We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.

1. Geração de Celulares linhas de miniSOG <ol><li> Cresça U2OS (osteossarcoma humano) as células num prato de 35 mm contendo 2 ml de baixo teor de glucose meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que é suplementado com soro a 10% de bovino fetal (FBS) a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 atmosfera. </li><li> Transfectar as células quando estas são 80% confluentes por lipofecção com qualidade transfecção purificada (A269 / 280 1,8-2,0 rácio) construções de plasmídeo contendo as sequências para miniSOG e mCherry proteínas marcadas de reparação de acordo com o protocolo do fabricante do reagente de transfecção 19. Os plasmídeos de expressão miniSOG pode ser encomendado a partir do Tsien-Lab: <a href="http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm">http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm</a> </li><li> Ordenar as células que expressam a proteína recombinante com a tag miniSOG mCherry e de fluorescência de células activadas por triagem dois dias após a transfecção. Coletar célulascom intensidade de fluorescência intermediário, a fim de evitar que as células que sobre-expressam são 20. </li><li> Cultura das células positivas em uma placa de 10 cm em 10 ml de meio DMEM que é suplementado com 10% de FBS e 0,6 mg / ml de agente de selecção de G418 (geneticina). </li><li> Depois de colónias visíveis surgiram nas placas, para tela mCherry colónias positivas utilizando um microscópio invertido de fluorescência e desenhar círculos em torno deles (na parte inferior da placa), com um marcador permanente. Use uma lente objetiva de ar de baixa ampliação (por exemplo, 10x) e escolher clones usando técnica estéril riscando cuidadosamente as colônias fora e, lentamente, chupando-os em um estéril 1000 ul ponteira. </li><li> Expandir as colónias seleccionadas e congelar partes delas para baixo utilizando o meio de crescimento descrito no passo 1.1 suplementado com 10% de sulfóxido de dimetilo. Testar as células para a formação DRF crescente por eles em estéreis 18 x 18 mm 2 lamelas e expondo-os a2 Gy de radiação. As células irradiadas expressando estavelmente uma miniSOG mCherry marcado proteína reparação deve mostrar o padrão característico focal típico de LAP quando visualizados com um microscópio de fluorescência utilizando um filtro definido para a imagem latente mCherry. </li></ol> 2. Cultura celular <ol><li> Cultura células U2OS expressam de forma estável o miniSOG e mCherry proteínas marcadas reparação sob as condições descritas na etapa 1.1. Crescer as células a 80% de confluência num prato de 35 mm de diâmetro com fundo de vidro contendo 2 ml de DMEM. Certifique-se de que a cola que liga a lâmina de cobertura para a plástica e que o plástico usado é resistente a soluções aquosas e alcoólicas e resistente à resina utilizada! </li><li> Antes de realizar o ensaio, o contorno de uma pequena área de aproximadamente 1 mm 2 que contém células que expressam as proteínas ectópicas por raspagem com uma caneta de diamante estéril, utilizando um microscópio de fluorescência para identificar a região de interesse. Como alternativa, use um prato de vidro de fundo tchapéu contém uma lamela com um sistema de rede de pré-gravadas embutido na lamela. NOTA: Se estiver usando microscopia correlativo de alta qualidade combinando ESI e fluorescência imagens microscópicas 21, certifique-se de que a espessura da lamela é compatível com os objectivos de imersão em óleo. Deve ter a espessura n ° s 1.5 (0,16-0,18 mm). Escolha de uma área perto do centro do prato para a região a ser examinada na MET, a fim de evitar problemas com a polimerização da resina, que pode ocorrer perto das bordas (ver ponto de 4,10-4,13). </li></ol> 