Agradecemos a Alberto Severini e Vanessa Goleski para ajudar no desenvolvimento de ensaios e comentários críticos sobre este manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Agência Canadense de Saúde Pública e do Programa de Assistência de Pesquisa Industrial (National Research Council of Canada). Apoio adicional foi obtida a partir da Universidade de Saskatchewan Fundo de Publicação.

Este método foi utilizado na pesquisa, publicada na Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009). Um diagrama esquemático representando o processo geral é apresentado na Figura 1. 1. Talão de acoplamento Este descreve os métodos a serem utilizados para o acoplamento de sondas de oligonucleotídeos esferas de poliestireno Luminex (ver Tabela 2). Volumes são adaptados ligeiramente para a avaliação de sondas de captura de novos em uma base experimental, estes volumes são indicados entre parênteses. <ol><li> Retire 1-etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimida HCl pó (EDC) de -20 ° C e dessecador aquecê-lo à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender as microesferas por sonciation em um banho de água sonicador por 20 segundos, então vórtex aproximadamente 20 segundos. </li><li> Transferir 400 mL (100 L) de microesferas de um tubo de Eppendorf (isto corresponde a 5x10 6 ou 1,25 x10 6 microesferas). Luminex sugere o uso de baixa proteína tubos de microcentrífuga de ligação (por exemplo, tubos Eppendorf LoBind Protein, número de catálogo 0030 108,094) para evitar que as contas desacoplado de degola para os tubos e interferindo com a recuperação do grânulo. Não encontramos este é um problema usando tubos de polipropileno padrão de microcentrífuga, que normalmente usam (por exemplo, número de catálogo VWR 87003-298). </li><li> Pelotização em 14.000 xg por 1 minuto. Remova e descarte o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as microesferas em 50 ul (12,5 L) de temperatura ambiente 0,1 M 2 - (N-Morfolino) etanosulfónico (MES) pH 4.5. </li><li> Prepare uma nova solução de EDC em 10 mg / ml em água. <ol><li> Prepare menos de 1 ml desta solução, pesando 50-10 mg de EDC em uma escala de análise, em seguida, adicionar água a 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Adicione 1 nmol de 5&#39;-amino oligonucleotídeo capturar C12-modificado (Tabela 2) para micro e misturar em vortex. 1 nmol é de 5 mL de 200 M oligonucleotídeos. </li><li> Adicionar 2,5 ml de solução EDC fresco para as micro e misturar em vortex por 5 segundos. </li><li> Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. </li><li> Descartar a solução EDC (passo 1.6) e preparar uma nova amostra de 10 mg / ml em água EDC como acima (passo 1.6). </li><li> Adicionar outro 2,5 mL de solução EDC fresco para as micro e vortex por 5 segundos. </li><li> Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. </li><li> Lave as contas adicionando 1 ml de 0,02% Tween 20. Vortex (opcionalmente sonicate por 20 segundos também) para voltar a suspender as contas. </li><li> Centrifugar 14000 xg 1 minuto. Remova e descarte o sobrenadante. </li><li> Lave as contas novamente, adicionando 1 ml de sulfato de sódio 0,1% dodecil (SDS). Vortex (opcionalmente sonicate por 20 segundos também) para voltar a suspender as contas. </li><li> Centrifugar 14000 xg 1 minuto. Remova e descarte o sobrenadante. </li><li> Volte a suspender as contas em 100 l (25 L) de Tris-EDTA (TE) buffer [10 mM Tris-Cl pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8,0]. </li><li> Enumerar as contas em um hemocitómetro ou contador Coulter para determinar a concentração de ações. </li><li> Prepare um Mix Master Microesfera diluindo cada grânulo para uma concentração final de 100 pérolas / mL em tampão TE. Piscina acoplada contas correspondente ao complexo desejado do ensaio (por exemplo, para um ensaio de 10-plex, mix de 10 diferentes contas acoplado a uma concentração final de 100/μl de cada talão). </li><li> Armazenar o Mix Master Microesfera a 4 ° C no escuro. A mistura pode ser armazenada por meses se mantido sob estas condições. </li></ol> 2. Chaperonin 60 universal alvo (cpn60 UT) amplicon de produção e geração de cadeias simples. <ol><li> Gerar reação em cadeia da polimerase produto (PCR) para cada amostra. Inclua