Estamos muito gratos a K. Nakagaki, H. Dr. Ishii, Dr. K. Suzuki, Yamagata A., K. Oofusa por suas valiosas contribuições.

1. Produção e purificação de sGMRα <ol><li> Amplificar cDNA de sGMRα da biblioteca de cDNA placenta humana por reação em cadeia da polimerase (PCR). </li><li> Adicionar 50 base de 5&#39;-UTR seqüência de final poliedrina baculovírus e 27 RGS base de codificação Sua tag-de-final 3 &#39;do fragmento amplificado pela PCR por outro PCR. </li><li> Inserir o produto amplificado de PCR em um pMSG1.1MG plasmídeo. </li><li> Injetar o psGMR/M1.1MG construir com o vetor helper pHA3PIG em ovos de bicho-da-tensão pnd-w1. </li><li> Traseira do chocados G0 larvas às traças a 25 ° C. Tela de embriões obtidos por meio de cruzamentos G1 entre irmãos ou com pnd-w1 para a expressão MGFP nos olhos para obter transgênicos bichos tendo o gene sGMRα. </li><li> Extrato recombinante sGMRα dos casulos de bicho-da-transgênicos com tampão fosfato contendo 500mM NaCl e mexa a 4 ° C por 24h. </li><li> Centrífuga de amostra em 20.000 g por 15 min para remover um precipitados. </li><li> Aplicar o sobrenadante para uma coluna de níquel afinidade. </li><li> Lavar a coluna com 10mM imidazol, NaCl 500mM e fosfato de sódio 20mM, pH6.3, e eluir com um gradiente linear de imidazol de 10mm a 250mm. Piscina as frações contendo o sGMRα purificado e diálise contra tampão fosfato (pH7.4) (PBS). </li></ol> 2. Biotinilação de GM-CSF recombinante <ol><li> Remover preparação sorbitol por diálise contra PBS. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de sódio 20mM frio meta-periodato a 4 ° C para a solução em gelo. </li><li> Incubar a amostra por 30min no gelo no escuro. </li><li> Adicionar glicerol para a solução em uma concentração final de 15mM. </li><li> Diálise a solução contra tampão acetato de sódio 100mM (pH5.5) </li><li> Adicionar biotina hidrazida para a solução em uma concentração final de 5mM e continuamente agitar a solução para 2h em temperatura ambiente. </li><li> Remover o material não reagiu por diálise contra PBS, pH7.4. </li></ol> 3. Uma célula-livre GM-CSF receptor-ligand-binding ensaio <ol><li> Placa de um casaco de microtitulação com 50μl de anticorpo monoclonal anti-polyHistidine overnight a 4 ° C. </li><li> Lavar cinco vezes com 500μl de PBST. </li><li> Adicionar 100μl de uma solução de bloqueio e incubar por 3h a 4 ° C. </li><li> Lavar cinco vezes com 500μl de PBST. </li><li> Adicionar 50μl de sGMRα na solução de bloqueio e incubar overnight a 4 ° C. </li><li> Lavar cinco vezes com 500μl de PBST. </li><li> Adicionar 25μl das amostras contendo GM-CSF auto-anticorpos e, em seguida, 25μl de biotinilado GM-CSF. Incubar por 1h a 4 ° C para formar sGMRα-GM-CSF complexo. </li><li> Lavar cinco vezes com 500μl de PBST. </li><li> Adicionar 50μl de 0.4mm fosfatase alcalina estreptavidina para uma hora a 4 ° C para detectar a biotinilado GM-CSF ligado sGMRα. </li><li> Lavar cinco vezes com 500μl de PBST. </li><li> Adicionar 50μl de um substrato quimioluminescente para a solução e incubados por 1h em temperatura ambiente. </li><li> Usando um leitor de placas de quimioluminescência, detectar a atividade quimioluminescência. </li></ol> 4. Resultados representativos: O primeiro passo para a GM-CSF via de transdução de sinal receptor é a ligação do GM-CSF a GM-CSF alpha receptor na superfície da célula. Porque a GM-CSF auto-anticorpos se liga especificamente GM-CSF e bloquear a sua ligação ao receptor in vitro 16,17, temos a hipótese de que os auto-anticorpos inibem esta primeira reação diretamente ligação a GM-CSF. Como descrito anteriormente (Ref. 15/09), foi aplicado transgênicos tecnologia-da-seda para obter uma grande quantidade de sGMRα recombinante com alta pureza. Quando o bicho derivados sGMRα recombinante foi carregado no SDS-PAGE em condições não-condições redutoras, o sGMRα mostrou tanto monomérica (45 kDa) e dimérica (90 kDa) formas, enquanto que apenas a forma monomérica foi detectado em condições redutoras (Figura 1B) , indicando que o sGMRα recombinante foi uma mistura de monômeros e dissulfeto-linked dimmers 18. Utilizando o sistema de células livres (Fig. 2A), avaliou-se a inibição da GM-CSF ligação a sGMRα pela GM-CSF auto-anticorpos (Fig. 2B e Figura. 