecido e retorne a suspensão homogeneizada ao tubo original de 15 mililitros.
Remova uma alíquota de 0,3 mililitro para unidades formadoras de colônias de chapeamento e colete o resto do homogeneado por centrifugação. Alíquota 0,5 mililitros de supernascer em tubos de microcentrifuuge pré-rotulados para armazenamento a 20 graus Celsius até a análise da expressão citocina por Eliza. Em seguida, diluir em série 0,1 mililitros alíquotas da suspensão pulmonar homogeneizada em 0,9 mililitros de PBS estéril por diluição, e usar um divisor de triângulos estéril para placa 0,1 mililitro de cada diluição empiricamente escolhida em placas de 10% Bordet-Gengou mais estreptomicina.
Aqui, são mostrados 600 medições e cálculos de densidade óptica representativa para alcançar uma suspensão bacteriana de densidade óptica, para preparar um inóculo bacteriano diluído de cem vezes a ser entregue aos camundongos. Após sete dias de estimulação de antígenos vacinais, células de baço imunizadas do grupo de vacina combinada produzem interferon gama, e IL17, enquanto regulam significativamente o IL5, promovendo um ajudante T, um auxiliar T 17 polarização da resposta imune durante uma infecção por coqueluche B. A enumeração da unidade de formação de colônias de bactérias recuperadas de problemas do trato respiratório de um rato infectado por coqueluche B pode ser usada para avaliar os efeitos protetores da vacina de interesse.
Trabalhe o mais rápido e eficiente possível para evitar a necrose tecidual, e armazene o tecido isolado no gelo para preservar a viabilidade das bactérias recuperadas. A citometria de fluxo ELISpot e o isolamento de DNA e RNA podem ser realizados para avaliar células imunes, produção de analitos e permitir análises epigenéticas e transcriômicas. Ao trabalhar com agentes infecciosos como a coqueluche Bordetella, é importante lembrar de usar o EPI apropriado, e trabalhar em um armário de biossegurança certificado para evitar a transmissão de patógenos.
Este protocolo detalha a enumeração da UFC do trato respiratório, especificamente a faringe nasal. Para tirar dúvidas sobre a vacina e as áreas de doenças infecciosas sobre o direcionamento da colonização bacteriana no nariz.
