Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust através de subsídios à APM [076566/Z/05/Z], JCK [074,318] e um prêmio principal para o Wellcome Trust Centre para Genética Humana [075491/Z/04].

1) Cultura de Células <ol><li> Selecionar os tipos de células que expressam o gene de interesse. </li><li> Selecionar linhagens de células heterozigotas para ambas as variantes de risco e polimorfismo de DNA de codificação transcrito dentro do gene de interesse (Figura 1). </li><li> Cultura selecionado linhagens de células de acordo com as especificações do fornecedor e preparar 2 x 10 centímetros pratos petri para a extração de DNA e RNA, respectivamente. </li><li> Quando as células atingem 80% confluência iniciar o procedimento para as células colheitas e isolar DNA e RNA, quer mediante o procedimento descrito abaixo ou usando kits disponíveis comercialmente. </li></ol> 2) Extração de DNA <ol><li> Remova a mídia do prato, lavar com PBS e adicione ao prato 500 mL de uma solução de lise (0,6% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA e 50 mg / mL de RNase A). </li><li> Rocha a placa suavemente durante 20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Raspar o lisado de células em um tubo de microcentrífuga e incubar a 37 ° C durante a noite. </li><li> Adicionar proteinase K para uma concentração final de 100 mcg / ml e incubar a 37 ° C durante a noite. </li><li> Extrair o DNA com um volume igual de fenol-clorofórmio pH 8, repito, em seguida, extrair, com um volume igual de clorofórmio / álcool isoamílico. </li><li> Precipitar o DNA com 1 / 10 º volume 3 M NaCl e 2,5 volumes de etanol 100%. </li><li> Deixar no gelo por 5 min e depois girar a 13.000 rpm por 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavar o DNA com etanol 70%, deixe secar e ressuspender em 200 mL de TE. </li><li> Incubar a 65 ° C por 10 min e depois deixar por 2 dias à temperatura ambiente. </li><li> Armazenar a 4 ° C ou a longo prazo a -20 ° C. </li></ol> 3) Extração de RNA <ol><li> Remova a mídia do prato, lavar com PBS, adicione 1 mL de TRIzol e incubar por 10 min em temperatura ambiente. </li><li> Células raspar, pipeta alguns tempos de transferência, em um tubo de microcentrífuga e incubar por 5 min. </li><li> Giro por 10 min a 10.000 rpm a 4 ° C. </li><li> Transferir o sobrenadante em um novo tubo e adicionar 200 mL de clorofórmio. </li><li> Agitar e girar por 10 min a 10.000 rpm a 4 ° C. </li><li> Transferir a fase aquosa em um novo tubo e adicionar igual volume de etanol 70%. </li><li> Carregar a solução para 1 ou 2 (dependendo do volume) coluna RNeasy e spin por 30 segundos na velocidade máxima. </li><li> A partir daqui siga as instruções do kit RNeasy (Qiagen). </li></ol> 4) Preparação de amostras de ácido nucléico <ol><li> Quantificar DNA e RNA de concentração utilizando um Espectrofotômetro NanoDrop (Thermo Scientific). </li><li> Prepare cDNA de 500-1000 ng de RNA aleatórias e usando decamers SuperScript III Transcriptase Reversa (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 5) PCR e Ensaio Extensão Primer <ol><li> Desenho de dois pares de primers de PCR para cada marcador de DNA, um par para amplificação de DNA genômico e outro par para amplificação de cDNA (Fig. 2). Coloque frente e verso primer para amplificação de cDNA em exons diferentes para evitar a contaminação genômica. Cartilha de design para obter um produto PCR na faixa de 100-500 bp de comprimento. </li><li> Prepare a 10 mL reação de PCR, incluindo 0,5 U Taq Immolase (Bioline) 0,8 mM dNTPs, 2 mM MgCl 2, 0,2 M de cada primer e 20 ng de qualquer cDNA ou DNA. Ampliar cada amostra em quatro reações independentes. </li><li> Executar a reação de PCR nas condições otimizadas para cada par de primer mantendo número do ciclo na fase linear de amplificação. </li><li> Remover PCR primer e dNTPs excesso de incubação do produto da PCR com exonuclease I e Fosfatase Alcalina Camarão (SAP) a 37 ° C por 20 minutos. </li><li> Ponto cada produto PCR duas vezes em uma placa de 384 poços, de modo que oito medições estarão disponíveis para cada amostra. </li><li> Projeto de extensão do primer com o software Assay Design (Sequenom) para que o primer mesmo pode ser utilizado tanto para genômica e de cDNA produtos de PCR. Especificar o comprimento primário na faixa de 14-18 bp e mix de extensão, incluindo combinações de 3ddNTPs (Fig. 2). </li><li> Realizar a reação de extensão de primer e análise MALDI-TOF/MS usando o sistema MassARRAY (Sequenom) de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Uma reação típica de extensão cartilha inclui uma etapa a partir de 94 ° C por 2 min, seguida de 40 ciclos de 94 ° C por 5 s, 52 ° C por 5 s e 72 ° C durante 5 s. </li><li> Os produtos de extensão de primer