Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 GM56244 a ANI, que inclui fundos concedidos através da Lei de Recuperação e Reinvestimento de 2009, e pelo NIH R01 GM87130 para JARP

1. Isolamento de embriões Nota: Todas as operações envolvendo ratos deve ser realizada de acordo com o cuidado de animais e políticas adequadas de uso e protocolos <ol><li> Verificar a presença de um plugue de acasalamento em camundongos fêmeas da manhã depois do acasalamento e as fêmeas separadas dos machos acasalaram parafuso, colocando-os em uma gaiola diferente. Meio-dia do dia que a ficha de acasalamento se observa é considerado o dia embrionárias 0,5 (E0.5) do desenvolvimento. </li><li> Em E8.5, (ou o estágio desejado, se for diferente), o sacrifício do mouse usando um protocolo aprovado. </li><li> Molhar a barriga do animal sacrificado com etanol 70% e abrir a cavidade abdominal. Os locais de implantação, indicando a presença de embriões em desenvolvimento são vistos como uma &quot;contas em um colar&quot; arranjo ao longo do comprimento de cada corno uterino (Figura 1A). Com uma tesoura, retire os dois cornos uterinos, corte cada local de implantação para separar individualmente (Figura 1B) e coloque-os em um prato de 100 milímetros de petri contendo temperatura ambiente (RT), médio dissecção (DMEM, 10% de soro fetal bovino, 20 mM HEPES pH 7,4 , 60 mg / ml de penicilina, estreptomicina 2 mM). </li><li> Utilizando uma pinça, remova cada embrião e as membranas que envolvem desde o tecido uterino (Figura 1C) e colocá-los em meio dissecção fresco. </li><li> Isolar embriões individuais sob um microscópio de dissecação com a pinça. Neste estágio de desenvolvimento, os embriões são rodeados por parietal saco vitelino, que em contato com o tecido deciduum, o saco vitelino visceral eo âmnio. O âmnio é uma membrana transparente que está em contato direto com o embrião. O saco vitelino visceral está localizado entre o âmnio eo saco vitelino parietal e é facilmente distinguido em E8.5-E9.5 embriões pela presença de vasos sanguíneos que nutrem importantes do embrião. Retire cada embrião de sua membranas que envolvem e transferência individualmente em um novo prato contendo media dissecção para remover o excesso de sangue. O estágio de desenvolvimento pode variar de embrião para embrião e entre ninhadas; representante E8.5 embriões e um representante do embrião E9.5 são mostrados na Figura 1D. </li><li> Transferência de cada embrião para um tubo eppendorf 1,5 ml contendo 200 mL de mídia dissecção (descrito na etapa 4 acima). </li></ol> 2. Homogeneização da Embryo isolados <ol><li> Adicionar 20 unidades de colagenase tipo II em um volume de 200 ul (diluído em fosfato 1X Dubbecco de Buffered Saline; DPBS) a cada tubo eppendorf. </li><li> Agite suavemente amostras em um shaker 37 ° C a 100 rpm por 20 min. </li><li> Ressuspender bem pipetando para perturbar aglomerados de células. </li><li> Aplicar a suspensão de células na parte superior do filtro de células estéreis (40 malhagem mm) colocado sobre um tubo eppendorf 1,5 ml. </li><li> Aplicar imediatamente 600 mL de temperatura ambiente 1X DPBS em cima do filtro de celular para completar a separação. Descartar o filtro. </li><li> Centrifugar as amostras a 4 ° C a 4000 xg por 5 min. </li><li> Desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 ml de DPBS RT 1X. </li><li> Centrifugar as amostras a 4000 xg por 1 min em temperatura ambiente. </li><li> Desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 200 mL de mídia dissecção RT. </li><li> Contar as células embrionárias. Há um embrião 3-5 x 10 6 cells/E8.5 média. </li></ol> 3. Cross-link Chromatin <ol><li> Adicionar 5,6 mL de formaldeído 37% para as 200 amostras mL para uma concentração final de formaldeído a 1%. </li><li> Incubar as amostras por 10 min em temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar as amostras a 4 ° C a 4000 xg por 3 