Este trabalho é apoiado pelo National Institutes of Health (NIH R01 AI46435) eo RMRCE (NIH AI065357).

O protocolo a seguir foi escrito para produção e utilização de uma ATS baseado no vírus Sindbis MRE16. A ATS é projetado para expressar GFP no vetor mosquito Aedes aegypti. cDNA clones infecciosos de uma série de alfavírus (Sindbis vírus, Chikungunya vírus, O&#39;nyong-Nyong vírus, vírus da encefalite eqüina ocidental) estão atualmente disponíveis que foram concebidos como ATS (Tabela 1). Para melhores resultados DNA plasmídeo é amplificado em bactérias, tais como bactérias CERTEZA competente (Stratagene / Agilent Technologies) para evitar a recombinação indesejada e perda do cDNA viral. Todos os plasmídeos clone infecciosas têm um bacteriófago T7 SP6 ou promotor na 5 imediato &quot;fim do cDNA viral para a transcrição do RNA genômico de comprimento total e uma endonuclease de restrição única na extremidade 3 &#39;para a transcrição escoamento. Para cada ATS, os usuários devem usar o apropriado bacteriófago DNA polimerase RNA dependente e endonuclease de restrição único para transcrição in vitro do genoma RNA viral. 1. Geração de RNA Infecciosas da Clone de cDNA. <ol><li> Linearizar a 5μg do clone infeccioso plasmídeo (p5&#39;dsMRE16 / GFP), com 20 unidades de XhoI enzima de restrição em uma reação de 100 L. Incubar por 2-3h a 37 ° C </li><li> Purificar DNA linearizado usando Qiagen QIAprep rotação Miniprep Kit protocolo de purificação alternativo, eluição do DNA da coluna de spin usando 50 água RNase mL. Plasmídeo de concentração deve ser de aproximadamente 1,0 mcg / mL. </li><li> Em um 0,2 mL RNase tubo PCR, set-up de 50 mL de reação de transcrição usando Ambion Kit MAXIscript por protocolo a seguir. <ul><li> 22,5 mL RNase dH 2 O <ul><li> 5,0 mL modelo de DNA linearizada (1,0 mcg / mL) </li><li> 2,5 mL 10mM ATP </li><li> 2,5 mL 10mM CTP </li><li> 2,5 mL 10mM UTP </li><li> 2,5 mL GTP 1mM </li><li> 2,5 mL tampão 10mM analógico (7 G m (5 &#39;) ppp (5&#39;) G) </li><li> 5,0 mL tampão de transcrição 10X </li><li> 5,0 mL ou T7 SP6 mix polimerase </li></ul></li><li> Total de 50,0 mL </li></ul></li><li> Incubar a reação de transcrição para 1 hora a 37 ° C. Após a incubação, a reação deve ser utilizado imediatamente para eletroporação de células BHK-21. Preparação das células BHK-21 para o eletroporação deve começar durante a reação de transcrição de incubação. </li></ol> 2. Geração de vírus de RNA Infecciosas <ol><li> Trypsinize dois 70-80% 150 cm confluentes 2 (T-150) frasco de células BHK-21 por ATS. </li><li> Transferência de todas as células para um tubo de centrífuga de 15 mL cônico. </li><li> Agregar as células por centrifugação a 2000 rpm, 10 min, 4 ° C em uma centrífuga de mesa convencional. </li><li> Ressuspender as células em PBS estéril e sem Mg + + e Ca + +. Repita os passos 2.3 e 2.4 até que as células foram lavadas três vezes com PBS. </li><li> Ressuspender o pellet células 0,5 mL de MEM contendo 10% FBS. </li><li> Diluir 10 mL de células com 90 mL de MEM com 10% de FBS e contar com um hemocitômetro. Se necessário, diluir para células 2,5-12,5 x 10 7 células / mL com MEM contendo 10% FBS. </li><li> Para uma cuvete gelada eletroporação 0,2 centímetros, adicione 400 mL de suspensão celular e 20 mL de reação de transcrição. Limpe a condensação da cuvete. </li><li> O pulso da cuvete duas vezes: 450V, 1200Ω, 150 mF. Usamos uma Manipulator celular Electro, Harvard Apparatus Modelo ECM630. </li><li> Coloque todo o conteúdo da cubeta em um frasco de 25 centímetros de cultura de tecidos 2 contendo 5 mL de MEM com 10% de FBS. </li><li> Incubar frasco (s) em 37C com 5% de CO 2. </li><li> Monitorar a infecção diariamente em microscópio invertido fluorescentes com o conjunto filtro apropriado (por exemplo, GFP filtro: comprimento de onda de excitação = 460-490 nm, comprimento de onda de emissão = 510-550 nm; ou dsRed filtro: comprimento de onda de excitação = 460-560 nm, comprimento de onda de emissão =&gt; 590 nm). </li><li> Fluorescência quando sugere infecção é confluente e / ou CPE é visível em todo o frasco, recolher o conteúdo do frasco, adicionar 30% FBS, alíquota, conforme necessário, e armazenar a -80 ° C. Se desejar, lisados ​​celulares pode ser eliminado por centrifugação (2000 rpm, 10 min, 4 ° C) antes da adição de FBS. </li><li> Passagem do vírus pelo menos uma vez através de um frasco novo de células para aumentar a título de vírus para os ensaios de alimentação posterior sangue. </li></ol> 