são limpos com resina SpectroCLEAN e transferidos para microarray (chip) por SpectroPOINT dispenser nanolitre. </li><li> O oligonucleotides estendido são quantificados por MALDI-TOF usando um espectrômetro de massa SpectroREADER. </li></ol> 6) Análise Estatística <ol><li> Verificar os resultados MALDI-TOF/MS com o software Typer MassARRAY para a qualidade geral do experimento. </li><li> Extraia o relatório Allelotyping que inclui os dados da área dos picos. </li><li> Para cada indivíduo calcular o espectrorazão entre a área do pico do alelo 1 e alelo 2 (relação de área do pico). </li><li> Para cada amostra de cDNA derivar uma razão média de pico área e desvio padrão, usando a função correspondente no Excel, através do 8 medições. </li><li> Derive a relação de mesma área média do pico entre os 8 measurments de DNA genômico. </li><li> Divide a relação cDNA dizer com a relação do genoma significa para avaliar o desvio para a proporção de 1:1 esperado. </li></ol> 7) Controles Experimental <ol><li> Para descartar artefatos experimentais, repetir a experiência, pelo menos, três vezes. </li><li> Sempre que possível, os ensaios de design para marcadores de DNA adicional. </li><li> Design vários pares de primers PCR e primers extensão annealing às costas para a frente e para trás. </li><li> Sempre que possível teste como negativo controles linhas de células que são heterozigotos para os marcadores de DNA, mas não carregam o DNA variantes de risco associados com o fenótipo (Fig. 1 e Fig. 3.) </li></ol> 8) Resultados Representante Um exemplo de alelo-específico análise de expressão é mostrado na Figura 3, com exemplos de traços de espectrometria de massa. A figura mostra os resultados da análise de 4 alelo-específico produtos cartilha de extensão realizado em 4 modelos diferentes. Os gráficos topo representam os resultados obtidos a partir da análise do DNA genômico de duas linhas de células diferentes, que são heterozigotos para um polimorfismo transcrita codificação. No entanto, apenas uma linha de células é heterozigoto para a variante de DNA de risco (Figura 1). Os gráficos inferiores representam os resultados obtidos com a análise do cDNA gerado a partir das linhas de mesma célula. Como resultado do artefato experimental o primeiro pico é sempre maior do que o segundo pico mesmo na análise genômica. Portanto, os resultados da análise genômica são utilizados para normalizar os dados de cDNA. Após a normalização, a relação alelo é significativamente diferente de 1 em linhagem de células A (onde o segundo pico aparece menor em comparação com os espectros de outro), enquanto ele está muito próximo de 1 em linhagem de células B. Os dados sugerem que uma linha celular carrega um DNA variante, em fase com o alelo medido pelo segundo pico, o que reduz a expressão do gene em análise. Célula da linha B fornece um controle muito conveniente negativo. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Linhagens de células estratégia de seleção de linha. Célula A e B são heterozigotos para um marcador transcrita codificação (triângulo), mas apenas uma linha de células é heterozigoto para a variante de risco DNA (círculo). O alelo azul a variante de risco está associada (ou com um efeito directo ou porque, em estreita correlação com a variante actual funcionais) com um menor nível de transcrição. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Alelo-específico do ensaio de extensão primer. Esta figura mostra o fluxo de trabalho do procedimento experimental realizado para ambos DNA cDNA (esquerda) e genômica (direita) modelos. PCR (retângulos cinzas) são projetados para amplificar um polimorfismo heterozigotos codificação (triângulo). Para evitar a contaminação genômica PCR anneal seqüências colocado em exons diferentes (bares luz azul) quando a amplificação é realizada no modelo de cDNA. O produto da PCR é então usado como modelo para uma reação de extensão de primer realizado com um primer de extensão, uma base de recozimento ao lado do polimorfismo, ea mistura adequada de três dideoxynucleotide (ddNTPs) terminadores (quadrados) e um desoxinucleotídeo (círculo) para estender a cartilha de uma ou duas base, respectivamente. Os produtos resultantes de extensão de primer têm massas diferentes, que permitem a separação e quantificação por MALDI-TOF espectrometria de massa. A quantidade de produto correspondente ao alelo azul do marcador de DNA é relativamente mais baixos para o alelo vermelho. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Resultados de um alelo-específico do ensaio de expressão. A figura mostra os resultados de espectrometria de massa a partir da análise realizada no DNA genômico e do cDNA da linhagem celular de células A e B da linha (Figura 1).

