Este trabalho foi financiado em parte por um Biomédica Busch Grant, conceder NSF IBN-0548543, conceder NSF IBN-0919747, March of Dimes Foundation Grant 1-AF04-107, March of Dimes Foundation Grant 1-AF08-464 (para BLF). MKK e CGL foram apoiados pelo NIH Biotecnologia Training Grant GM008339 T32-20, e CGL também foi apoiado por uma Comissão NJ em Fellowship Spinal Cord Research Predoctoral 08-2941-SCR-E-0.

1. Antes de começar: 1) E18 dissecção de ratos: Métodos de dissecção padrão de E18 neurônios do hipocampo tenham sido previamente descrito 13. , A fim de usar o programa da fogueira para analisar as características morfológicas das neurites, imagens de 8 bits. Tif de neurônios individuais devem ser obtidos. Isso pode ser feito em uma série de maneiras dependendo do protocolo experimental que está a seguir. Neurônios podem ser banhado com uma densidade suficientemente baixa para que os neurônios individuais aparecem no campo do microscópio. Como alternativa, para os neurônios individuais de imagem que são cultivadas em uma cultura densa, os neurônios podem ser transfectadas usando uma variedade de métodos de transfecção com um plasmídeo uma proteína fluorescente. 2) Requisitos de Software e Instalação: <ol class="ualpha"><li> O plugin NeuronJ para o software ImageJ do NIH e NeuronStudio devem estar instalados para executar o programa da fogueira. Os pacotes de software podem ser encontradas nos seguintes sites: ImageJ - <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> NeuronJ - <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> NeuronStudio - <a href="http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html">http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html</a> </li><li> O programa Bonfire podem ser encontradas em http://lifesci.rutgers.edu/ ~ Firestein. O manual do usuário Bonfire também está disponível neste site. Além disso, a descrição inicial de Bonfire pode ser encontrado em Langhammer et al, Citometria de 2010. Todos os nossos dados foram analisados ​​usando um sistema operacional Windows. </li></ol> 3) Ajuste de Resolução de Imagem: Você precisará ajustar o programa Bonfire baseado na resolução de imagem das imagens que você deseja analisar. Na parte bonfire_parameters do programa Bonfire, substitua o valor atual para o pix_conv variável com o valor da resolução de imagem (M / pixel) de suas imagens. 2. Estrutura do arquivo: Para que Bonfire para analisar os dados, os arquivos devem ser organizados nesta estrutura específica (Figura 2). Você terá: <ul><li> A pasta principal </li><li> Sub-pastas (contendo cada uma de suas diferentes condições) </li><li> Arquivos de célula de imagem (arquivos filename.tif) contidos nas pastas condição diferente </li><li> A pasta contendo o Bonfire Bonfire Matlab mfiles (também contida na pasta master) </li></ul> 3. Neurônios rastreamento em NeuronJ: <ol><li> Preparar a imagem para rastreamento <ol class="lalpha"><li> Abra a imagem, selecionando o botão &quot;Abrir&quot; na barra de ferramentas NeuronJ e selecionando a imagem que você gostaria de rastrear. </li><li> Redimensionar a imagem, selecionando o botão &#39;maximizar&#39;. </li><li> Ajustar o brilho eo contraste da imagem para que você possa visualizar todas as neurites, selecionando &#39;Image&#39; na barra de ferramentas NeuronJ então selecionar &#39;Ajuste de brilho / contraste &quot;. </li></ol></li><li> Traçar o corpo celular no NeuronJ e identificar o traço como sendo &quot;Tipo 06&quot; <ol class="lalpha"><li> Clique no botão &quot;Add Traces &#39;na barra de ferramentas NeuronJ. </li><li> Traço em torno do perímetro do corpo celular. </li><li> Clique no botão &quot;Traçados Label &#39;na barra de ferramentas NeuronJ. </li><li> Selecione &#39;N1&#39; do &#39;Tracing ID&#39; menu dropdown. </li><li> &quot;Tipo 06&quot; selecionar no NeuronJ: Atributos janela e selecione &#39;OK&#39;. </li></ol></li><li> Traçar o neurites em NeuronJ <ol class="lalpha"><li> Clique no botão &quot;Add Traces &#39;na barra de ferramentas NeuronJ. </li><li> Adicionar um traço ao longo de cada ramo de neurite. Você pode selecionar apenas os dendritos ou o axônio, dependendo da sua experiência. </li><li> Sugerimos que os segmentos de desenhar parar em cada ponto de ramificação, com cada ponto de ramificação filha a partir de que ponto como um novo rastreamento. </li><li> Clique no botão &quot;Salvar Traçados &#39;na barra de ferramentas NeuronJ. </li><li> Salve o traçado que acabou de criar na mesma pasta que o arquivo de imagem original. </li></ol></li><li> Exportar os arquivos de rastreamento eo arquivo identificador de rastreamento a