2C). Estes métodos foram descritos na referência 19 por Urano et al. A inibição do crescimento foi estreitamente relacionado com a inibição de ligação (r = 0,988, p = 0,002) em várias concentrações dos auto-anticorpos GM-CSF (Fig. 3A) 19. Da mesma forma, a inibição de ligação foi significativamente correlacionada com a inibição do crescimento. A inibição de ligação aumentou de forma dose-dependente pela GM-CSF auto-anticorpos (Fig. 3B) 19. Estes dois parâmetros para as frações de soro IgG de diferentes pacientes foram correlacionados entre si (r = 0,589 p = 0,006, fig. 3C). Nem a inibição de ligação, nem a inibição do crescimento correlacionado com os valores de Kd, e assim, ambos os parâmetros não foram afetados pela afinidade de ligação 19. Consequentemente, reprodutibilidade de dados entre vinculativo e gCRESCIMENTO inibição obtidos através três experimentos independentes em três diferentes amostras foi avaliada. O coeficiente de variação indicou que o sistema livre de células foi mais excelente do que o de bioensaio (tabela 1). <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Fluxograma do procedimento para a produção de transgênicos sGMRα usando bichos. A) As estruturas dos vetores de transformação 9-11. B) SDS-PAGE e coloração Coomassie Brilliant Blue-do sGMRα purificada sob redutores e não redutores condições. sGMRα, solúvel GM-CSF receptor alfa; MGFP, monstro proteína verde fluorescente; BmNPVpol5&#39;-UTR, 5&#39;-não traduzida seqüência região de Bombyx mori poliedrose nuclear vírus poliedrina; polyA SV40, SV40 seqüência de sinal polyA; P 3xP3, 3xP3 promotor; P SER1, SER1 promotor; FIBL polyA, fibroína L de cadeia seqüência de sinal polyA; hr3, Bombyx mori vírus da poliedrose nuclear hr3 enhancer. <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esquema do sistema de ensaio livre de células. A) Um ensaio de ligação competitiva utilizando sGMRα produzido pelo bicho da seda. B) Efeito de anticorpos neutralizantes e não-neutralizantes na inibição de ligação por celular sem sistema. C) A diferença de inibição de ligação entre várias concentrações de anticorpos neutralizantes e não-anticorpos neutralizantes. GM-CSF, estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos fator; sGMRα, solúvel GM-CSF receptor alfa; Sua, RGS-His-tag, AP, fosfatase alcalina. <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. GM-CSF inibição de ligação para sGMRα por efeito de GM-CSF anticorpos policlonais ou frações de soro IgG de pacientes com PAP auto-imunes. A) Relação entre a inibição de ligação e inibição do crescimento por GM-CSF auto-anticorpos. B) inibição Binding em várias concentrações de GM-CSF auto-anticorpos. C) Relação entre IC 50 por cento para a inibição da ligação e inibição do crescimento por cento em frações de soro IgG 19. IC 50, 50% da concentração inibitória; GM-CSF, granulócitos e macrófagos fator estimulante de colônia. <table border="1"><tbody><tr><td> Amostra </td><td> A </td><td> B </td><td> C </td></tr><tr><td colspan="4"> Inter-ensaio </td></tr><tr><td> # Das determinações </td><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Valor médio (% de inibição de ligação) </td><td> 61,6 </td><td> 63,8 </td><td> 69,7 </td></tr><tr><td> Valor médio (inibição do crescimento%) </td><td> 21,0 </td><td> 73,4 </td><td> 82,8 </td></tr><tr><td> Coeficiente de variação (%) (% de inibição de ligação) </td><td> 6 </td><td> 5,6 </td><td> 8,3 </td></tr><tr><td> Coeficiente de variação (%) (inibição do crescimento%) </td><td> 64,4 </td><td> 18,3 </td><td> 10,4 </td></tr></tbody></table> Ambos os ensaios foram realizados em 5 ng / ml de GM-CSF e uma concentração igual a GM-CSF auto-anticorpos. Tabela 1. Comparação de coeficiente de variação entre vinculativo por cento e as inibições de crescimento obtidos através de três experimentos independentes.