<ol>
	<li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression.">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).</li><li>Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive,+quantitative+assay+for+measurement+of+allele-specific+transcripts+differing+by+a+single+nucleotide.">A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide.</a> PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).</li><li>Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+human+gene+expression.">Allelic variation in human gene expression.</a> Science. 297, 1143-11 (2002).</li><li>Ding, C., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+gene+expression+analysis+technique+using+competitive+PCR+and+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+MS.">A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).</li><li>Gabriel, S., Ziaugra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping+using+Sequenom+MassARRAY+7K+platform.">SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform.</a> Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).</li><li>Lo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+gene+expression+is+common+in+the+human+genome.">Allelic variation in gene expression is common in the human genome.</a> Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).</li><li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression-based+discovery+of+variation+in+the+human+glutathione+S-transferase+M3+promoter+and+functional+analysis+in+a+glioma+cell+line+using+allele-specific+chromatin+immunoprecipitation.">Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation.</a> Cancer Res. 65, 99-104 (2005).</li><li>Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+regulatory+polymorphisms+by+allele-specific+quantification+of+RNA+polymerase+loading.">In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading.</a> Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).</li><li>Pastinen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+genetic+and+epigenetic+variation+affecting+human+gene+expression.">A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression.</a> Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).</li><li>Francks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+77-kilobase+region+of+chromosome+6p22.2+is+associated+with+dyslexia+in+families+from+the+United+Kingdom+and+from+the+United+States.">A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States.</a> Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).</li><li>Paracchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromosome+6p22+haplotype+associated+with+dyslexia+reduces+the+expression+of+KIAA0319,+a+novel+gene+involved+in+neuronal+migration.">The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration.</a> Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este método permite a avaliação do efeito da doença associada a variantes de DNA na expressão do gene através da avaliação in vivo alelo-específico diferença no nível de transcrição. Neste protocolo abundância transcrição relativa é medida por MALDI-TOF, mas outras tecnologias que permite a quantificação alelo-específico, como TaqMan 6,7, pode ser usado. A principal limitação dessa abordagem é a disponibilidade de transcritos marcadores de codificação. Métodos baseados no princípio descrito aqui, mas aproveitando as diferentes classes de polimorfismos, têm sido descritas. O ensaio haploChip medidas alelo-específico expressão usando marcadores localizados a 1 kb do início da transcrição ou site final de um gene que estaria presente na cromatina materiais immunoprecipitated isolados com anticorpos específicos para o RNA polimerase II 8. Alternativamente, SNPs intrônicos pode ser utilizado quando o modelo é heteronuclear RNA 9. O protocolo específico descrito aqui, em combinação com o ensaio haploChip, tem sido utilizado com sucesso para identificar um gene candidato para a dislexia (ou incapacidade de leitura). Inicialmente um estudo de associação genética identificada uma seqüência de DNA associado com a dislexia e que foi ao longo de três genes 10. O alelo-específico do ensaio de expressão gênica mostrou que na presença da dislexia associados variação DNA expressão variantes foi observado por apenas um dos três genes, mas não os outros dois 11.