partir de NeuronJ Dois tipos de arquivos devem ser exportados do NeuronJ e salvos nas pastas condição apropriada junto com o. Tif e arquivos. Ndf. <ol class="lalpha"><li> Selecione o botão &#39;Trace Export&#39; na barra de ferramentas NeuronJ. </li><li> Selecione a opção &quot;Tab-deliminated arquivos-texto: arquivo separado para&quot; opção no &quot;cada traçado NeuronJ: Export&quot; caixa de diálogo e selecione &#39;OK&#39;. </li><li> Permitir NeuronJ para escolher os nomes dos arquivos e guardar o local. </li><li> Clique no botão &quot;Traçados Medida &#39;na barra de ferramentas NeuronJ. </li><li> Selecione a opção &quot;Mostrar medidas rastreamento &#39;no&#39; NeuronJ: Medições&quot; janela e selecione &quot;Executar&quot;. </li><li> &#39;File&#39; Selecione na &quot;NeuronJ: Traçados &#39;janela. </li><li> Selecione &#39;Salvar Como&#39; e salve o arquivo como filename_info. &#39;Filename&#39; deve corresponder exatamente ao nome do arquivo de imagem original (incluindo capitalização), seguido por _info e não devem conter de 3 letras extensão do arquivo. Por exemplo, para Cell20.tif imagem original nome, este arquivo seria chamado &#39;Cell20_info&#39;. Verifique se o computador não adiciona automaticamente uma extensão de arquivo. Xls. Se isso acontecer, a extensão do arquivo deve ser excluído manualmente. </li></ol></li></ol> 4. Use Bonfire preliminares para construir arquivos de dados swc NeuronJ.: <ol><li> Reorganize as pastas usando &#39;bonfire_load&#39; <ol class="lalpha"><li> Abra Matlab clicando duas vezes sobre o ícone. </li><li> Clique no botão &#39;&#39; no canto superior direito da janela de comando. </li><li> Selecione o &quot;Bonfire&quot; pasta na sua pasta de mestre no &quot;Procurar Pasta&quot; janela. </li><li> Tipo &#39;bonfire_load&#39; na janela de comandos Matlab e pressione enter. </li><li> Selecione a pasta condição que você deseja analisar no &quot;Procurar Pasta&quot; janela e selecione &#39;OK&#39;. </li><li> Isto irá reorganizar a estrutura de pastas, criando células sub-pastas que contêm todos os dados para cada célula individual. </li></ol></li><li> Criar arquivos filename_prelim.swc usando &#39;bonfire_ndf2swc&#39; <ol class="lalpha"><li> &quot;Bonfire_ndf2swc &#39;digitar na janela de comando e pressione enter. </li><li> Selecione a pasta mesma condição que você acabou de reorganizada com &#39;bonfire_load&#39; no campo &#39;Procurar Pasta &quot;janela e selecione&#39; OK &#39;. </li><li> Isso irá criar um arquivo. Swc em cada pasta de células para a condição de escolhido. Cada pasta celular agora irá conter cinco arquivos;. Tif a imagem original, o arquivo ndf, o arquivo identificador _info traço, um arquivo txt e um arquivo swc.... </li></ol></li></ol> 5. Use a NeuronStudio Finalize arquivos SWC.: <ol><li> Abrir e calibrar imagens neurônio em NeuronStudio <ol class="lalpha"><li> Abra o programa NeuronStudio. </li><li> Selecione Arquivo → Abrir na barra de ferramentas NeuronStudio. </li><li> Encontrar a imagem. Tif do neurônio que você deseja editar e abri-lo. </li><li> Selecione Executar → Configurações e digite &#39;1 &#39;em cada um dos 3 (X, Y, Z) caixas na &quot;janela Tamanho Voxel&quot;. </li><li> Selecione Arquivo → SWC Import. Selecione o arquivo apropriado. Swc. O arquivo de imagem agora será revestida com uma imagem de rastreamento. A soma das células deve ser coberta com um círculo vermelho. </li></ol></li><li> Use NeuronStudio para neurites ligação <ol class="lalpha"><li> Use as ferramentas no NeuronStudio para identificar corretamente pontos de ramificação e pontos finais (recomendamos que você se familiarizar com as características NeuronStudio e atalhos antes de analisar seus dados). </li><li> Especificamente, use a &quot;ferramenta de neurite&quot; para juntar os nós de modo que: <ul><li> Cada ponto de ramificação (nós amarelo) só pode criar dois ramos </li><li> Todos os traços são contínuos com a soma (apenas um nó vermelho) </li></ul></li></ol></li><li> Exportar dados do NeuronStudio <ol class="lalpha"><li> Selecione Neuritos File → Save (salvar como o nome padrão). </li></ol></li><li> Verificar se há erros em arquivos. Swc usando &#39;bonfire_trace_check&#39; <ol class="lalpha"><li> &quot;Bonfire_trace_check &#39;digitar na janela de comando Mathlab e pressione enter. </li><li> Selecione a pasta condição contendo os dados que você acabou processado no &quot;Procurar Pasta&quot; janela e selecione &#39;OK&#39;. </li><li> Se houver algum erro em qualquer uma das imagens na pasta o programa vai exibir imagens de saída, onde está localizado o erro. </li><li> Correção de erros em NeuronStudio <ol class="lroman"><li> Abra o arquivo de imagem que você salvou na etapa de exportação. </li><li> Localizar e corrigir o problema (s). </li><li> Clique em Arquivo → Salvar Neuritos. </li><li> Repita a operação para outras imagens que precisam ser corrigidos. </li><li> Execute novamente &quot;bonfire_trace_check &#39;(5.4). </li></ol></li></ol></li></ol> 6. Use &#39;fogueira&#39; para extrair dados morfológicos de arquivos swc.: <ol class="lalpha"><li> &#39;Fogueira&#39; digitar na janela de comando e pressione enter. </li><li> Selecione a pasta condição que contém os dados que deseja analisar no &quot;Procurar Pasta&quot; janela e selecione &#39;OK&#39;. </li><li> A análise da fogueira irá gerar uma janela para cada um dos neurônios em análise, em que a morfologia neuronal gráficos juntamente com os anéis Sholl utilizados na análise. Além disso, o comando &#39;fogueira&#39; irá gerar o arquivo. Mat que contém todas as informações morfológicas que foi tomada a partir da análise. </li></ol> 7. Use &#39;bonfire_results&#39; para visualizar os dados: <ol class="lalpha"><li> Tipo &#39;bonfire_results&#39; na janela de comandos Matlab. </li><li> Selecione a pasta condição para a condição que você gostaria de ver no &quot;Procurar Pasta&quot; janela e selecione &#39;OK&#39;. </li><li> O &quot;Procurar Pasta&quot; janela será fechada temporariamente e re-aberto, permitindo que você selecione condições adicionais que você gostaria de ver. </li><li> Quando você terminar de selecionar pastas condição, selecione &#39;Cancelar&#39; para sair do processo de seleção. </li><li> &quot;Bonfire_results &#39;retornará gráficos sumário, incluindo ªdados e das pastas condição que você selecionou. </li></ol> 8. Use &#39;bonfire_export&#39; para exportar dados para o Excel: <ol class="lalpha"><li> Tipo &#39;bonfire_export&#39; na janela de comando. </li><li> Selecione a pasta condição contendo os dados que você gostaria de exportação no &quot;Procurar Pasta&quot; janela e selecione &#39;OK&#39;. Bonfire_export irá criar arquivos de Excel dos dados morfológicos e irá colocá-los na pasta condição que foi selecionado. </li></ol> 9. Resultados representativos: Um exemplo dos dados gerados pelo programa Bonfire em um conjunto de dados contendo duas condições é mostrado na Figura 3. Neste exemplo, Condição 1 neurônios que contêm neurites mais distal para o corpo celular. Este fenômeno pode ser observado nas imagens de exemplo (Figura 3B), bem como na curva Sholl do total dendríticas arbor (Figura 3A) e no gráfico do número de pontos terminais (Figura 3C). Além disso, porque o programa também realiza a análise Bonfire Sholl em sub-regiões das imagens, que são capazes de identificar mais especificamente a identidade do neurites que têm aumentado. Tanto o número total de interseções de 3 ª ordem ou neurites maior (Figura 3F) eo número total de ambos os intermediários e neurites terminal (Figura 3G) são aumentadas distal para o corpo celular. Essas tendências também podem ser observados nas Figuras 3D e 3E. <img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1:. Fluxograma do programa Bonfire Neurônios são rastreados usando ImageJ. Os dados são então exportados e convertidos pelo programa Bonfire em preliminar. Swc arquivos. NeuronStudio é usado para definir a conectividade do neurites. Verifica fogueira para erros e, em seguida, calcula as curvas de Sholl, o número de primário, neurites ordem secundária e superior, eo número de pontos de ramificação e dicas neurite. Finalmente, os dados são exportados para Excel para análise estatística. <img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Estrutura de arquivos necessários para a análise da fogueira A estrutura do arquivo deve corresponder a este ou o programa não será executado corretamente.. Os nomes das pastas e arquivos e da quantidade de pastas e arquivos podem ser alterados. <img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Exemplo de dados de saída do programa Bonfire A) curvas Sholl Total.. B) Exemplo invertida imagens de ambas as condições. C) Número médio de pontos de ramificação e pontos terminais / célula. D) O número médio de processos / celular para primário, secundário e terciário ou superior neurites. E) Número médio de processos / celular para o root, intermediário e neurites terminal. F) identidades específicas Segmento curvas de análise de Sholl. Segmentos são agrupados como primário, secundário ou terciário ou superior. G) a identidade específica do segmento curvas de análise de Sholl. Segmentos são agrupados em segmentos radiculares, segmentos intermediários, ou segmentos terminal.

