1. Corrida em esteira para revelar a extensão da lesão muscular em ratos <ol><li> Estabelecer o ângulo da superfície esteira para uso durante o protocolo de execução. Geralmente, uma plana ou um ângulo entre 7 ° e 15 ° graus para baixo ou para cima é usado. Algumas esteiras têm em aparelho essencial para ajustar a inclinação, enquanto outros exigem a esteira para ser elevado através de outros meios. </li><li> Coloque uma bandeja ou uma almofada de laboratório azul debaixo da esteira antes de colocar os animais na esteira para coletar os resíduos dos animais durante o protocolo de execução. </li><li> Antes de ratos em execução devem ser aclimatados ao ambiente da esteira. Este envolve a colocação dos animais na esteira por 15 minutos com a rede elétrica fora eo motor de acionamento por correia em mas o cinto não em movimento (ou seja, com a velocidade fixada em 0 m / s). </li><li> Ligue a rede elétrica motivacional. A intensidade ea freqüência dos pulsos utilizados geralmente podem ser controlados em esteiras, mas varia de um fabricante para outro. Geralmente, a intensidade máxima não é necessária para motivar os ratos para correr enquanto uma alta freqüência (pelo menos uma vez a cada dois segundos) vai melhorar a adesão. </li><li> Ativar o cinto de esteira para iniciar o protocolo de execução. Uma velocidade inicial de aproximadamente 5 metros / min deve ser usado para um período de aquecimento para os ratos. A velocidade da esteira pode ser acelerado lentamente, normalmente adicionando 1-2 metros / min para cada minuto após o início da esteira. </li><li> Cumprimento dos animais na maioria dos protocolos pode ser melhorada através da realização de uma série de corridas curtas (5 minutos) a uma velocidade de aquecimento de 3 a 10 dias antes da execução experimental começa. </li><li> Um exercício de exaustão aguda geralmente envolvem o aumento da velocidade da esteira com o tempo até uma velocidade máxima (geralmente &lt;30 m / m) é alcançado e mantido até que os ratos mostram sinais de esgotamento. Critérios para julgar a exaustão variar, mas geralmente incluem um rato passar mais de metade do tempo na rede elétrica ou 5 segundos consecutivos na rede elétrica sem retornar para a superfície da esteira. Depois de um mouse individuais está esgotado, pode ser retirado da esteira eo tempo total de execução pode ser gravado. </li><li> Mudando o ângulo da esteira pode ser usada em ensaios aguda a correr para aumentar a carga de exercício (com um ângulo para cima) ou para induzir danos contrações excêntricas (com um ângulo de descida) que rasgam as membranas sarcolemmal de fibras musculares 1. Evans corante azul pode ser injetado em animais antes de tais procedimentos para uso como corante histológico para identificar fibras musculares danificadas 2,3. </li><li> Treinamento de resistência execução protocolos proporcionam uma carga de exercício para o animal durante um período de tempo prolongado (até meses) a fim de produzir o remodelamento do músculo ou o sistema cardiovascular. Warm up procedimento é o mesmo que acima (passo 1.5) no entanto a velocidade máxima é geralmente mais baixos e os tempos de execução pode ser muito longo (&gt; 1 hora). </li><li> Após a conclusão da execução dos camundongos podem ser devolvidos aos seus gaiolas. Esteiras geralmente tornam-se muito sujo, enquanto os ratos estão sendo executados, principalmente por meio de protocolos de comprimento. É necessário limpar a esteira, geralmente com um spray de etanol 70%, após cada uso. </li></ol> 2. Ex Assay Vivo da Capacidade de Membrana de reparo de fibras musculares isoladas após UV laser-Damage <ol><li> Dissecar a camada superficial do músculo flexor brevis (FDB) do pé mouse. Primeiro, corte a pele da sola aberta na linha mediana, enquanto tomando cuidado para não danificar o músculo por baixo, em seguida, faça cortes horizontais e remover a pele. O tendão do apartamento branco de FDB músculo (tendão proximal) pode ser visto ligado ao osso calcâneo. Sem rodeios separar o tendão por fórceps e separarão os próximos tendão ao local de fixação, agarre o tendão livre por fórceps e puxe-o suavemente para separar os FDB dos tecidos adjacentes ao cortar qualquer tecido conjuntivo que permanecem conectados. Ao ver o ramo tendões distais à dígitos individuais do FDB pode ser removido por corte onde estes tendões se conectar à camada mais profunda do músculo. </li><li> Coloque o feixe muscular FDB