3. DNA danos Indução <ol><li> Irradiam-se as células com radiação gama, usar uma droga radiomimético, ou induzir o dano por micro irradiação laser em um microscópio confocal (por exemplo, tal como descrito em 18,22 ou 23). </li><li> Neste exemplo, irradiam-se as células com 2 e 6 Gy de irradiação gama de uma fonte de césio-137 ou radiação de laser microirradiate utilizando a Sol 405 nmID de laser de estado de um microscópio confocal após a sensibilização das células durante 20 minutos com 0,5 ug / ml de Hoechst. </li></ol> Preparação 4. Amostra <ol><li> Fixar as células com 1 ml de paraformaldeído a 4% em tampão de cacodilato CUIDADO de sódio 0,1 M ou 0,1 M em tampão de fosfato de pH 7,4 durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. CUIDADO: paraformaldeído e cacodilato de sódio são tóxicas! Usar luvas e descartar adequadamente as substâncias tóxicas. </li><li> Lavar as células duas vezes com 4 ml de 0,1 M de cacodilato de sódio tampão pH 7,4 ou tampão de fosfato de pH 7,4. </li><li> Tratar as células fixadas com 2 ml de 50 mM de glicina, 5 mM de aminotriazolo e 10 mM de cianeto de potássio CUIDADO em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M ou tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,4) (verificar o pH!) Durante 30 min, a fim de bloquear que não reagiu grupos aldeído e para suprimir as espécies de oxigénio reactivas geradas por grupos heme, o que pode aumentar o fundo. CUIDADO: cianeto de potássio é extremamente tóxico! Wluvas de ouvido, trabalhar sob um capuz e eliminar as substâncias tóxicas adequadamente. A reacção é muito sensível ao pH por isso, é importante que o pH verificado e precisas. </li><li> Grave a área que foi selecionada na etapa 2.2 em 2D ou 3D em um microscópio de fluorescência invertido, se microscopia correlativo é desejado. </li><li> Prepara-se uma solução de cloridrato de CUIDADO ml 1 mg / diaminobenzidina, colocando um 10 mg de cloridrato de diaminobenzidina comprimido para um tubo de microcentrifugação de 2 ml. Adicionar 980 ul de H2O destilada e 20 pi de ácido clorídrico concentrado (11,65 M) e misturar até que a solução é castanho claro e translúcidos. Dilui-se esta solução em 0,1 M de fosfato ou tampão de cacodilato de sódio 0,1 M a uma concentração final de 1 mg / ml, enquanto ajustando o pH com hidróxido de sódio a um pH entre 7,0 e 7,6 (pH 7,4 é recomendada). CUIDADO: diaminobenzidina é tóxico! Usar luvas e descartar adequadamente as substâncias tóxicas. </li><li> Para fotooxidação, rmoran Jr. o tampão com 2 ml de uma solução de cloridrato de 1 ml mg / diaminobenzidina em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M ou tampão fosfato. Proteger da luz esta solução e arrefecer-se em gelo a 4 ° C, a fim de aumentar a solubilidade do oxigénio. Saturar a solução com oxigénio fazendo borbulhar oxigénio através da solução (usar uma mangueira que é inserida na solução e ligada a uma garrafa de oxigénio). Verifique novamente o pH e ajustar, se necessário. NOTA: É crucial para a reacção de foto-oxidação que o pH é entre pH 7,0 e pH 7,6. </li><li> Monte o prato com as células fixas com cuidado sobre um microscópio invertido de fluorescência equipado com uma lente objetiva de 40x de imersão em óleo e movê-lo para a área de interesse. Excitar a tag miniSOG com luz azul, usando filtros de cubos para GFP ou PCP. MiniSOG tem um máximo de excitação a 448 nm com um ombro a 473 nm de 10. </li><li> Continue com a iluminação, mesmo após a miniSOG fluorescência ha verdeé completamente desaparecido e até que o produto de foto-oxidação marrom do diaminobenzidina polimerizado surge no canal de luz transmitida. Quando o produto de oxidação é visível na maioria das células, desligar a iluminação de fluorescência para parar o foto-oxidação. NOTA: A foto-oxidação pode levar vários minutos, dependendo da lente objetiva, comprimentos de onda de transmissão de filtro e eficiência, e da fonte de iluminação. </li><li> Sufixo as células com 1 ml de glutaraldeído a 2% em cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,4 tampão de fosfato ou tampão de pH 7,4 durante 30 min. </li><li> Fixar as membranas das células com 0,1% -0,5% de tetróxido de ósmio durante 20 minutos em 0,1 M de cacodilato de sódio tampão pH 7,4 ou em tampão fosfato 0,1 M pH 7,4. NOTA: Recomenda-se usar a menor concentração possível de tetróxido de ósmio necessário para estabilizar as membranas. Uma vez que os precipitados DAB polimerizado ter uma elevada densidade de azoto, o qual pode ser detectado directamente por ESI, um fortecoloração ósmio não é necessário identificar a proteína miniSOG-marcado e pode ser prejudicial para a ESI. Tetróxido de ósmio é muito tóxico! Trabalhar em um exaustor e descartar o lixo tóxico adequadamente. </li><li> Desidratar, as células através de uma série de etanol, utilizando 30%, 50%, 70%, 90%, 98% passos de etanol (100% a cada 5 min). Subsequentemente, incubar as células numa proporção de 1: 1 mistura de etanol a 100% e resina acrílica (LR branco) e colocar o prato num agitador durante 4 h, para facilitar a infiltração das células antes da incubação das células durante, pelo menos, mais 4 h em 100 resina acrílica% (LR Branco). </li><li> De modo a polimerizar a resina, retira a tampa de um tubo de microcentrifugação de 2 ml rotulados com uma lâmina de barbear e o revestimento da jante com acelerador de resina acrílica. Certifique-se de que o acelerador só cobre a borda e não flui para dentro do tubo. Subsequentemente, cuidadosamente encher o tubo, aproximadamente, dois terços com resina LR branco, utilizando uma pipeta de Pasteur. Tome cuidado para que a resina não entrar em contato with o acelerador no aro! </li><li> Remover a resina de que as células infiltradas no prato e colocar o prato de cabeça para baixo no tubo de microcentrífuga que está na posição vertical de modo a que a largura do tubo preenche quase completamente a janela de observação de vidro revestido do prato. </li><li> Aguardar 1 a 2 minutos para o acelerador para selar o tubo e a lamela, em seguida, inverter o tubo de modo que a resina no tubo de cobre agora as células. </li><li> Colocar a cápsula com o tubo num forno a 60 ° C e curar durante 12 horas. </li><li> Quando o bloco é curado, remover o prato com o tubo de microcentrífuga cheio de resina ligada a partir do forno e separar o tubo de microcentrífuga do prato. Facilitar a separação por ciclos de congelamento e descongelamento em nitrogênio líquido e água quente. </li><li> Descarte o prato fundo de vidro e corte cuidadosamente abrir o tubo de microcentrífuga com uma lâmina de barbear, a fim de eliminar o bloqueio. </li><li> Rotular o bloco com um marcador permanente. </li><li> Use uma lâmina de barbear para trim do bloco de modo que nada a não ser a região de 1 mm2 que contém a área previamente marcado com a caneta de diamante ou de tungsténio (ou contém a área com as células de interesse) permanece. </li><li> Monte o bloco em um ultramicrótomo, cortar o bloco com uma faca de aparar e cortar seções ultra-finas de cerca de 50 nm usando uma faca de diamante. </li><li> Pegue as seções sobre-elevada da transmissão 300 redes de malha. Estas redes têm muito pequenas barras de grade e, assim, cobrir menos células na área de interesse. </li><li> Brasão as seções sobre as grades com cerca de 0,2-0,4 nm de carbono, usando um aplicador de carbono para ajudar a estabilizá-los sob o feixe de elétrons do TEM. </li></ol> 5. Microscopia Eletrônica <ol><li> Carregar as grades em uma TEM que esteja equipado com um filtro de