<ol>
	<li>Elston, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+cells+of+the+frontal+lobe:+all+the+more+spinous+to+think+with.">Pyramidal cells of the frontal lobe: all the more spinous to think with.</a> J Neurosci. 20, (2000).</li><li>Koch, C., Segev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+single+neurons+in+information+processing.">The role of single neurons in information processing.</a> Nat Neurosci. , 1171-1177 (2000).</li><li>Poirazi, P., Mel, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+active+dendrites+and+structural+plasticity+on+the+memory+capacity+of+neural+tissue.">Impact of active dendrites and structural plasticity on the memory capacity of neural tissue.</a> Neuron. 29, 779-796 (2001).</li><li>Schaefer, A. T., Larkum, M. E., Sakmann, B., Roth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coincidence+detection+in+pyramidal+neurons+is+tuned+by+their+dendritic+branching+pattern.">Coincidence detection in pyramidal neurons is tuned by their dendritic branching pattern.</a> J Neurophysiol. 89, 3143-3154 (2003).</li><li>Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+action+potentials+in+dendrites+depends+on+dendritic+morphology.">Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology.</a> J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).</li><li>Hausser, M., Spruston, N., Stuart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+dynamics+of+dendritic+signaling.">Diversity and dynamics of dendritic signaling.</a> Science. 290, 739-744 (2000).</li><li>Brette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulation+of+networks+of+spiking+neurons:+a+review+of+tools+and+strategies.">Simulation of networks of spiking neurons: a review of tools and strategies.</a> J Comput Neurosci. 23, 349-398 (2007).</li><li>Arendt, T., Zvegintseva, H. G., Leontovich, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+changes+in+the+basal+nucleus+of+Meynert+and+in+the+diagonal+band+nucleus+in+Alzheimer's+disease--a+quantitative+Golgi+investigation.">Dendritic changes in the basal nucleus of Meynert and in the diagonal band nucleus in Alzheimer's disease--a quantitative Golgi investigation.</a> Neuroscience. 19, 1265-1278 (1986).</li><li>Harrison, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropathology+of+schizophrenia.+A+critical+review+of+the+data+and+their+interpretation.">The neuropathology of schizophrenia. A critical review of the data and their interpretation.</a> Brain. 122, 593-624 (1999).</li><li>Lewis, D. A., Glantz, L. A., Pierri, J. N., Sweet, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cortical+glutamate+neurotransmission+in+schizophrenia:+evidence+from+morphological+studies+of+pyramidal+neurons.">Altered cortical glutamate neurotransmission in schizophrenia: evidence from morphological studies of pyramidal neurons.</a> Ann N Y Acad Sci. 1003, 102-112 (2003).</li><li>Kaufmann, W. E., Moser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+anomalies+in+disorders+associated+with+mental+retardation.">Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation.</a> Cereb Cortex. 10, 981-991 (2000).</li><li>Georges, P. C., Hadzimichalis, N. M., Sweet, E. S., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin-yang+of+dendrite+morphology:+unity+of+actin+and+microtubules.">The yin-yang of dendrite morphology: unity of actin and microtubules.</a> Mol Neurobiol. 38, 270-284 (2008).</li><li>Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cypin:+a+cytosolic+regulator+of+PSD-95+postsynaptic+targeting.">Cypin: a cytosolic regulator of PSD-95 postsynaptic targeting.</a> Neuron. 24, 659-672 (1999).</li></ol>