min. </li><li> Desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células com frio 1X DPBS contendo 80 mL / cocktail inibidor da protease ml (PIC). </li><li> Centrifugar as amostras a 4 ° C a 4000 xg por 3 min. </li><li> Desprezar o sobrenadante. Nesta etapa, as amostras podem ser congeladas a -80 ° C. Os congelados, amostras reticuladas são estáveis ​​por vários meses. </li></ol> 4. Sonicação <ol><li> Ressuspender o pellet celular em 100 ul de tampão SDS RT lise (50 mM Tris-HCl (pH 8,1), EDTA 10 mM e SDS 1% com PIC recém adicionado ao volume de 1 ml PIC/800 mL total). Quando ressuspenso, adicionar um adicional de 100 ul de tampão de lise RT SDS para promover a ressuspensão. Misture bem por pipetagem e inversão. </li><li> Incubar a suspensão de células no gelo por 10 min. </li><li> Sonicate células lisadas de DNA de cisalhamento para entre 200 e 500 pares de bases usando um Bioruptor Diagenode ™ UCD200 (5 min x 8 vezes: definição de amplitude de 30 seg on/30 sec fora do poder (320 watts) de altura). As amostras devem ser cercado por uma pasta de gelo. Não permita que as amostras para aquecer acima de 4 ° C ou congelar. Existem muitos tipos de sonicators disponíveis. Sonicação condições devem ser otimizados para cada sonicador resultar em ruptura do DNA cruzada para um comprimento de aproximadamente 500 pb. </li><li> Centrifugar amostras sonicado a 4 ° C a 14000 xg por 10 min. </li><li> TRANSFERÊNCIA o sobrenadante para um tubo eppendorf frescos pré-resfriado em gelo. </li><li> Dividir a amostra sonicado em um máximo de cinco alíquotas. Temos empiricamente determinou que um embrião E8.5 pode ser dividido em cinco alíquotas. Tamanhos de amostra menores ou maiores podem ser dimensionados de acordo. Nesta etapa, a amostra pode ser armazenada a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Reserve uma alíquota para uso como entrada e armazenar a -20 ° C até a etapa 6, quando o cross-links serão revertidas. Diluir as alíquotas outras 10 vezes em tampão de diluição ChIP (16,7 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1,2 mM EDTA, 1,1% Triton X-100, 167 mM NaCl e SDS 0,01%), contendo PIC recém-added at 1 μl/800 mL de buffer. </li></ol> 5. Pré-compensação e imunoprecipitação <ol><li> Pré-claro sobrenadante diluído em 75 mL de esperma de salmão-DNA / proteína A ou G-Agarose suspensão de 50% a 4 ° C, com rotação, por 1 hora. Uso de qualquer proteína A ou G grânulos de proteína deve ser determinada pelo anticorpo a ser utilizado para o chip. Por exemplo, a proteína A contas são recomendados para anticorpos de coelho, enquanto esferas de proteína G são recomendados para anticorpos IgG de cabra ou um rato anticorpos. Para informações mais detalhadas, veja as recomendações feitas pelo fabricante do grânulo. </li><li> Centrífuga a 4 ° C a 2500 xg por 1 min. </li><li> Transferir o sobrenadante para um novo tubo eppendorf pré-resfriada. </li><li> Adicionar anticorpo (4 mg / amostra) à alíquota de pré-limpo e incubar overnight a 4 ° C com rotação. </li></ol> 6. Lavar o Complexo de proteína-cromatina-bead <ol><li> Adicionar 60 mL de esperma de salmão DNA / proteína A ou G agarose suspensão em cada frasco e incubar a 4 ° C com rotação de 1 hr. Use o mesmo tipo talão utilizado para pré-limpeza no passo 3 acima. </li><li> Centrífuga a 4 ° C a 1000 xg por 1 min. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante e descartar. Manter o complexo DNA-proteína-grânulo no gelo. </li><li> Ressuspender e lavar o pellet, conforme indicado abaixo com buffers de lavagem 1, 2, 3 e 4. Lavar buffers 03/01 devem ser refrigerados a 4 ° C e lavagens com esses buffers deve ser realizada a 4 ° C. Tampão de lavagem 4 deve estar em temperatura ambiente e lavagens com esse buffer deve ser realizada à temperatura ambiente. Cada lavagem é de 5 minutos com rotação à temperatura adequada. Após cada lavagem centrífuga, a 4 ° C (temperatura ambiente por 4 lavagens tampão de lavagem) a 1000 xg por 1 min, em