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target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+GM-CSF+receptor+complex+reveals+a+distinct+mode+of+cytokine+receptor+activation.">The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation.</a> Cell. 134, 496-507 (2008).</li></ol>

O ensaio livre de células estimou a capacidade de neutralização de GM-CSF auto-anticorpos com excelente reprodutibilidade e rapidez. A inibição de ligação por auto-anticorpos GM-CSF ou frações de soro do paciente IgG foi avaliada por este ensaio. Os dados mostraram uma correlação entre a inibição de ligação do ensaio livre de células ea inibição do crescimento de um bioensaio utilizando células TF-1, respectivamente. O bioensaio tem sido amplamente utilizada, mas abrigava dificuldades na comparação ...

a cell free assay system estimating the neutralizing capacity of gm-csf antibody using recombinant soluble gm-csf receptor

FUNDOS: Anteriormente, demonstramos que a capacidade de neutralizar, mas não a concentração de GM-CSF auto-anticorpos foi correlacionada com a severidade da doença em pacientes com proteinose alveolar pulmonar auto-imunes (PAP) 1-3. Como revogação da GM-CSF bioatividade no pulmão é a causa mais provável para PAP auto-imunes 4,5, é promissora para medir a capacidade de neutralização de GM-CSF auto-anticorpos para avaliar a gravidade da doença em cada paciente com PAP. Até agora, a capacidade de neutralização de GM-CSF auto-anticorpos foi avaliada através da avaliação da inibição do crescimento de células de medula óssea humana ou TF-1 células estimuladas com GM-CSF 6-8. No sistema de bioensaio, no entanto, muitas vezes é problemático para obter dados fiáveis, bem como comparar os dados de diferentes laboratórios, devido a dificuldades técnicas na manutenção das células em uma condição constante. OBJETIVO: Para imitar GM-CSF ligação ao GM-CSF receptor na superfície celular utilizando células livres receptor-ensaio de ligação. MÉTODOS: Transgênicos bicho-da-tecnologia foi aplicada para a obtenção de uma grande quantidade de recombinante solúvel GM-CSF receptor alfa (sGMRα) com alta pureza 9-13. O sGMRα recombinante foi contido nas camadas sericin hidrofílica de fios de seda sem ser fundida ao proteínas da seda, e assim, podemos facilmente extrair os casulos na pureza bom com soluções aquosas neutras 14,15. Felizmente, as estruturas de oligossacarídeos, que são críticos para a ligação com a GM-CSF, são mais semelhantes às estruturas de sGMRα humana do que aquelas produzidas por outros insetos ou leveduras. RESULTADOS: O sistema de ensaio livre de células usando sGMRα rendeu os dados com alta plasticidade e confiabilidade. GM-CSF ligação a sGMRα foi dose-dependente inibida por policlonal GM-CSF auto-anticorpos de forma semelhante ao bioensaio usando TF-1 células, indicando que o nosso novo livre de células do sistema de ensaio utilizando sGMRα é mais útil para a medição da atividade neutralizante de GM-CSF auto-anticorpos que o sistema de bioensaio utilizando TF-1 célula ou células humanas de medula óssea. CONCLUSÕES: Nós estabelecemos um ensaio livre de células quantificar a capacidade de neutralização da GM-CSF auto-anticorpos.

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A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

Nós projetamos um ensaio de receptor de células livres vinculativas, a fim de estimar a ligação de granulócitos e macrófagos fator estimulante de colônia (GM-CSF) para os receptores. Ele nos permite avaliar inibição competitiva do biotinilado GM-CSF ligação a solúvel GM-CSF receptor alfa por GM-CSF auto-anticorpos com excelente reprodutibilidade.

A célula do sistema de Ensaio grátis Estimar a capacidade de neutralização de GM-CSF recombinante usando anticorpo receptor GM-CSF Solúvel

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

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Immunology and Infection

12.6K visualizações.  Niigata University Medical and Dental Hospital. Nós projetamos um ensaio de receptor de células livres vinculativas, a fim de estimar a ligação de granulócitos e macrófagos fator estimulante de colônia (GM-CSF) para os receptores. Ele nos permite avaliar inibição competitiva do biotinilado GM-CSF ligação a solúvel GM-CSF receptor alfa por GM-CSF auto-anticorpos com excelente reprodutibilidade.