energia. Depois de ajustar o microscópio e o filtro de energia de acordo com as instruções do fabricante, inspeccionar as células sobre as secções no modo de ampliação baixa (de transmissão normal) e compararlos para dados de fluorescência quando apropriado (obtido na etapa 4.4). </li><li> Uma vez que um núcleo com características interessantes (DNA danos trilha ou reparo de DNA focos) é encontrado, mude para o modo de filtragem de energia e gravar um mapa espessura. NOTA: Este procedimento inclui a gravação de um-zero perda e uma imagem não filtrada. Espessuras de até 0,3 livre percurso médio (30% dos elétrons do feixe incidente fica espalhada por amostra) são finas o suficiente para gerar bons mapas elementares. </li><li> Mapas relação ficha do fósforo e nitrogênio elementos usando o software que controla o filtro de energia do microscópio usado. Grave as imagens mapa fósforo pós ponta a 175 eV perda de energia com a largura da fenda de 20 eV e pré-edge imagens em 120 eV perda de energia, também com uma largura da fenda de 20 eV. Para os mapas de nitrogênio, ficha imagens pós ponta em 447 eV com a largura da fenda de 35 eV e pré-edge imagens em 358 eV, também com uma largura da fenda de 35 eV. Observação: Uma vez que o teor dos elementos clonados (fosforus e nitrogênio) é relativamente baixa (aprox. 1%), escolha &quot;Proporção da imagem&quot; (mapa elementar qualitativa) sobre o &quot;método 3 janela&quot; (quantificar mapa elementar), a fim de gerar imagens com uma melhor relação sinal-ruído. </li></ol> 6. Processamento de Imagem <ol><li> Abra os mapas de relação elementares em um software de processamento de imagem que pode lidar com o formato de arquivo das imagens adquiridas (por exemplo, Micrografia Digital). Copie o nitrogênio mapa para o canal vermelho eo mapa de fósforo para o canal verde de uma imagem RGB, em seguida, sobrepor e alinhar os mapas. </li><li> Exportar a imagem composta como um arquivo de imagem formato de arquivo (TIFF). Abra a imagem em um software de processamento de imagem que podem usar camadas (por exemplo, Photoshop). </li><li> Ajustar a gama dinâmica de cada canal por rescaling a valores mínimos e máximos na imagem para um conjunto de dados de 8 bits (0 a 255). </li><li> Subtrair o teor de fósforo a partir do nitrogênio mapa (usando oJanela &quot;camadas&quot;), a fim de gerar um mapa qualitativo, que mostra a distribuição da proteína. </li><li> Converter os mapas do ácido nucleico (fósforo) e a proteínas (azoto) criado na etapa anterior em &quot;cores indexadas&quot; e criar uma tabela de pesquisa amarelo no espaço de cores CMYK para o mapa que mostra a distribuição do ácido nucleico e uma tabela de pesquisa ciano para mostrar o mapa não-nucleoproteína. As cores são escolhidas para gerar o máximo contraste entre os dois mapas elementares. </li><li> Crie uma nova imagem e importar os mapas que mostram as distribuições de fósforo e proteínas como diferentes camadas. Use o modo de transparência &quot;screen&quot;, a fim de ver as duas camadas sobrepostas umas sobre as outras. </li><li> Abra a imagem perda de zero adquirido na etapa 5.2. Esta imagem representa uma imagem da área gravada que se parece com uma imagem TEM convencional, mas contém apenas os elétrons que passaram através do espécime sem colidir com o modelo. Exportaçãoesta imagem como uma imagem TIFF. </li><li> Abra a imagem zero perda exportado em um editor de fotos e copiá-lo para a camada superior da imagem que mostra o mapa elementar. Alinhe a imagem usando o modo de transparência &quot;tela&quot;. </li><li> Opcionalmente, o limiar de imagem perda de zero para o segmento de sinal que se origina a partir do miniSOG. Adicionar a imagem resultante como uma camada separada, tal como descrito acima. </li></ol>