seguida, aspirar cuidadosamente ou remover o sobrenadante. </li></ol> Tampão 1: tampão de lavagem Low sal (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl e SDS 0,1%), 1 ml x 2 lavagens. Buffer de 2: tampão de lavagem de alta sal (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 500 mM NaCl e SDS 0,1%), 1 ml x 2 lavagens. Tampão 3: LiCl tampão de lavagem de sal (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA, 1% IGEPAL-CA630, 0,25 M LiCl e ácido deoxicólico 1% (sal sódico)), 1 x 1 ml de lavagem. Tampão 4: tampão TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA), 1 ml x 2 lavagens. 7. Eluição do Complexo Chromatin-anticorpo <ol><li> Ressuspender o complexa proteína-cromatina-bead lavados em 250 L de tampão de eluição recém-preparada (1% SDS, 0,1 M NaHCO 3). Vortex vigorosamente a amostra por 5 segundos e, em seguida incubar a RT por 15 min com rotação. </li><li> Centrifugar a 2.500 xg por 1 min em temperatura ambiente e transferir o eluato em um tubo eppendorf novo. </li><li> Repita as etapas 1 e 2 e combinar os eluatos no tubo eppendorf mesmo. Os eluatos deve ser mantido em temperatura ambiente. Após a conclusão desta etapa, os eluatos podem ser armazenadas a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol> 8. Reverso Cross-link e recuperar DNA <ol><li> Adicionar 20 l 5 M NaCl por 500 mL eluato (40 mL / ml para o controle de entrada). </li><li> Aqueça o eluatos a 65 ° C em banho-maria por 4 horas durante a noite. </li><li> 10 ml de cada amostra (incluindo o controle de entrada) podem ser executados em um gel de agarose 2% ao lado de marcadores de tamanho medindo 0,1-1 kbp para verificar o tamanho do fragmento de DNA. O DNA vai aparecer como uma mancha, e não uma banda afiada. O restante das amostras podem ser deixados a 65 ° C, enquanto o gel está sendo executado. </li><li> Recuperar o DNA de cada amostra usando um QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Adicionar 600 mL tampão QG (fornecido no kit) para otimizar o DNA de adsorção com a membrana de sílica em uma coluna QIAquick e 200 mL de isopropanol em uma amostra mL 500. Note-se que tampão QG contém um indicador de pH permitindo a determinação fácil do pH da amostra. Se a cor da amostra passa de amarelo para roxo (pH&gt; 7,5) após a mistura, adicione 10 ml de 3 NaAcetate M (pH 5,2) para a amostra e misturar. Isso reduz o pH da mistura para maximizar o DNA de ligação para as contas na coluna. </li><li> Antes de carregar a coluna, verifique a mistura para determinar se qualquer precipitado SDS está presente. Se SDS precipitação ocorreu, a amostra deve ser aquecida em um42 ° C banho-maria até que o precipitado desaparece. </li><li> Carga 700 mL da mistura na coluna QIAquick (coluna roxo no kit) e centrifugar a 14.000 xg na RT para 1 min. Descartar o fluxo através da coluna antes de continuar e repetir este passo com o restante da amostra. </li><li> Adicionar 500 mL tampão QG para lavar a coluna. Centrifugar a 14.000 xg na RT por 2 min. Descartar o fluxo através da coluna antes de prosseguir. </li><li> Lavar a coluna com 700 mL de tampão de lavagem PE (fornecido no kit) para que o etanol foi adicionado conforme as instruções do fabricante. Centrifugar a 14.000 xg na RT para 1 min. Descartar o fluxo através da coluna antes de prosseguir. </li><li> Repita a etapa de centrifugação para remover completamente o restante do tampão PE na coluna. Descartar o fluxo através do tubo e coleção. </li><li> Eluir o DNA da coluna em um tubo eppendorf fresco, adicionando 60 mL tampão EB (tampão de eluição fornecido no kit). </li><li> Centrifugar a temperatura ambiente em 14.000 xg por 1 min. O DNA eluído podem ser armazenadas a -20 ° C até a detecção. A 260 leituras do material recuperado normalmente indicam concentrações de 90-120 ng / ul, para uma recuperação total de ~ 6-7 ug por alíquota. No entanto, a proporção de 260/280 Um desses exemplos é tipicamente&gt; 1,8, sugerindo que