3. Per os Infecção de Mosquitos <ol><li> Misture sangue (normalmente adquiridos de-fibrinated sangue de carneiro) e de cultura de células-suspensão de vírus derivados a partir do passo 2.13. Título de vírus final na refeição de sangue normalmente deve ser ~ 1x10 7 unidades formadoras de placa (UFP) / mL para a infecção do intestino médio eficiente do mosquito. Para estimular mosquitos para engorge, adenosina 5&#39;-trifosfato (ATP) pode ser adicionado a uma concentração final de 0,02. </li><li> Os mosquitos podemtem que ser privado de água e açúcar antes da infecção para estimulá-los para alimentar de forma eficiente o sangue de um alimentador artificial. Duração de privação deve ser previamente estabelecido para minimizar a mortalidade. Vezes vai depender de espécies de mosquitos, a umidade do insetário etc Como ponto de partida, remova 24h e 12h de açúcar água antes da alimentação. Este protocolo usa jaqueta de água de vidro feeders17 com circulação de água 37 ° C. Uma membrana intestinal suína (ou seja, muito bem lavados salsicha caixa disponível na maioria dos supermercados) é colocado sobre a boca do alimentador e da refeição é pipetado para dentro da câmara. Vários projetos, membranas e protocolos estão disponíveis para os tipos de vetores diferentes. </li><li> Os mosquitos são classificados para selecionar apenas os mosquitos ingurgitados com sangue. Mosquitos ingurgitados são transferidos para uma caixa de papelão com organdi na parte superior e os mosquitos são incubados a 28 ° C, 75-80% de umidade relativa até ser transformado para a expressão GFP. </li></ol> 4. Inoculação intratorácica de mosquitos Inoculação intratorácica é um método alternativo para infectar o artrópodes. Este método é utilizado quando a divulgação através do intestino médio não é necessário. (Método descrito abaixo, mas a técnica não é mostrado neste experimento visual). <ol><li> Um pequeno número de mosquitos (5-10) é aspirada das gaiolas segurando em plástico tubos de exploração. Os tubos selados exploração, que será colocado a 4 ° C por 15 min para relaxar os mosquitos. </li><li> 2 5 mosquitos será derramado do tubo para uma placa de Petri de vidro descansando sobre o gelo. Coloque a tampa sobre a placa de Petri quando não em uso ou se os mosquitos começam a se mover. Durante o manuseio dos mosquitos, os cuidados devem ser tomados para contar e acompanhar o número de mosquitos sendo manipulado. Como os mosquitos são derramados sobre a mesa frio, o número total será registrado em um contador de laboratório. </li><li> A agulha é preparado pela fusão tubos capilares de vidro usando Nanoject específico e um extrator de agulhas. </li><li> Configurar o Nanoject II microinjetor acordo com as instruções do fabricante para entrega de 69 nL inóculo. Cuidado deve ser exercitado quando o inóculo de desenho para dentro da agulha de modo que a agulha não está danificado. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, inserir a agulha no tórax do mosquito e ativar o Nanoject para inoculação. Cuidado deve ser exercido quando inocular os mosquitos para que a agulha não penetra completamente o mosquito e sair do outro lado, resultando na morte subseqüente do mosquito. Verifique cada mosquito ter certeza de que o inóculo entrou antes de a retirar a agulha. </li><li> Após a inoculação, enquanto o mosquito ainda é empalado com a agulha, coloque-o em uma caixa de papel de participação através de um pequeno orifício no lado que está conectado com algodão ou uma rolha de cortiça em todas as outras. </li><li> Quando os mosquitos têm inoculadas e colocadas na caixa (até cerca de 50 por caixa), fita com cuidado a rolha no lugar para impedir a liberação acidental do mosquito. Coloque as caixas em uma holding bin segura antes de incubação mais no insetário a 28 ° C% de umidade relativa e 80. </li></ol> 5. Infecção monitoramento de mosquitos <ol><li> Coloque a caixa de papel segurando a 4 ° C por aproximadamente 15 minutos para imobilizar mosquitos. </li><li> Transferência de um pequeno número de mosquitos (10/05 de cada vez) a uma tabela frio adaptadas para uso em um microscópio fluorescente. </li><li> Examinar e classificar os mosquitos com base na presença ou ausência de fluorescência. Além disso, a intensidade fluorescente pode ser usado como uma medida quantitativa da infecção de proxy. Tecidos, como intestino médio do mosquito, glândulas salivares, de gordura corporal pode ser dissecada e monitorados para