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	<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).</li><li>Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometric+analysis+of+protein-+and+nucleic+acid-based+structures+in+the+cell+nucleus.">Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus.</a> Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).</li><li>Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Visualization+of+a+Protein+Nuclear+Architecture.">Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture.</a> Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).</li><li>Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+microanalysis+of+biological+specimens+by+electron+energy+loss+spectroscopy+and+by+electron+spectroscopic+imaging.">High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging.</a> Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).</li><li>Leapman, R. D., Ornberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).</li><li>Simon, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spectroscopic+imaging.">Electron spectroscopic imaging.</a> Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).</li><li>Egerton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , (2011).</li><li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+thickness+correction+of+EFTEM+phosphorus+maps.">Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps.</a> Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).</li><li>Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+molecules+employing+horseradish+peroxidase+as+reporter+enzyme+for+protein+localization+in+the+electron+microscope.">Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope.</a> Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLoS biology. 9, e1001041 (2011).</li><li>Gaietta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).</li><li>Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focusing+on+foci:+H2AX+and+the+recruitment+of+DNA-damage+response+factors.">Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).</li><li>Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+Rad51+recombination+protein+in+somatic+cells+after+DNA+damage+and+its+localization+in+synaptonemal+complexes.">Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).</li><li>Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hMre11+and+hRad50+nuclear+foci+are+induced+during+the+normal+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).</li><li>Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+function+of+DNA+double-strand+break+repair+foci+in+mammalian+cells.">Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells.</a> DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).</li><li>Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1-associated+exclusion+of+53BP1+from+DNA+damage+sites+underlies+temporal+control+of+DNA+repair.">BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair.</a> Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).</li><li>Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+imaging+of+changes+in+the+structure+and+spatial+organization+of+chromatin,+gamma-H2A.X+and+the+MRN+complex+within+etoposide-induced+DNA+repair+foci.">High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).</li><li>Kruhlak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+chromatin+structure+and+mobility+in+living+cells+at+sites+of+DNA+double-strand+breaks.">Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).</li><li>Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+cell+lines+expressing+GFP-tubulin+and+photoactivatable-GFP-tubulin+and+characterization+of+clones.">Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).</li><li>Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+sorting+conditions+for+the+selection+of+stable,+high-producing+mammalian+cell+lines.">Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines.</a> Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).</li><li>Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+spectroscopic+imaging+of+chromatin+in+situ.">Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ.</a> Methods in enzymology. , 375-456 (2004).</li><li>Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+repressive+complex+2+contributes+to+DNA+double-strand+break+repair.">Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair.</a> Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).</li><li>Mortusewicz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+RNA+polymerase+II+cofactor+PC4+to+DNA+damage+sites.">Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites.</a> J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).</li><li>Bekker-Jensen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+mammalian+genome+surveillance+machinery+in+response+to+DNA+strand+breaks.">Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).</li><li>Ferrando-May, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlighting+the+DNA+damage+response+with+ultrashort+laser+pulses+in+the+near+infrared+and+kinetic+modeling.">Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling.</a> Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).</li><li>Lukas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+nuclear+bodies+form+around+DNA+lesions+generated+by+mitotic+transmission+of+chromosomes+under+replication+stress.">53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress.</a> Nature. 13, 243-253 (2011).</li><li>Harrigan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+stress+induces+53BP1-containing+OPT+domains+in+G1+cells.">Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).</li><li>Aronova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprint+of+'Three-dimensional+elemental+mapping+of+phosphorus+by+quantitative+electron+spectroscopic+tomography+(QuEST).">Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST).</a> J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).</li><li>Fussner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+heterochromatin+reorganization+during+somatic+cell+reprogramming.">Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming.</a> The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).</li><li>Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KAP1+depletion+increases+PML+nuclear+body+number+in+concert+with+ultrastructural+changes+in+chromatin.">KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin.</a> Cell cycle. 10, 308-322 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ESI pode servir como uma ferramenta excelente para examinar diferentes estados de cromatina e ribonucleoproteínas no núcleo, porque é capaz de mapear especificamente áreas que são ricos em fósforo. É profundamente aumenta a quantidade de detalhe que pode ser obtida por um microscópio electrónico, e não é dependente de métodos de contraste não específicos. Uma desvantagem de ESI é que ele requer secções mais finas do que MET convencional com a mesma voltagem de aceleração. Isso pode ser superado por tr...