em 1 ml de solução de colagenase pré-aquecido a 37 ° C em um tubo Eppendorf 1,5 ml, tape o tubo em uma orientação horizontal em um 37 ° C e agitar agitador orbital a 200 rpm por 65 min. Tempos de incubação pode ter de ser ajustada para assegurar uma digestão suficiente, o que é indicado por uma aparência desgastada e cor pálida do músculo. </li><li> Transferir cuidadosamente o pacote FDB digerido em um tubo de centrífuga de 1,5 l contendo 600 mL ~ de 2,5 Tyrode + Ca 2 através de um uma ponta da pipeta ml com uma extremidade de corte que tem um diâmetro suficiente para permitir que o feixe digerida facilmente passar sem interrupções. Suavemente virar o tubo para agitar as fibras soltas do pacote. </li><li> Cortar uma ponta de pipeta 30 mL de modo que o diameter é apenas ligeiramente menor do que o feixe muscular (entre 15-20 m de diâmetro) Use a pipeta suavemente para desenhar o pacote para a pipeta e depois empurrá-lo de volta para a solução.. Repita esse processo até que a maioria das fibras são dissociados do pacote. </li><li> Mix de fibras disassociated bem suavemente girando o tubo, tomar quantidade desejada e solte um prato fundo de vidro T delta. O volume de carga vai variar de acordo com a eficiência do isolamento e do número de fibras úteis que são necessárias em um prato para um protocolo particular. As fibras remanescentes podem ser armazenados no tubo a 4 ° C por aproximadamente seis horas para estudos adicionais. </li><li> Permitir que o prato se sentar sem ser perturbado por 5 minutos. Isto permite que as fibras de aderir ao fundo de vidro do prato. </li><li> Coloque o prato de vidro em um fundo de microscopia confocal equipado com um laser UV. Observe as fibras em microscopia de fase em&gt; aumento de 100X para verificar a presença de um padrão de estriação normal e uma haste, em linha reta como a forma. </li><li> Adicionar FM1-43 ou corantes FM4-64 styrylpyridinium 4 a solução para uma concentração final de 2,5 mM 5. </li><li> Para induzir a danos para a posição de fibra-lo na janela de imagem para que a fibra é orientada em um ângulo de 45 ° a partir do canto superior esquerdo do campo de visão para o canto inferior direito (Figura 1). Irradiar uma área de 5x5 pixel (aproximadamente 0.9μmx0.9μm) da membrana plasmática usando um laser UV (80 mW ou mais, 351/364 nm) para definir potência máxima por 5 segundos. A região irradiada deve dividir a membrana plasmática, ou seja, metade da caixa de 5x5 deve ser no interior da fibra, enquanto o restante deve ser fora da fibra (Figura 1). </li><li> Capturar imagens de entrada corante na fibra em intervalos de 5 segundos cada por até 5 minutos. </li><li> Repita o passo 2.8 para não mais de 3 fibras por prato, como o corante fluorescente será eventualmente endocytosed na fibra e complicar qualquer análise de dados. Depois de 3 fibras um novo prato deve ser preparado a partir do passo 2.5. </li><li> Analisar os dados, calculando a mudança na intensidade de fluorescência (ΔF / F 0) entre cada quadro capturado para medir a quantidade de entrada corante. Isto requer a medição da fluorescência média de uma área de aproximadamente 200 mM 2, utilizando o software de análise, como o ImageJ publicamente disponíveis (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Para a comparação entre as fibras, o seguinte cálculo deve ser feito para cada quadro: ΔF / F 0, onde F 0 é a fluorescência média da região de interesse no primeiro quadro capturado (t = 0; antes da lesão), e ΔF é a mudança de fluorescência de cada quadro subseqüente (FF 0). </li></ol> 3. Ao vivo imagens de células Confocal para monitorar o processo dinâmico de Reparação Membrana Celular <ol><li> Micropipetas foram feitas a partir PYREX capilares. O capilar foi colocado em um extrator micropipeta e puxado por pré-definidos do programa (calor = 695; Pull = 50; Vel .