Nosso protocolo descreve a modificação genética da célula CAR-T durante sua fabricação através da tecnologia CRISPR para gerar produtos mais eficazes e menos tóxicos. Uma vantagem dessa técnica é que a produção celular CAR-T e a manipulação genética podem ocorrer tanto em uma célula com boa eficiência. Demonstrando o procedimento estarão Rosalie Sterner, uma estudante de doutorado em Doutorado, Michelle Cox, tecnóloga e estudante de pós-graduação, e Reona Sakemura, bolsista de pós-doutorado, do meu laboratório.
Depois de isolar as células T das células mononucleares de sangue periféricas colhidas, comece a esculpá-las primeiro preparando o meio de células T e, em seguida, esterilizá-lo filtrando-o através de um filtro de vácuo estéril de 0,45 micrômetro e, em seguida, com um filtro de vácuo estéril de 0,22 micrômetros. No dia da estimulação de células T ou dia zero, antes da estimulação, lave as contas CD3/CD28 colocando o volume necessário de contas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e resusus em um mililitro de TCM. Coloque o tubo em contato com um ímã por um minuto.
Em seguida, aspire o TCM e resuspend em um mililitro de TCM fresco para lavar as contas novamente e repetir para um total de três lavagens. E, finalmente, resuspense as contas em um mililitro de TCM. Depois de contar as células T, transfira as contas para as células T em uma proporção de três para uma contas para células.
Em seguida, diluir as células para uma concentração final de um milhão de células por mililitro e incubar a 37 graus Celsius, 5% de CO2 por 24 horas. Após a aquisição de uma construção CART19 em um vetor lentiviral, realize a produção lentiviral incubando primeiro plasmídeo lentiviral, vetor de embalagem, vetor envelope, reagente pré-complexante, reagente de transfecção e meio de transfecção à temperatura ambiente por 30 minutos. Realizar trabalhos lentivirais utilizando BSL2+precauções, incluindo capuzes de cultura celular, equipamentos de proteção individual e desinfecção de materiais usados com alvejante antes do descarte.
Após a incubação, adicione esses reagentes de transfecção às 293 células T que atingiram 70 a 90% de confluência e cultura das células transfeccionadas a 37 graus Celsius e 5%DE CO2. Às 24 e 48 horas após a transfecção, colheita, centrífuga, filtro e concentrado de supernante contendo vírus por ultracentrifugação e congelamento a menos 80 graus Celsius para uso futuro. No primeiro dia, resuspend suavemente células T que foram estimuladas a um milhão de células por mililitro no dia zero, a fim de quebrar as rosetas das células.
Sob as precauções BSL2+apropriadas, adicione vírus coletado fresco ou congelado às células T simuladas em uma multiplicidade de infecção de 3.0. Continue a incubar as células T transduzidas a 37 graus Celsius, 5% de CO2. Nos dias três e cinco, conte células CAR-T e adicione TCM pré-aquecido fresco à cultura para manter uma concentração celular CAR-T de um milhão de células por mililitro.
Seis dias após a simulação, remova as contas das células T transduzidas pela primeira vez colhendo e reutilizando as células. Transfira as células em tubos cônicos de 50 mililitros e coloque os tubos em um ímã por um minuto. Depois de coletar o supernanato car-t contendo células e descartar as contas, coloque as células de volta na cultura em uma concentração de um milhão de células por mililitro em um frasco de cultura.
Use uma amostra de células para citometria de fluxo para avaliar a expressão superficial dos CARs. Incubar o resto para retomar a expansão e, em seguida, colher e crio-preservar as células no oitavo dia, como descrito no manuscrito. Para interromper o fator estimulante da colônia de macrófagos granulocitos, utilize um RNA guia como descrito no manuscrito.
Incubar reagentes de transfecção à temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação, adicione-as às 293 células T que atingiram 70 a 90% de confluência e cultura das células transfeinadas a 37 graus Celsius, 5% de CO2 para produzir um lentivírus. Aos 24 e 48 horas, colhe e concentra supernasce contendo vírus por ultracentrifugação em tubos ultracentrífugas de 50 mililitros e congela a menos 80 graus Celsius para uso futuro.
Então, no primeiro dia, resususpenque suavemente as células T para quebrar as rosetas. Em um laboratório aprovado pelo BSL2+, para gerar células CAR-T, adicione lentivírus CAR19 e lentivírus CRISPR com destino a GMCSF às células T simuladas. No terceiro e quinto dia para células T editadas pela LentiCRISPR com sucesso que carregam resistência à puramicina, tratar células com dihidrocloriloreto de diomicina em uma concentração de um micrograma de puromicina por mililitro.
O sequenciamento da maré foi usado para confirmar uma redução GM-CSF em células GM-CSF knockout CART19 com uma eficiência de interrupção de aproximadamente 71% As parcelas de fluxo de manchas de superfície de células CAR-T fechadas em células cancerígenas ao vivo CD3 mostram que tanto o CART19 wild-type quanto o GM-CSF knockout CART19 com sucesso e de forma semelhante expressam o receptor de superfície CAR in vitro. Por outro lado, a coloração intracelular de GM-CSF por citometria de fluxo também fechada em células cd3-positivas ao vivo demonstra diminuição da expressão de GM-CSF nas células eliminatórias em comparação com células CART19 do tipo selvagem confirmando o sucesso funcional do nocaute. Deve-se tomar cuidado especial durante as etapas de transdução deste procedimento, pois são os mais críticos para o desenvolvimento de células CAR-T geneticamente modificadas.
A metodologia descrita pode potencialmente ser aplicada a uma variedade de genes para modificar células CAR-T via CRISPR/CAS9 para ajudar a gerar um produto menos tóxico e mais eficaz. A tecnologia CRISPR/CAS9 fornece as estratégias para direcionar diretamente o genoma das células CAR-T para projetar soluções para deficiências clínicas atuais.