a RNA está presente na amostra. Assim, a quantidade exata de DNA recuperado pode ser menor. </li></ol> 9. Análise de DNA recuperado <ol><li> SDS pode interferir com a actividade da PCR Taq polimerase. SDS deve ser completamente removido antes de realizar PCR. Incubar a DNA em gelo para precipitar qualquer SDS residual e centrifugar a 4 ° C em 14.000 xg por 1 min. Transfira o sobrenadante para um novo passo tube.This eppendorf é fortemente recomendado. </li><li> Os eluatos DNA podem ser detectadas quer por PCR convencional ou pela quantitativa PCR em tempo real (Q-PCR) com primers específicos para cada seqüência a ser analisado. ML de eluato 50-10 DNA total pode ser utilizado para um PCR ou Q-PCR reação. PCR com o controle de entrada pode ser realizada com uma diluição de 50-10 vezes do DNA em comparação com a quantidade de outras amostras. PCR e Q-PCR condições podem variar, no entanto, a quantidade limitada de matéria-prima exige ciclos adicionais PCR. Para a detecção de PCR convencional, recomendamos que comece com 40 ciclos e ajustar conforme necessário. </li></ol> 10. Resultados representante Nós temos usado esse protocolo para realizar ChIP de ambos E8.5 E9.5 e embriões (Figura 2). Os resultados demonstram que miogenina está presente no promotor miogenina em E8.5 e E9.5 embriões. DNAs ChIP purificados foram analisados ​​por PCR convencional (Figura 2A) e pelo quantitativo real-time PCR (Figura 2B). Em contraste, não houve indicação de miogenina ligação ao promotor miogenina no saco vitelino, onde miogenina não é expresso. O interferon-γ (IFNγ) promotor, que contém seqüências correspondentes do site miogenina vinculativo, foi usado como um controle de seqüência negativa. Como esperado, miogenina não estava preso ao promotor IFNγ em qualquer uma das amostras de tecido testado. Em E8.5 e 9,5 embriões, miogenina é especificamente expresso na somitos (Figura 3; 6,10), que são as precursoras de músculo esquelético. Assim, os resultados indicam que a miogenina é vinculado ao promotor miogenina na somitos E8.5 e E9.5. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. E8.5 dissecção embrião. (A) chifre Isolated uterina (painel superior; maior ampliação mostrado no painel inferior). (B) uterina chifre cortado com tesoura para separar locais de implantação individuais contendo embriões individuais. (C) Embriões projetando-se de tecido uterino durante a dissecção. Setas marcam os embriões ainda cobertos por extra-embrionária do tecido. (D) Dois E8.5 embriões de mesma ninhada. O embrião do lado esquerdo não começou o processo de transformação. O embrião do lado direito está passando por torneamento. Extrema-direita - embrião E9.5 representante. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. ChIP ensaio demonstrando miogenina ligação ao promotor miogenina em E8.5 e E9.5 embriões. (Top) análise de PCR convencional de 5 ul de DNA purificada a partir de experimentos chip usando um anticorpo miogenina ou não-específicas IgG foi realizada com primers que amplificam uma porção do promotor miogenina de -79 a 69 em relação ao local de início da transcrição que contém um sítio de ligação localizado no miogenina -12 ou primers que amplificam uma porção do promotor IFNγ que contém uma seqüência de combinação do site miogenina ligação localizada ~ 1075 pb a montante do local de início da transcrição. As seqüências de primers utilizadas foram IFNγ 5&#39;-GCT GAC TCA GGC AGA CCC CGA-3 &#39;e 5&#39;-GGA TGG TGA GGC AGG AGG CC-3&#39;. (Inferior) quantitativa em tempo real a análise PCR das mesmas amostras usadas em (A). Oos dados são plotados como% de entrada + / - desvio padrão. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Miogenina é especificamente expresso na somitos de E8.5 E9.5 e embriões. Montar toda a hibridização in situ de miogenina mostra a expressão do mRNA específico no somitos. Bar tamanho em E8.5 imagem - 200 mM. Bar tamanho em E9.5 imagem - 500 mm.