fluorescência. </li><li> Se for o caso, o retorno mosquitos selecionados para caixa de papel para continuar a incubação de mosquitos infectados. </li></ol> 6. Ensaio de transmissão (salivação forçado a demonstrar transmissão do vírus) <ol><li> Privar os mosquitos da fonte de açúcar por 24 h antes da alimentação. </li><li> Remover pernas e asas </li><li> A um tubo de 50 mL capilar que tenha sido aquecido, puxado e cortou em uma extremidade, adicionar 3-5 mL de óleo de imersão Cargille Tipo B ou 10% de sacarose, soro solução. </li><li> Inserir a tromba para dentro do tubo. Se usar óleo, gotículas de saliva será visto a exalam da tromba. Um mL de uma solução pilocarbine 1% em PBS e 0,1% Tween 80 pode ser aplicada ao tórax para estimular. </li><li> Depois de 60-90 minutos, remover e armazenar os mosquitos para isolamento do vírus, se necessário. </li><li> Remoção da solução do tubo por centrifugação em um tubo contendo 100 mL de 20% FBS-PBS. </li><li> Filtro estéril do inóculo através de um filtro de seringa 0,2 mm e, em seguida, usar o filtrado do inóculo para infectar as células em cultura. </li></ol> NOTA DE BIOSSEGURANÇA: Este protocolo descreveum método para gerar, identificação e monitoramento de mosquitos infectados. Com base em suas instalações (ou seja, uma tabela frio, instalação de confinamento, etc) e aprovação IBC, você pode ser limitada a examiná-los somente após a remoção de asas e pernas para evitar fugas. SINV baseado em ATS pode ser gerado e utilizado em um ambiente BSL2. O uso de ATS é baseado em outros, tais como alfavírus Chikungunya vírus ou vírus da encefalite eqüina ocidental exigirá BSL3 instalações. 7. Resultados representante Uma visão geral de expressão de um gene marcador (GFP) usando a 5&#39;dsMRE16 ATS / GFP é mostrado na Figura 1. Expressão da GFP em BHK-21 e C6/36 (Aedes albopictus) células é mostrado na Figura 2 em horários específicos após a infecção de células com 5&#39;dsMRE16 / GFP vírus de 0,01 multiplicidade de infecção. Figura 3 é uma visão geral de alfavírus e ATS infecção pelo vírus no mosquito quando o vírus é entregue através de uma refeição de sangue infecciosa. A Figura 4 mostra a preparação de uma refeição de sangue com ~ 10 7 PFU / mL de vírus ATS seguido por infecção oral de Aedes aegypti. Ver o corpo inteiro de mosquito infectado e partes do corpo selecionados em 10 dias após a infecção utilizando um microscópio de epifluorescência (Figura 5). Detecção de GFP e dsRED em intestino médio de mosquitos infectados após a infecção com o vírus ATS 5&#39;dsMRE16 expressando cada gene marcador fluorescente (Figura 6). Ensaio de transmissão usando mosquitos infectados com o vírus da ATS 5&#39;dsMRE16 / GFP (Figura 7). Tabela 1. ATS atualmente projetados para expressão de genes em mosquitos. <table border="1"><tbody><tr><td>&nbsp; Alphavirus </td><td> ATS </td><td> Mosquito </td><td> Referência </td></tr><tr><td> Sindbis Virus </td><td> TE / TE 3&#39;2J e / 5&#39;2J </td><td> Aedes aegypti </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Ochlerotatus triseriatus </td><td> 13 </td></tr><tr><td></td><td> 3&#39;dsMRE16 e 5&#39;dsMRE16 </td><td> A. aegypti </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Culex tritaeniorhynchus </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> 5&#39;dsTR339 </td><td> A. aeg ypti </td><td> 2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chikungunya vírus </td><td> 3&#39;dsCHIKV e 5&#39;dsCHIKV </td><td> A. aegypti / A. albopictus </td><td> 20 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> O&#39;nyong Nyong vírus </td><td> 5&#39;dsONNV </td><td> Anopheles gambiae </td><td> 1,9 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ocidental vírus da encefalite eqüina </td><td> 5&#39;dsWEEV. McMillan </td><td> Culex tarsalis </td><td> Stauft et al. Inéditos </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Vantagens / desvantagens de usar ATS para a expressão de genes em mosquitos. <table border="1"><tbody><tr><td> Vantagens: </td></tr><tr><td> Produção rápida de alta titulação do vírus </td></tr><tr><td> Ampla gama de hospedeiros (SINV) </td></tr><tr><td> Alta taxa de replicação do RNA </td></tr><tr><td> Níveis de expressão de alta transgene </td></tr><tr><td> Relativa facilidade de manipulação de genes </td></tr><tr><td> Estável, a expressão do gene persistente em insetos </td></tr><tr><td> Patologia mínima em insetos </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> Desvantagens: </td></tr><tr><td> Curto