= 55; Time = 250). </li><li> Micropipeta foi anexado a um micromanipulador de 3 eixos (xyz). </li><li> Células são transfectadas com DNA plasmidial usando métodos normais em um prato fundo de vidro delta T. Meios de comunicação devem ser transferidos para 2,5 Ca 2 + tampão Tyrode antes dos experimentos começar. </li><li> Pratos de vidro contendo células transfectadas foram colocados em um microscópio confocal de varredura a laser com o objectivo de imersão 1.3NA óleo de 40X. </li><li> O dano live-celular aguda foi realizada através da inserção da micropipeta na membrana celular e então rapidamente retirar a micropipeta para fora da célula 3,6. Consecutivos imagens de células vivas foram obtidas em um intervalo de 1,54 s / frame. </li><li> Para o ensaio interrupção induzida membrana saponina, saponina 0,005% (Sigma) em 2,5 mm Ca 2 + tampão Tyrode foi perfundidos por um sistema de perfusão de fluxo por gravidade custom-montados 7. A taxa de perfusão é de aproximadamente 1 ml / min ea ponta de perfusão deve ser colocado diretamente acima da célula que está sendo fotografada. </li></ol> 4. Resultados representativos: Um filme representante da esteira rolante do mouse pode ser feita durante as filmagens. O filme vai ilustrar a capacidade reduzida de funcionamento do mg53 / - ratos, devido aos danos ao músculo esquelético. A extensão dos danos causados ​​pelo protocolo de danos UV laser detalhado acima depende da capacidade de reparação da membrana da fibra analisada. Esta capacidade é afetada pelo genótipo do mouse a partir do qual a fibra foi isolado, condições extracelular, e quaisquer alterações a expressão da proteína (transfecção ou infecção). A fibra tipo normal selvagens permitirá leve a moderada entrada corante (Figura 2a). Fibra muscular derivado do mg53 / - ratos com capacidade comprometida membrana reparação irá exibir a entrada mais significativa de corante na fibra (Figura 2b). Os resultados típicos de translocação de microeletrodos mostram lesão de MG53 contendo vesiculos para o local da lesão. Figura 3a e 3b mostram GFP-MG53 C2C12 transfectadas miotubos danificado pela inserção da micropipeta na membrana celular. Na célula antes que os danos micropipeta, GFP-MG53 é localizado em ambos os membrana plasmática e citoplasma 3. Após a penetração micropipeta, GFP-MG53 vesículas contendo mudou para sites de dano (como indicado pela seta). Figura 3c mostra um GFP-MG53 C2C12 transfectadas mioblastos tratados com 0,005% de saponina, um detergente que podem permeabilizar a membrana plasmática. Após tratamento saponina, GFP-MG53 translocado do citosol para a membrana celular. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Weisleder, et al. Figura 1. Alinhamento das fibras e definição região lesão. Orientação adequada da fibra muscular isolada dentro do campo de visão e definição da região ferimentos mostrados. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Weisleder, et al. Figura 2. Danos a laser UV de fibras FDB. Imagens mostram fibras antes da lesão (0 sec, à esquerda) e em 200 lesões pós sec (direita). Fibras de um camundongo de tipo selvagem (a) mostram ferimentos leves. Fibras de ratos com a reparação da membrana comprometida (b) permitir que mais tinta para entrar. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Weisleder, et al. Figura 3. Microeletrodos e saponina danos às células em cultura. Imagens mostram miotubos C2C12 (a, b) e um mioblastos C2C12 (c) antes da lesão (acima) e lesão pós (em baixo). Células ferido com um microeletrodo (a, b) mostram MG53 translocação para sites lesão (setas). Células tratadas com saponina (c) mostram MG53 translocação para a membrana celular.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Esteira rolante é uma metodologia útil no fornecimento de uma carga de exercícios para os animais tratados. Como uma metodologia para medir a função muscular ou da capacidade de resistência é uma abordagem notoriamente barulhentos que é difícil de executar de uma forma consistentemente reprodutíveis 8. Em geral, os tempos até a exaustão pode ser usado como um ponto final para resolver diferenças importantes entre os grupos experimentais, tais como aquelas entre algumas linhas e camundongos knockout rato do tipo selvagem 9. Manipulações experimentais que produzem diferença mais sutil, como alguns ensaios farmacêuticos, não pode resolver as diferenças acima do ruído associado a essa técnica. A fim de maximizar a reprodutibilidade ea sensibilidade destas técnicas é importante para manter as condições para uma sessão para outra de muito perto. A hora do dia os animais são exercidas, bem como as condições de aquecimento período utilizado, são fatores importantes e devem permanecer consistentes de julgamento para julgamento. Efeitos estirpe pode ter impacto significativo sobre o projeto de protocolos de esteira como certas cepas de camundongos pode funcionar por muito mais tempo na esteira do que outras linhagens e respondem diferentemente ao exercício de resistência 10. Como orientação