Os autores declaram que não há interesses conflitantes. As agências financiadoras não tinham papel científico no desenvolvimento da fogueira.

O programa Bonfire é um programa semi-automático para a análise de dendrite e morfologia axônio. Ela aumenta muito a eficiência ea precisão da análise de Sholl mais de realizar a análise manualmente. Além disso, o programa Bonfire salva os dados em cada etapa do processo, tornando possível a auditar os dados e verificar a precisão da análise. Portanto, a tarefa de análise de dados podem ser distribuídos para inúmeras pessoas sem comprometer a precisão. Por último, realizando a análise em sub-regiões d...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
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		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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<td>NeuronJ plugin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a></td>
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<tr>
<td>ImageJ software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a></td>
</tr>
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<td>Bonfire program</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://lifesci.rutgers.edu/~firestein">http://lifesci.rutgers.edu/~firestein</a></td>
</tr>
<tr>
<td>NeuronStudio</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html">http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>MatLab Program</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MathWorks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated sholl analysis of digitized neuronal morphology at multiple scales

Morfologia neuronal desempenha um papel significativo na determinação de como os neurônios de função e comunicar 1-3. Especificamente, ele afeta a capacidade dos neurônios para receber insumos de outras células 2 e contribui para a propagação de potenciais de ação 4,5. A morfologia das neurites também afeta a forma como a informação é processada. A diversidade de morfologias dendrite facilitar a sinalização de faixa de locais e de longa e permitir que os neurônios individuais ou grupos de neurônios para realizar funções especializadas dentro da rede neuronal 6,7. Alterações na morfologia dendrite, incluindo a fragmentação dos dendritos e mudanças nos padrões de ramificação, foram observados em um número de estados de doença, incluindo a doença de Alzheimer 8, 9,10 esquizofrenia e retardo mental 11. A capacidade de entender os fatores que moldam morfologias dendrite e para identificar alterações nas morfologias dendrite é essencial na compreensão da função do sistema nervoso e disfunção. Morfologia neuritos muitas vezes é analisado por análise de Sholl e contando o número de neurites e do número de pontas de galhos. Esta análise é geralmente aplicado a dendritos, mas também pode ser aplicado para os axônios. Fazer esta análise com a mão é tanto demorado e inevitavelmente introduz variabilidade devido ao preconceito de experimentador e inconsistência. O programa da fogueira é uma abordagem semi-automática para a análise da dendrite e morfologia axônio que se baseia em open-source disponíveis ferramentas de análise morfológica. Nosso programa permite a detecção de mudanças locais no dendrito e axônio ramificação comportamentos através da realização de análise de Sholl na sub-regiões do arbor neuríticas. Por exemplo, a análise de Sholl é realizado em ambos os neurônio como um todo, bem como sobre cada subconjunto de processos (primário, secundário, terminal root, etc) Dendrite e padronização axônio é influenciado por uma série de fatores intra e extracelulares, muitos agir localmente. Assim, a morfologia arbor resultante é um resultado de processos específicos agindo em neurites específicos, tornando-se necessário realizar uma análise morfológica em uma escala menor, a fim de observar estas variações locais 12. O programa da fogueira requer o uso de duas ferramentas open-source de análise, o plugin para NeuronJ ImageJ e NeuronStudio. Neurônios são traçados no ImageJ e NeuronStudio é usado para definir a conectividade entre neurites. Bonfire contém uma série de scripts personalizados escritos em MATLAB (MathWorks) que são usados ​​para converter os dados para o formato apropriado para posterior análise, verificar os erros do usuário, e, finalmente, realizar a análise Sholl. Finalmente, os dados são exportados para Excel para análise estatística. Um fluxograma do programa Bonfire é mostrado na Figura 1.