<ol>
	<li>Minard, M. E., Jain, A. K., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+epigenetic+alterations+to+chromatin+during+development.">Analysis of epigenetic alterations to chromatin during development.</a> Genesis. 47, 559-572 (2009).</li><li>Kuo, M. H., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cross-linking+and+immunoprecipitation+for+studying+dynamic+Protein:DNA+associations+in+a+chromatin+environment.">In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment.</a> Methods. 19, 425-433 (1999).</li><li>Johnson, K. D., Bresnick, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+long-range+transcriptional+mechanisms+by+chromatin+immunoprecipitation.">Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26, 27-36 (2002).</li><li>Yusuf, F., Brand-Saberi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eventful+somite:+patterning,+fate+determination+and+cell+division+in+the+somite.">The eventful somite: patterning, fate determination and cell division in the somite.</a> Anat Embryol (Berl). 211, 21-30 (2006).</li><li>Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S., Montarras, D., Rocancourt, D., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+skeletal+muscle:+from+somite+to+limb.">The formation of skeletal muscle: from somite to limb.</a> J Anat. 202, 59-68 (2003).</li><li>Wright, W. E., Sassoon, D. A., Lin, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin,+a+factor+regulating+myogenesis,+has+a+domain+homologous+to+MyoD.">Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MyoD.</a> Cell. 56, 607-617 (1989).</li><li>Edmondson, D. G., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+with+homology+to+the+myc+similarity+region+of+MyoD1+is+expressed+during+myogenesis+and+is+sufficient+to+activate+the+muscle+differentiation+program.">A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program.</a> Genes Dev. 3, 628-640 (1989).</li><li>Nabeshima, Y., Hanaoka, K., Hayasaka, M., Esumi, E., Li, S., Nonaka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+gene+disruption+results+in+perinatal+lethality+because+of+severe+muscle+defect.">Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect.</a> Nature. 364, 532-535 (1993).</li><li>Hasty, P., Bradley, A., Morris, J. H., Edmondson, D. G., Venuti, J. M., Olson, E. N., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+deficiency+and+neonatal+death+in+mice+with+a+targeted+mutation+in+the+myogenin+gene.">Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene.</a> Nature. 364, 501-506 (1993).</li><li>Sassoon, D., Lyons, G., Wright, W. E., Lin, V., Lassar, A., Weintraub, H., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+two+myogenic+regulatory+factors+myogenin+and+MyoD1+during+mouse+embryogenesis.">Expression of two myogenic regulatory factors myogenin and MyoD1 during mouse embryogenesis.</a> Nature. 341, 303-307 (1989).</li><li>Brennan, T. J., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+resides+in+the+nucleus+and+acquires+high+affinity+for+a+conserved+enhancer+element+on+heterodimerization.">Myogenin resides in the nucleus and acquires high affinity for a conserved enhancer element on heterodimerization.</a> Genes Dev. 4, 582-595 (1990).</li><li>Rosenthal, N., Berglund, E. B., Wentworth, B. M., Donoghue, M., Winter, B., Bober, E., Braun, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+enhancer+downstream+of+the+human+MLC1/3+locus+is+a+target+for+multiple+myogenic+determination+factors.">A highly conserved enhancer downstream of the human MLC1/3 locus is a target for multiple myogenic determination factors.</a> Nucleic Acids Res. 18, 6239-6246 (1990).</li><li>Braun, T., Gearing, K., Wright, W. E., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-expressed+myogenic+determination+factors+require+E12+complex+formation+for+binding+to+the+myosin-light-chain+enhancer.">Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer.</a> Eur J Biochem. 198, 187-193 (1991).</li><li>Chakraborty, T., Brennan, T., Olson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+trans-activation+of+a+muscle-specific+enhancer+by+myogenic+helix-loop-helix+proteins+is+separable+from+DNA+binding.">Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding.</a> J Biol Chem. 266, 2878-2882 (1991).</li><li>French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimers+of+myogenic+helix-loop-helix+regulatory+factors+and+E12+bind+a+complex+element+governing+myogenic+induction+of+the+avian+cardiac+alpha-actin+promoter.">Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter.</a> Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).</li><li>Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+the+myogenin+basic+region+identifies+an+ancient+protein+motif+critical+for+activation+of+myogenesis.">Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).</li><li>Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+activity+of+myogenic+HLH+proteins+requires+hetero-oligomerization+with+E12/E47-like+proteins+in+vivo.">Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo.</a> Cell. 66, 305-315 (1991).</li><li>Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+homooligomerization+contributes+to+the+dependence+of+myogenin+on+E2A+products+for+efficient+DNA+binding.">Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding.</a> Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).</li><li>Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+induces+the+myocyte-specific+enhancer+binding+factor+MEF-2+independently+of+other+muscle-specific+gene+products.">Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products.</a> Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).</li><li>Braun, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four+human+muscle+regulatory+helix-loop-helix+proteins+Myf3-Myf6+exhibit+similar+hetero-dimerization+and+DNA+binding+properties.">The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).</li><li>Serna, d. e. l. a., L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+targets+chromatin+remodeling+complexes+to+the+myogenin+locus+prior+to+forming+a+stable+DNA-bound+complex.">MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex.</a> Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).</li><li>Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+initial+blueprint+for+myogenic+differentiation.">An initial blueprint for myogenic differentiation.</a> Genes Dev. 19, 553-569 (2005).</li><li>Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+gene-specific+analyses+show+distinct+roles+for+Myod+and+Myog+at+a+common+set+of+promoters.">Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters.</a> EMBO J. 25, 502-511 (2006).</li><li>Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+and+the+SWI/SNF+ATPase+Brg1+maintain+myogenic+gene+expression+at+different+stages+of+skeletal+myogenesis.">Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis.</a> J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).</li><li>Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+gene+selectivity+of+the+myogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+myogenin+in+embryonic+muscle.">Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle.</a> Dev Biol. 311, 650-664 (2007).</li><li>Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor-alpha+directs+ordered,+cyclical,+and+combinatorial+recruitment+of+cofactors+on+a+natural+target+promoter.">Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter.</a> Cell. 115, 751-763 (2003).</li><li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li></ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade de Massachusetts Medical School IACUC.