geral, muitos ratos será capaz de executar 200-300 metros no total, em um estudo de exaustão com constante aumento na velocidade da esteira (5 velocidade m / m inicial com 1 m / m adicionado por cada minuto após o início). Para um exercício de resistência dos ratos pode ser executado entre 9 a 12 m / m por 30 minutos 2 ou 3 vezes por semana. No entanto, estudos individuais geralmente requerem alguma otimização do protocolo para corresponder às necessidades individuais experimental. O procedimento de danos UV laser tem demonstrado ser um método eficaz para medir a capacidade de reparação da membrana das fibras musculares esqueléticas 3,6,11. Um componente vital para o sucesso desses experimentos é a utilização de fibras musculares que exibem apenas uma linha reta, a aparência da haste em forma com um padrão regular de estrias e um sarcolema lisa que não aparece enrugada. Se outras fibras musculares são selecionados dano à membrana pode já estar presente nestas fibras e interpretação dos resultados desses experimentos pode ser complicado. Também é importante que a orientação da fibra e definição da região irradiada os definidos na Figura 1. Isto proporciona uma lesão de tamanho reprodutível, permitindo a comparação entre as fibras. Se a região definida de lesão está completamente dentro da fibra, uma lesão interna será criado ao invés de interromper o sarcolema. Além disso, o valor calculado para ΔF / F 0 é muito sensível para a região de interesse selecionada para a medição de fluorescência média. Uma área de aproximadamente 200μm 2, adjacentes, e incluindo o local da lesão, é adequado. Ao contrário da região definida por lesão, esta área deve estar completamente dentro da fibra. Se você incluir espaço fora da fibra, resultando em branco a área vai aumentar ΔF / F 0 em fibras com entrada pouco de corante, reduzindo ΔF / F 0 em fibras com um fenótipo mais grave. Isso diminui a sensibilidade do ensaio, fazendo comparação entre as fibras mais difícil. Para o ensaio danos micropipeta, o ângulo entre o micropipeta e prato fundo de vidro deve ser de aproximadamente 45 graus, a fim de efetivamente dano à membrana celular. As células foram escolhidos por danos micropipeta devem ser bem colocado no fundo do prato e células arredondadas não deve ser usado desde muito provavelmente eles vão separar após micropipeta cutucando. Experimentos permeabilzation saponina são menos exigentes tecnicamente e relativamente rápido para executar comparação com micropipeta ensaios de penetração. No entanto, há várias limitações a danos saponina, incluindo a apenas uma célula pode ser usado por prato desde saponina será difusa e danos outras células que prato.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Esteira de roedores </td><td> Columbus Instruments Exer 06/03 ou equivalente </td><td></td></tr><tr><td> Etanol 70% </td><td> ISC Bioexpress </td><td></td></tr><tr><td> Instrumentos de dissecação, incluindo fórceps de ponta fina, tesoura primavera </td><td> Precision Instruments mundo </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase tipo 2 mg / ml I </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> 0 Ca 2 + tampão Tyrode (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,2, 290 mOsm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> 2.5mm Ca 2 + tampão Tyrode (140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl 2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,2, 290 mOsm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> Temperatura controlável agitador orbital </td><td> New Brunswick ou equivalente </td><td></td></tr><tr><td> Delta Dish TPG </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1207133 </td></tr><tr><td> LSM microscópio confocal 510 com uma empresa de laser UV 80 mW ou microscópio confocal equivalente </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> FM1-43-64 ou FM4 corantes </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicato Tamanho Capilares 0,8-1,0 X 100 mm </td><td> PYREX </td><td> Peça n º 9530-2 </td></tr><tr><td> Micropipeta extrator </td><td> Sutter Instruments </td><td> modelo P-97 </td></tr><tr><td> 3 micromanipulador eixo </td><td> Narishige </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Radiance 2100 microscópio de varredura a laser confocal ou microscópio equivalente </td><td> BioRad </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Sigma </td><td> 47036 </td></tr></tbody></table>