prazo, o modo de expressão em células de vertebrados </td></tr><tr><td> Fortes efeitos citopático em células de vertebrados </td></tr><tr><td> Gene restrições de tamanho (&lt;1Kb, de preferência) </td></tr><tr><td> Alguns requerem alfavírus BSL3 contenção </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Visão geral da ATS produção de vírus em células BHK-21 usando p5&#39;dsMRE / GFP GFP SINV expressar. Seguinte transcrição in vitro, genômica ATS RNA é electroporated em células BHK-21, onde o vírus é resgatado. O vírus da ATS pode então ser usada para infectar mosquitos. PEC = subgenomic promotor. Três espécies ATS RNA são transcritos no cells, a genômica, subgenomic 1 e 2 subgenomic RNAs. C (capsídeo), glicoproteínas E2 e E1 são montados com ATS genoma para gerar vírus infeccioso. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Expressão de GFP em mosquito (C6/36) células após a infecção com o vírus SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Visão Geral de uma infecção de vírus em mosquitos ATS levando à transmissão do vírus. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: ATS SINV 5&#39;dsMRE16 infecção, expondo os mosquitos para uma refeição de sangue infecciosa. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: ATS SINV infecção 5&#39;dsMRE16 / GFP em 10 dias após a infecção. Detecção de corpo inteiro de GFP mostra que o vírus escapou do intestino médio e divulgados aos tecidos secundários. Figura também mostra expressão GFP em partes selecionadas do corpo que também é indicativo de uma infecção disseminada. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6: ATS SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP e 5&#39;dsMRE16 / infecção do intestino médio dsRED em horários específicos pós-infecção. Intestinos, normalmente têm focos distintos de infecção logo após a ingestão de uma refeição de sangue contendo vírus que se espalha por todo o intestino médio posterior, às vezes mais tarde após a infecção. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7: Detecção de ATS 5&#39;dsMRE16 / GFP na saliva do mosquito, já em 8 dias após a infecção. Ensaio é projetado para mostrar a transmissão do vírus ATS e mostra que o vírus 5&#39;dsMRE16 / GFP pode expressar estavelmente GFP ao longo do período de incubação extrínseco no mosquito. O painel esquerdo mostra um mosquito salivando em um tubo capilar, o painel central mostra células C6/36 infectadas com saliva em um dia e no painel direito três dias após a infecção.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Os métodos aqui apresentados permitem que os pesquisadores seguem a infecção de um alfavírus em cultura de células de mosquito eo mosquito adulto fêmea. As vantagens e desvantagens do uso de vírus ATS estão resumidos na Tabela 2. Um clone ATS infecciosas podem ser manipulados geneticamente para expressar qualquer Governo da Índia e foram usadas para expressar anticorpos de cadeia única, supressores de RNAi, RNAs antisense alvo genes endógenos e proteínas pró-apoptóticas. Se um repórter não é usado, então a parte de imagem deste método não é relevante. No entanto, muitos dos mesmos protocolos são necessários para ATS resgate de vírus, propagação e infecção do mosquito. Existem limitações no tamanho máximo do transgene quando inseridos em um sistema de transdução de alfavírus. As restrições de tamanho variam de acordo com a cepa parental usado para gerar o ATS, mas são geralmente cerca de 1kb embora genes maiores repórter, como vaga-lume luciferase tem sido usada na construção de ATS para uso em mosquitos. Laboratórios de pesquisa com uma quantidade modesta de fundo virologia deve ser capaz de usar ATS na sequência destes protocolos. Um número de laboratórios de pesquisa já feito usando SINV baseado ATS.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>27104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MAXIscript Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AB1312</td>
<td>Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct.</td>
</tr>
<tr>
<td>Cap Analogue (m7G(5')ppp(5')G)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM8050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nanoject II nanoliter injector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific</td>
<td>3-000-204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electro Cell Manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>ECM 630</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