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4417-100TAB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27788.366</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308-500MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: chloroform</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77617</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100777C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-2.5L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immolase Taq</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21048</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DNTP100A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease 1</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>E70092Z</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroCLEAN resin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>10053</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassEXTEND ddNTP/dNTP mix </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Varies according to assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassEXTEND thermosequenase </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>10052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chilled microcentrifuge</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroPOINT nanolitre dispenser</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroREADER mass spectrometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an allele-specific gene expression assay to test the functional basis of genetic associations

O número significativo de associações genéticas com características complexas comuns está aumentando constantemente. No entanto, a maioria destas associações não foram compreendidas a nível molecular. Um dos mecanismos de mediação do efeito de variantes de DNA em fenótipos é de expressão gênica, que tem se mostrado particularmente relevante para traços complexos 1. Este método testa em um contexto celular o efeito de seqüências específicas de DNA na expressão gênica. O princípio é medir a abundância relativa de transcritos resultantes dos dois alelos de um gene, análise de células que carregam uma cópia de seqüências de DNA associadas com a doença (a variantes de risco) 2,3. Portanto, as células usadas para este método deve atender a dois requisitos fundamentais genotípica: eles têm que ser heterozigotos tanto para variantes de risco DNA e dos marcadores de DNA, polimorfismos tipicamente codificação, o que pode distinguir transcrições com base em sua origem cromossômicas (Figura 1). Variantes de DNA de risco e marcadores de DNA não precisa ter a freqüência do alelo mesmo, mas a fase de relacionamento (haplotypic) dos marcadores genéticos precisa ser entendido. Também é importante escolher os tipos de células que expressam o gene de interesse. Este protocolo se refere especificamente ao procedimento adotado para extração dos ácidos nucléicos a partir de fibroblastos, mas o método é igualmente aplicável a outros tipos de células, incluindo células primárias. DNA e RNA são extraídos das linhagens de células selecionadas e cDNA é gerado. DNA e cDNA são analisados, com um teor de extensão de primer, projetado para atacar os marcadores de DNA de codificação 4. O ensaio de extensão de primer é realizado usando o MassARRAY (Sequenom) 5 plataforma de acordo com as especificações do fabricante. Produtos de extensão de primer são então analisados ​​por matrix-assisted laser de dessorção / ionização de tempo de vôo-espectrometria de massa (MALDI-TOF/MS). Porque os marcadores selecionados são heterozigotos que irá gerar dois picos nos perfis de MS. A área de cada pico é proporcional à abundância transcrição e pode ser medido com uma função do software Typer MassARRAY para gerar uma relação de alelos (alelo 1: alelo 2) cálculo. A proporção alélica obtida para cDNA é normalizada usando essa medida a partir do DNA genômico, onde a proporção alélica deve ser de 1:1 para corrigir artefatos técnicos. Marcadores com uma relação normalizada alélicas significativamente diferentes de 1 indicam que a quantidade de transcrição gerados a partir de dois cromossomos na mesma cela é diferente, sugerindo que as variantes do DNA associado com o fenótipo ter um efeito sobre a expressão gênica. Controles experimentais devem ser utilizados para confirmar os resultados.

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An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Associações genéticas freqüentemente permanecem sem explicação em um nível funcional. Este método tem como objetivo avaliar o efeito do fenótipo associado marcadores genéticos na expressão do gene através da análise de células heterozigotos para SNPs transcritas. A tecnologia permite uma medição precisa por espectrometria de massa MALDI-TOF para quantificar alelo-específico produtos de extensão de primer.

Um alelo-específico do ensaio Expressão Gênica para testar as bases funcionais das Associações de Genética

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

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Research

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Biology

22.7K visualizações.  University of Oxford. Associações genéticas freqüentemente permanecem sem explicação em um nível funcional. Este método tem como objetivo avaliar o efeito do fenótipo associado marcadores genéticos na expressão do gene através da análise de células heterozigotos para SNPs transcritas. A tecnologia permite uma medição precisa por espectrometria de massa MALDI-TOF para quantificar alelo-específico produtos de extensão de primer.

Vídeo: An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Claro / escuro Teste de transição para Ratos

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Eletrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

A abordagem inversa Genética para Teste de Redundância funcional durante a embriogênese

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Farmacológica e funcional Ensaios genética para manipular Regeneração da planária Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

Os pequenos extratos nucleares para ensaios funcionais da expressão gênica Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...