visualization of mg53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems

Reparação de lesão aguda para a membrana celular é um processo elementar de fisiologia celular normal, e com defeito de reparo de membrana tem sido associada a muitas doenças degenerativas humanas. A recente descoberta de MG53 como um componente chave da máquina resealing membrana permite um melhor entendimento molecular da biologia básica de reparação tecidual, bem como para potenciais aplicações translacional em medicina regenerativa. Aqui detalhamos os protocolos experimentais para explorar a função in vivo de MG53 no reparo de lesão muscular, utilizando protocolos de exercício em esteira em modelos de mouse, para testar a capacidade de reparação ex vivo de membrana, medindo entrada corante em fibras musculares isoladas, e para monitorar o processo dinâmico de MG53 mediada tráfico vesícula e reparação da membrana celular em células de cultura de células vivas usando microscopia confocal.

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Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Aqui descritos são protocolos utilizados para visualizar o processo dinâmico de MG53 mediada por reparação de membrana celular em animais inteiros e em nível celular. Estes métodos podem ser aplicados para investigar a biologia das células do plasma resealing membrana e medicina regenerativa.

Visualização de MG53 mediada Repair Membrana Celular Usando In vivo E In vitro Sistemas

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

visualization-mg53-mediated-cell-membrane-repair-using-vivo-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

12.3K visualizações.  Robert Wood Johnson Medical School. Aqui descritos são protocolos utilizados para visualizar o processo dinâmico de MG53 mediada por reparação de membrana celular em animais inteiros e em nível celular. Estes métodos podem ser aplicados para investigar a biologia das células do plasma resealing membrana e medicina regenerativa.

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Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Usando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) para desenvolver ferramentas de diagnóstico

Biologia

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Vídeo Bioinformática Análise de Crescimento Humano embrionárias Colony Stem Cell

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Análise de Schwann-astrócito Interações Usando In Vitro Ensaios

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

Protein Assay Overlay membrana: um protocolo para testar Interação entre proteínas solúveis e insolúveis In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Imagens de células Lesão de Membrana e Processos Subcelulares envolvidas no reparo

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes precursor mRNA beyond the end of mature RNAs, and an active process of endonuclease activity is required at a specific site. Cleavage of the precursor RNA normally occurs 10-30 nt downstream from the consensus polyA site (AAUAAA) after the CA dinucleotides. Proteins from the cleavage complex, a multifactorial protein complex of approximately 800 kDa, accomplish this specific nuclease activity. Specific RNA sequences upstream and downstream of the polyA site control the recruitment of the cleavage complex. Immediately after cleavage, pre-mRNAs are polyadenylated by the polyA polymerase (PAP) to produce mature stable RNA messages.
Processing of the 3&#8217; end of an RNA transcript may be studied using cellular nuclear extracts with specific radiolabeled RNA substrates. In sum, a long 32P-labeled uncleaved precursor RNA is incubated with nuclear extracts in vitro, and cleavage is assessed by gel electrophoresis and autoradiography. When proper cleavage occurs, a shorter 5&#8217; cleaved product is detected and quantified. Here, we describe the cleavage assay in detail using, as an example, the 3&#8217; end processing of HIV-1 mRNAs.

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3&#039; End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polymerase II synthesizes a precursor RNA that extends beyond the 3' end of the mature mRNA. The end of the mature RNA is generated cotranscriptionally, at a site dictated by RNA sequences, via the endonuclease activity of the cleavage complex. Here, we detail the method to study cleavage reactions in vitro.

Análise das reacções de processamento de RNA utilizando células Sistemas gratuitas: 3 &#39;Fim de clivagem de pré-mRNA Substratos<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Medindo a rigidez<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro e In Vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial Intestinal

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.