alphavirus transducing system:  tools for visualizing infection in mosquito vectors

Sistemas de transdução Alphavirus (ATS) são ferramentas importantes para expressar genes de interesse (GOI) durante a infecção. ATS são derivados de clones de cDNA do vírus transmitidas por mosquitos RNA (gênero Alphavirus, família Togaviridae). O gênero Alphavirus contém cerca de 30 diferentes espécies de mosquito-borne vírus. Alfavírus são vírus envelopados e contêm genomas single-stranded RNA (~ 11,7 Kb). Alfavírus transcrever um mRNA subgenomic que codifica as proteínas estruturais do vírus necessários para encapsidação do genoma e maturação do vírus. Alfavírus são geralmente muito lítica em células de vertebrados, mas persistentemente infectar as células de mosquitos suscetíveis, com citopatologia mínimo. Esses atributos tornam excelentes ferramentas para expressão de genes em mosquitos vetores. A ATS mais comum em uso são derivados de Sindbis vírus (SINV). O tropismo vasta espécie de SINV permite a infecção de cells8 insetos, aves e mamíferos. No entanto, ATS foram derivados de alfavírus também outros 9,10,20. Expressão de genes estranhos é possível pela inserção de um viral do site subgenomic adicionais iniciação RNA ou promotor. ATS em que uma seqüência do gene exógeno é posicionado 5 &#39;para os genes virais estruturais é usado para a expressão da proteína estável em insetos. ATS, em que uma sequência genética é posicionado 3 &#39;dos ​​genes estruturais, é usado para disparar RNAi e silêncio expressão desse gene no inseto. ATS provaram ser ferramentas valiosas para a compreensão do vetor-patógeno interações, os detalhes moleculares da replicação viral e ciclos de manutenção infecciosas 3,4,11,19,21. Em particular, a expressão de repórteres fluorescentes e bioluminescentes tem sido instrumental de monitoramento da infecção viral na transmissão vetorial e do vírus 5,14-16,18. Além disso, a resposta imune do vetor tem sido descrito utilizando duas linhagens de SINV projetadas para expressar GFP 2,9. Aqui, apresentamos um método para a produção de SINV contendo um repórter fluorescente (GFP) a partir do clone de cDNA infeccioso. Infecciosas, full-length RNA é transcrito a partir do clone linearizada cDNA. Infecciosas RNA é introduzido em células-alvo permissiva por eletroporação. Células transfectadas gerar partículas de vírus infecciosos expressar o Governo indiano. Vírus colhido é usado para infectar os mosquitos, como descrito aqui, ou outras espécies hospedeiras (não mostrado aqui). Competência vetorial é avaliada através da detecção de fluorescência fora do intestino ou por transmissão de monitoramento do vírus 7. Uso de um repórter fluorescente como o Governo indiano uma estimativa conveniente de disseminação do vírus através de uma cultura de células, para determinação da taxa de disseminação da infecção, em mosquitos expostos, a transmissão do vírus do mosquito e fornece uma medida rápida da competência vetorial.