Apesar dos avanços significativos em microscopia de luz nos últimos anos 1, biólogos celulares continuam a sofrer de uma lacuna na resolução. Isto limita a compreensão das relações estrutura-função em processos celulares fundamentais que envolvem a interacção coordenada entre complexos macromoleculares (por exemplo, na remodelação da cromatina, a reparação do ADN, a transcrição de ARN e ADN de replicação). Embora microscópios de electrões de transmissão (MET) é fornecer a resolução necessária, tem sido um desafio para definir estes processos estruturalmente por causa da incapacidade de marcar as proteínas específicas, enquanto também é capaz de determinar a composição bioquímica das estruturas visualizadas. Na ausência de membranas internas para ajudar a diferenciar estruturas nucleares, o núcleo tem sido particularmente difícil. Electron espectroscópica imagiologia (ESI) resolve algumas destas limitações, permitindo a detecção e diferenciação simultâneas de ADN, ARN, e Protein baseada em estruturas nucleares 2-5. Electron imagens espectroscópicas: Para mapear distribuições elementares em alta sensibilidade e resolução do microscópio eletrônico, pode-se usar um espectrômetro de imagem que seleciona os elétrons que foram inelasticamente espalhadas através de interações com electrões de interiores de um elemento na amostra 6. Devido quantidades específicas do elemento de energia são perdidos em consequência de ionização de átomos presentes na amostra, estes electrões pode ser separada e visualizada utilizando um espectrómetro que está ligado ao microscópio electrónico. Assim, a análise do espectro dos electrões que interagiram com o espécime revela informação qualitativa e quantitativa sobre a composição elementar da amostra 7. Os electrões que não perdem energia ao passar através da amostra encontram-se na &quot;perda do pico a zero&quot; da perda de energia dos electrõesespectro. A abundância destes electrões está relacionada com a massa, densidade e espessura do espécime e é composta de electrões que passam através do espécime, sem colidir com a amostra ou a perda de energia durante a passagem através da amostra. Esta informação pode ser útil para a quantificação absoluta do número de átomos de um elemento específico presente na amostra 8. Uma vez que as amostras biológicas consistem principalmente em elementos leves que mal desviar os electrões no feixe incidente do MET, utilizando métodos de coloração de metal pesado sais têm de ser aplicadas, a fim de gerar contraste na amostra. A falta de especificidade da maior parte destes agentes de contraste e a incapacidade para visualizar mais do que uma mancha, onde é possível a especificidade tem limitado o valor de microscopia electrónica convencional no estudo do núcleo. ESI tem vantagens significativas sobre MET convencional, nomeadamente para o estudo das estruturas do núcleo da célula.É possível explorar a natureza rica em fósforo de ADN e de complexos macromoleculares contendo ARN para distinguir os complexos nucleoproteicos de complexos de proteínas e diferentes para resolver os complexos nucleoproteicos com base na sua densidade de ácidos nucleicos. O restante material biológico pode ser trabalhada com base na sua abundância de azoto. Mapeamento apenas estes dois elementos e análise de sua distribuição e abundância relativa dentro de estruturas anatômicas diferentes nos fornece uma série de informações sobre o núcleo. Por exemplo, é fácil de identificar cromatina e os ribossomas no mapa representam abundância de fósforo. O espaço interchromatin, complexos de poros nucleares, e corpos nucleares, por outro lado, pode ser facilmente detectada na imagem do mapa de azoto. Mini sistema gerador de oxigênio singlete (miniSOG) Enquanto ESI representa uma técnica poderosa para estudar na estrutura da cromatina situ porque tomarA vantagem dos índices característicos na composição elementar entre fósforo e nitrogênio, a composição elementar não pode normalmente ser usado para discriminar entre diferentes populações de complexos de proteínas. Os anticorpos marcados com partículas de ouro pequenas na gama nanométrica têm sido amplamente utilizados para mapear a localização de moléculas individuais. Uma vez que a partícula de ouro está geralmente ligado a um anticorpo secundário, que aparece dentro de uma circunferência de cerca de 20 nm, em torno do epitopo detectada pelo anticorpo primário. Em amostras de pós-incorporação, anticorpos pode detectar apenas os epítopos expostos à superfície das secções. Embora seja possível para provar a presença de um antigénio e relacioná-la com uma determinada estrutura anatómica da célula, a informação que é obtida é incompleta, uma vez que a maioria dos epitopos são obscurecidos por resina. As técnicas que utilizam protocolos semelhantes aos usados ​​para a microscopia de fluorescência pré-incorporação, permitir o acesso a todo antigéniostoda a profundidade da amostra, mas as etapas permeabilização que são necessários para permitir que o anticorpo para penetrar a célula normalmente requerem a remoção de membranas lipídicas e remover componentes que não podem ser fixados por aldeídos. Além disso, o fixador de aldeído preferido para a preservação ultraestrutura, glutaraldeído, comumente destrói epitopos e, consequentemente, paraformaldeído é normalmente necessária. Esta é menos eficaz a reticulação da proteína-proteína. Outra desvantagem de que os anticorpos são marcados com uma nanopartícula de ouro é que o ouro é um material muito denso de electrões que criam uma forte contraste que podem obscurecer detalhes estruturais interessantes da amostra, o que tem mais fraco contraste. O surgimento da proteína fluorescente verde (GFP) como uma marca de proteína expressa transformou a utilização de microscopia de fluorescência para responder a perguntas em biologia celular. Marcação de uma proteína com um domínio pequeno fluorescente permite o mapeamento de sua distribuição in vivo </em&gt; sem a necessidade de procedimentos de permeabilização que podem alterar a estrutura. A fim de traduzir o princípio elegante de usar etiquetas proteicas para mapear distribuições de proteína numa célula para microscopia de electrões, foi necessário um sistema que é capaz de produzir um sinal para fechar a estrutura de interesse e gerar contraste na MET. Diaminobenzidina polimerizada é um corante que é muitas vezes