No protocolo ChIP descrito, mostramos que a miogenina regulador miogênico está associada com o promotor miogenina no tecido músculo esquelético precursor presente em E8.5 E9.5 única e embriões. Estudos anteriores extensamente caracterizada miogenina ligação a caixa de E contendo seqüências, começando com a inicial em experimentos in vitro, utilizando gel shift in vitro traduzido ou bactérias produzidas DNA miogenina e radiolabeled codificação a parte relevante de seqüências-alv...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ChIP Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore</td>
<td>17-295</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase Type II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17101015</td>
<td>Dilution by 1 x PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s modified eagle medium (DMEM) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>12100-061</td>
<td>High glucose content</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s phosphate buffered saline 1X (DPBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>Calcium chloride free, Magnesium chloride free</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Inc.</td>
<td>35-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel extraction kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QIAquick</td>
<td>28704</td>
<td>50 reaction kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/streptomycin stock solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5000 &mu;g/ml concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P8340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Salmon sperm DNA /Protein A agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>16-157</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>myogenin antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
<td>sc-576</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal rabbit IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>12-370</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Platinum PCR Supermix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11306-016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GoTaq Q-PCR master mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>A6001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chromatin immunoprecipitation assay for tissue-specific genes using early-stage mouse embryos

Cromatina imunoprecipitação (chip) é uma ferramenta poderosa para identificar proteínas: interações cromatina que ocorrem no contexto de células vivas 1-3. Esta técnica tem sido amplamente explorada em células de cultura de tecidos, e, em menor grau, no tecido primário. A aplicação do chip para o tecido embrionário de roedores, sobretudo em momentos iniciais de desenvolvimento, é complicado pela quantidade limitada de tecido e da heterogeneidade das células e tecidos no embrião. Aqui apresentamos um método para realizar chip usando um dia dissociada embrionárias 8.5 (E8.5) do embrião. Cromatina tosquiada de um embrião E8.5 única pode ser dividido em até cinco alíquotas, que permite que o investigador material suficiente para controles e para a investigação de proteínas específicas: interações cromatina. Temos utilizado esta técnica para começar a documentar proteína: interações cromatina durante a especificação de tecido programas específicos de expressão gênica. A heterogeneidade de tipos de células em um embrião, necessariamente, restringe a aplicação desta técnica porque o resultado é a detecção de proteínas: interações cromatina sem distinguir se as interações ocorrem em todos, um subconjunto de, ou um único tipo de células (s). No entanto, o exame de tecido específico genes durante ou após o aparecimento de tecido-específicos de expressão gênica é viável por dois motivos. Primeiro, imunoprecipitação de fatores tecido específico necessariamente isola cromatina do tipo de célula onde o fator é expresso. Segundo, imunoprecipitação de coativadores e histonas contendo modificações pós-translacionais que estão associados com a ativação do gene só deve ser encontrada em genes e seqüências regulatórias no tipo de células onde o gene está sendo ou foi ativado. A técnica deve ser aplicado ao estudo da maioria dos tecidos específicos eventos de ativação do gene. No exemplo descrito abaixo, utilizamos E8.5 e E9.5 embriões de camundongos para analisar fator determinante em um esqueleto promotor do gene do músculo específico. Somitos, que são os tecidos precursor a partir do qual os músculos esqueléticos do tronco e membros formarão, estão presentes em E8.5-9.5 4,5. Miogenina é um fator de regulação necessários para a diferenciação do músculo esquelético 6-9. Os dados demonstram que miogenina está associado ao seu próprio promotor em E8.5 e E9.5 embriões. Porque miogenina é expresso apenas em somitos nesta fase de desenvolvimento 6,10, os dados indicam que as interações com miogenina seu promotor própria já ocorreu em células do músculo esquelético precursor em E8.5 embriões.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Nós demonstramos uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) para identificar as interações fator em tecido-específicos genes durante ou após o início da tecido-específicos de expressão gênica em camundongos tecido embrionário. Este protocolo deve ser amplamente aplicáveis ​​para o estudo do tecido-específicos ativação do gene como ocorre durante o desenvolvimento embrionário normal.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina Genes Tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-tissue-specific-genes-using

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K visualizações.  University of Massachusetts Medical School. Nós demonstramos uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) para identificar as interações fator em tecido-específicos genes durante ou após o início da tecido-específicos de expressão gênica em camundongos tecido embrionário. Este protocolo deve ser amplamente aplicáveis ​​para o estudo do tecido-específicos ativação do gene como ocorre durante o desenvolvimento embrionário normal.

Vídeo: Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

Fator de Crescimento colocando-Revestido Beads em embriões de galinha Early Stage

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Biologia

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

Um Ensaio Chromatin para tecido do cérebro humano

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Cromatina imunoprecipitação (chips) para a Modificação do ensaio dinâmico Histone na expressão dos genes ativados em células humanas

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: Detecção de alterações numéricas e estruturais em todos os 24 cromossomos humanos ao mesmo tempo usando um ensaio de FISH Novel OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Cromatina imunoprecipitação (CHIP), utilizando Drosophila Tecido

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Imunoprecipitação da Cromatina eficiente usando Limitando quantidades de biomassa

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Isolamento eficiente e rápida de embriões em início de carreira a partir de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sementes

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...