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Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Métodos para usar os sistemas de alfavírus transdução de expressar repórteres fluorescentes in vitro e em mosquitos adultos são descritos. Esta técnica pode ser adaptada para expressar toda a proteína de interesse em vez de ou em adição a um repórter.

Sistema Alphavirus Transdução: ferramentas para visualização de infecção em mosquitos vetores

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

alphavirus-transducing-system-tools-for-visualizing-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.7K visualizações.  Colorado State University. Métodos para usar os sistemas de alfavírus transdução de expressar repórteres fluorescentes in vitro e em mosquitos adultos são descritos. Esta técnica pode ser adaptada para expressar toda a proteína de interesse em vez de ou em adição a um repórter.

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A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Um Protocolo de Coleta e coloração Hemócitos do mosquito da febre amarela Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Imunologia e Infecção

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Visualizando Vírus da Dengue por meio Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

Extração de proteínas e 2-D métodos Eletroforese em Gel de<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espécies

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Uma abordagem simples e eficiente para construir vectores de vírus mutante Vaccinia

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualizando os Efeitos de escarro no desenvolvimento de biofilmes usando um modelo Chambered lamela

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability to role and adhere to the endothelial layer. Visualization of circulating cells by injection of fluorescent dyes or fluorophore-coupled antibodies is commonly used. Alternatively, fluorescent reporter mice can be used. Interactions of leukocytes, in particular lysozyme M+ (LysM+) monocytes, with the vessel wall play pivotal roles in promoting vascular dysfunction and arterial hypertension. We here present the technique to visualize and quantify leukocyte rolling and adhesion in carotid arteries in angiotensin II (AngII)-induced hypertension in mice by IVM.
The implantation of a catheter damages the vascular wall and leads to altered blood cell responses. We compared different injection techniques and administration routes to visualize leukocytes in a LysMCre+IRG+ mouse with widespread expression of red fluorescent protein and conditional expression of green fluorescent protein in LysM+ cells. To study LysM+ cell activation, we used AngII infused mice in which rolling and adhesion of leukocytes to the endothelium is increased. We either injected acridine orange using a jugular catheter or directly though the tail vein and compared the amount of rolling and adhering cells. We found that jugular catheter implantation per se increased the number of rolling and adhering LysM+ cells in sham-infused LysMCre+IRG+ mice compared to controls. This activation was augmented in AngII-infused mice. Interestingly, injecting acridine orange directly through the tail vein did not increase LysM+ cell adhesion or rolling in sham-infused mice. We thereby demonstrated the importance of transgenic reporter mice expressing fluorescent proteins to not interfere with in vivo processes during experimentation. Furthermore, tail vein injection of fluorescent tracers might be a possible alternative to jugular catheter injections.

This manuscript describes the use of transgenic reporter mice and different administration routes of fluorescent dyes in angiotensin II-induced hypertension using intravital video microscopy of blood vessels to evaluate the activation of immune cells and their ability to roll and adhere to the endothelium.

Visualizando leucócitos rolamento e adesão em angiotensina II-infundido ratos: técnicas e armadilhas

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

Geração de vetores recombinantes Herpesvirus aviária com CRISPR/Cas9 Gene edição

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

Infecção recorrente do trato urinário de Escherichia coli desencadeada por gardnerella vaginalis exposição bexiga em camundongos

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...