usado em histologia para detectar a ligação do anticorpo. Este corante é geralmente depositado utilizando peroxidase de rábano (HRP) conjugado com um anticorpo secundário. Embora a reacção produz um resultado fiável, a HRP não é cataliticamente activo no citosol de células 9. Os produtos da reacção de HRP pode também difundir para longe do local de geração de modo que a sua resolução é pior do que o método nanogold 10. Para contornar esses problemas, o Sistema de Flash / ReAsH foi desenvolvido 11. É constituída por proteínas de fusão recombinantes que possuem um motivo tetracisteï¿½a. Este motivo permite a ligação deum fluoróforo biarsenic. Quando excitado, o flash ligado ou ReAsH é capaz de gerar o oxigénio singeleto altamente reactivo e portanto photoconvert diaminobenzidina (DAB) num polímero que precipita imediatamente no local das proteínas marcadas. O polímero DAB pode ser coradas com tetróxido de ósmio, que é de electrões denso e, portanto, pode ser utilizada para mapear a distribuição da proteína de fusão recombinante em MET. Em 2011, Shu et al. 10, apresentado o sistema miniSOG, que consiste de uma pequena 106 amino ácidos tag de fusão derivada de uma flavoproteína de Arabidopsis que é fluorescente e capaz de criar muitos radicais de oxigénio singleto quando excitado com luz azul de 448 nm. Esses radicais oxigénio singuleto pode ser usado para oxidar foto-diaminobenzidina para formar polímeros sobre e perto da superfície da proteína marcada, que é consideravelmente mais estreita do que os anticorpos marcados por imuno 11. Enquanto o sistema de flash / ReAsH requer trazendo o flúorcromo eo diaminobenzidina para as células antes de fazer a fotoconversão, o sistema requer apenas miniSOG diaminobenzidina e luz e, além disso é de cerca de duas vezes mais eficaz na polimerização de diaminobenzidina. Aqui, miniSOG é empregada em combinação com ESI, a fim de mapear a ultra-estrutura de reparo do DNA focos. Reparo do DNA focos (DRF) DNA reparado rupturas de filamentos duplos representam uma séria ameaça para a célula, uma vez que pode levar a translocações e perda de informação genética. Por sua vez, isto pode levar a senescência, cancro, e morte celular. Muitas proteínas que estão envolvidas na reparação de DNA dupla vertente pausa acumular em focos que montar em torno de um DNA dupla vertente quebrar 12-14. Embora sua função não é conhecida, eles representam o site no núcleo que contém o DNA quebra de cadeia dupla e é o local de DNA dupla vertente de reparação pausa. Reparo do DNA foci (DRF) foram caracterizados por microscopia de fluorescência e que servem como biomarcadores para o dano ao DNA 12,15. Eles são em massa em relação ao tamanho da ruptura de fita dupla e foram consideradas relativamente homogénea até recentes estudos de microscopia de super-resolução revelou alguma evidência de sub-compartimentação de moléculas dentro de cada foco 16. A fim de compreender como estes locais são organizadas, é necessário visualizar todas as estruturas biológicas subjacentes em relação ao outro. Isso não pode ser alcançado por microscopia de fluorescência, mas é possível através de microscopia eletrônica de 17,18. Aqui, é descrito um método que combina eletrônica espectroscópica de imagem com o método miniSOG para ilustrar o potencial dessa abordagem combinada para explorar a ultra-estrutura de reparo de DNA de fita dupla ruptura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded 35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-2-14-CGRD&#160;</td>
			<td>not made for immersion objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White: acryl resin</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>14381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White accelerator</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>14385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim Bar Grids 300 Mesh</td>
			<td>SPI</td>
			<td>1161123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten-Point Lab Pen</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>41148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater 208carbon</td>
			<td>Cressington</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra microtome Leica EM UC6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS5</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>might even work with older versions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Micrograph V.2.30</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td>might even work with older versions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSOG-Constructs</td>
			<td>Tsien-Lab</td>
			<td></td>
			<td><a href="mailto:tsienlab@yahoo.com">tsienlab@yahoo.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDC1 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>53BP1 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rad52 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium 137 radiation source &#34;MARK 1&#34;</td>
			<td>&#160;(J.L. Shepherd &#38; Associated)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FiJi</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Knife ultra 35&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming Knife ultratrim</td>
			<td>Diatome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>12300</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde EM Grade 8%</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>16020</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>21180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>21190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution 10M</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Medigas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Amino-1,2,4-triazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium cyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>207810</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>15058</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade Single Edge Carbon Steel</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>71960</td>
			<td>Caution Sharp!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope 200 kV</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIF Tridiem 863 Energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of minisog tagged dna repair proteins in combination with electron spectroscopic imaging (esi)