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Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Nós desenvolvemos um programa de computador para analisar a morfologia neuronal. Em combinação com dois existentes ferramentas de análise de código aberto, o nosso programa realiza análise de Sholl e determina o número de neurites, pontos de ramificação, e dicas de neurite. As análises são realizadas para que as mudanças locais na morfologia neurite pode ser observado.

Análise Sholl automatizado de Morfologia Neuronal Digitized em múltiplas escalas

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

automated-sholl-analysis-digitized-neuronal-morphology-at-multiple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

33.3K visualizações.  Rutgers University. Nós desenvolvemos um programa de computador para analisar a morfologia neuronal. Em combinação com dois existentes ferramentas de análise de código aberto, o nosso programa realiza análise de Sholl e determina o número de neurites, pontos de ramificação, e dicas de neurite. As análises são realizadas para que as mudanças locais na morfologia neurite pode ser observado.

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Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Neurociência

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent and divergent anatomical connections including feed forward and feedback wiring. Furthermore, information of the same origin is partially sent via parallel pathways to different and sometimes into the same brain areas. To understand the evolutionary benefits as well as the computational advantages of these wiring strategies and especially their temporal dependencies on each other, it is necessary to have simultaneous access to single neurons of different tracts or neuropiles in the same preparation at high temporal resolution. Here we concentrate on honeybees by demonstrating a unique extracellular long term access to record multi unit activity at two subsequent neuropiles1, the antennal lobe (AL), the first olfactory processing stage and the mushroom body (MB), a higher order integration center involved in learning and memory formation, or two parallel neuronal tracts2 connecting the AL with the MB.&#160;The latter was chosen as an example and will be described in full. In the supporting video the construction and permanent insertion of flexible multi&#160;channel wire electrodes is demonstrated. Pairwise differential amplification of the micro&#160;wire electrode channels drastically reduces the noise and verifies that the source of the signal is closely related to the position of the electrode tip. The mechanical flexibility of the used wire electrodes allows stable invasive long&#160;term recordings over many hours up to days, which is a clear advantage compared to conventional extra&#160;and intracellular in vivo recording techniques.

Simultaneous extracellular long term recordings from two different brain neuropiles or two different anatomical tracts were established in honeybees. These recordings allow the investigation of temporal aspects of neuronal processing across different brain areas at the single neuron as well as at the ensemble level in a behaving animal.

Gravações simultâneas de longo prazo em dois estágios de processamento neuronal em comportar abelhas

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, formed by ribosomes, mRNAs, several proteins and non-coding RNAs, represent integrated platforms where translational controls take place. However, while the ribosome has been widely studied, the organization of polysomes is still lacking comprehensive understanding. Thus much effort is required in order to elucidate polysome organization and any novel mechanism of translational control that may be embedded. Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that allows the acquisition of 3D images at nanoscale resolution. Compared to electron microscopy (EM) techniques, one of the main advantages of AFM is that it can acquire thousands of images both in air and in solution, enabling the sample to be maintained under near physiological conditions without any need for staining and fixing procedures. Here, a detailed protocol for the accurate purification of polysomes from mouse brain and their deposition on mica substrates is described. This protocol enables polysome imaging in air and liquid with AFM and their reconstruction as three-dimensional objects. Complementary to cryo-electron microscopy (cryo-EM), the proposed method can be conveniently used for systematically analyzing polysomes and studying their organization.

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Olhando para Cérebro polissomos com Microscopia de Força Atômica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

Medindo Progressive Neurological Disability em um modelo de rato com esclerose múltipla

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analisando dendríticas Morfologia em Colunas e Camadas

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

Análise de marcha automatizados em ratos com lesão crônica de constrição

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

Análise quantitativa da arborização dendrítica Neuronal complexidade em Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...