Os limites para a resolução óptica e o desafio de identificar populações específicas de proteínas em microscopia eletrônica de transmissão têm sido obstáculos na biologia celular. Muitos fenómenos não pode ser explicado por meio de análise in vitro em sistemas simplificados e necessitam de informação estrutural adicional in situ, em particular na gama entre 1 nm e 0,1 um, a fim de ser completamente compreendida. Aqui, imagens espectroscópicas elétron, uma técnica de microscopia eletrônica de transmissão que permite o mapeamento simultâneo da distribuição de proteínas e ácidos nucleicos, e uma tag de expressão, miniSOG, são combinados para estudar a estrutura e organização do DNA de fita dupla focos reparo ruptura.

ESI Comparando as imagens ESI do núcleo (Figura 1) com as imagens de TEM convencionais (por exemplo, a Figura 7-1) revela um aumento dramático nas estruturas anatómicas que podem ser facilmente distinguidas. As cristas de cromatina aparecem em amarelo e é bastante fácil de identificar os chromocenters em células de ratinho. Nucléolos pode ser facilmente distinguida da cromatina por sua estrutura rodada e cor ...

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Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

visualization-minisog-tagged-dna-repair-proteins-combination-with

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

10.0K visualizações.  University of Alberta. Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

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Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Estudos genéticos de proteínas de reparo do DNA Humano Utilizando Levedura como um sistema modelo

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Biologia

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Mismatch Repair imagem e respostas celulares a danos no DNA em Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

Visualização de MG53 mediada Repair Membrana Celular Usando In vivo E In vitro Sistemas

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualização da ATP sintase Dimers na mitocôndria por Electron Cryo-tomografia

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

A visualização de tethered-grande superfície moléculas de ADN com um ADN de proteína fluorescente Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualização de compactação do DNA em cianobactérias por tomografia computadorizada de alta tensão Cryo-elétron

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

Visualização de Proteínas de Reparação de DNA Interação por Imunofluorescência

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light represents a revolutionary advance for studies of the neural basis of behavior. However, a downside of this development is its tendency to focus investigators on a very small number of &#8220;designer&#8221; organisms (e.g., C. elegans and Drosophila), potentially negatively impacting the pursuit of comparative studies across many species, which is needed for identifying general principles of network function. The present article illustrates how optical recording with voltage-sensitive dyes in the brains of non-transgenic gastropod species can be used to rapidly (i.e., within the time course of single experiments) reveal features of the functional organization of their neural networks with single-cell resolution. We outline in detail the dissection, staining, and recording methods used by our laboratory to obtain action potential traces from dozens to ~150 neurons during behaviorally relevant motor programs in the CNS of multiple gastropod species, including one new to neuroscience &#8211; the nudibranch Berghia stephanieae. Imaging is performed with absorbance voltage-sensitive dyes and a 464-element photodiode array that samples at 1,600 frames/second, fast enough to capture all action potentials generated by the recorded neurons. Multiple several-minute recordings can be obtained per preparation with little to no signal bleaching or phototoxicity. The raw optical data collected through the methods described can subsequently be analyzed through a variety of illustrated methods. Our optical recording approach can be readily used to probe network activity in a variety of non-transgenic species, making it well suited for comparative studies of how brains generate behavior.

This protocol presents a method for imaging neuronal population activity with single-cell resolution in non-transgenic invertebrate species using absorbance voltage-sensitive dyes and a photodiode array. This approach enables a rapid workflow, wherein imaging and analysis can be pursued over the course of a single day.

Imagem óptica baseada em fotodiodo para dinâmica de rede de gravação com resolução de neurônio único em invertebrados não transgênicos

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...