o fosforotioato e set-biotina modificado 5 &#39;primer (Tabela 1). Veja a Tabela 3 para os volumes a misturar e concentrações. </li><li> Imediatamente após a PCR está completa, adicione 2 mL (20 unidades) de ex T7onuclease a cada tubo de PCR (PCR buffer será suficiente para a reação T7). Incubar a reação à temperatura ambiente (~ 22-25 ° C) por 40 minutos. </li><li> No final desta incubação, adicionar 12,5 mL de 0,5 M de etileno diamina ácido tetraacetic (EDTA) pH 8,0 e misturar. Isto dá um total de ~ 64.5μl de single-stranded produto da PCR. </li></ol> 3. Hibridação de single-stranded do produto de PCR para contas de oligonucleotídeo-coupled poliestireno. <ol><li> Pré-aquecer o instrumento a 60 ° C para manter a temperatura de hibridização durante a análise. Ligar o aquecedor plataforma usando o software do instrumento e não se esqueça de usar o bloco de aquecimento de latão que se encaixa a placa de PCR-estilo que contém a mistura hybridized talão. </li><li> Ressuspender Microesfera Mix Master (passo 1.20) com uma pipeta, dispensar uma quantidade adequada em um tubo Eppendorf, cap do tubo, e sonicate em um banho de água sonicador por 2 minutos. Como alternativa, para assegurar a coerência absoluta no talão resuspension, o master mix microesfera pode ser ressuspenso em vórtice e pipetagem, então sonicação como acima, então dispensar a quantidade desejada em um tubo Eppendorf de polipropileno. </li><li> Dispense 17 mL de single-stranded produto da PCR (passo 2.2) nos poços apropriados de um perfil de baixa de 96 poços Poço PCR placa (Tabela 2). Adicionar 33 mL de sedimento, mistura sonciated talão para cada poço. Cubra com capa de silicone (Tabela 2) e bata suavemente. </li><li> Coloque a placa no termociclador com um programa de: 95 ° C por 5 min, 60 ° C por 10 min, 60 ° C segurar, 60 ° C por 5 min, fim. Iniciar o programa. </li><li> Faça novos estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE) solução; você precisará de 25 mL por poço (fazer vários poços extra). Faça SA-PE solução diluindo estoque SA-PE (1 mg / ml) 01:50 a 20 mcg / ml com 1x cloreto de tetrametilamónio (TMAC) buffer (3 M TMAC, 0,1% Sarkosyl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 ; 4 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Quando o termociclador chega ao 60 passo segurar ° C,abrir a tampa, retire a tampa de silicone e adicione SA-PE solução diretamente a cada poço (NÃO ter a placa fora do termociclador). Recoloque a tampa do silicone, feche a tampa do termociclador e retomar o programa. </li><li> Quando o programa estiver concluído, pegar a placa para fora e rapidamente transferi-lo para a máquina BioPlex de ler. Placa deve ser lido em 10 minutos. Leia a 60 ° C; garantir que o BioPlex foi pré-aquecido a esta temperatura. Esteja certo de que a altura da sonda foi ajustado para acomodar a placa utilizada, conforme descrito no manual do usuário do instrumento utilizado. </li><li> Para talão precisas e detecção de sinal, as configurações da porta na BioPlex deve ser definida de acordo com o tipo de microesferas a ser utilizado. Esferas de poliestireno BioRad exigem uma configuração porta de 4,335-10,000 enquanto microesferas magnéticas exigem um ajuste de 5,000-25,000. Há também a opção de executar o prato usando a configuração PMT alta o que aumenta o valor do ganho repórter. Isto pode increase a intensidade dos sinais de menor entanto, é importante incluir um controle apropriado negativos como sinal de fundo também será aumentado. </li></ol> 4. Resultados representativos: Um dos nossos objetivos no desenvolvimento e implementação deste ensaio foi para torná-lo o mais simples e aerodinâmico possível. Por isso, otimizou a crítica pós-amplificação etapas, incluindo o tempo de tratamento T7 exonuclease e tempo de hibridização, a fim de desenvolver um teste que pode ser concluído em um prazo razoável. Conforme mostrado na Figura 2A, T7 tratamento do amplicon é essencial para a geração do sinal, como a maioria das sondas tinha pouco ou nenhum sinal de curto ou nenhum tratamento T7. O sinal de aumento linear até aproximadamente 40 minutos, momento em que o aumento do sinal retardado. Nenhuma degradação do sinal foi observada mesmo em 2 horas de tempo de tratamento T7, indicando que a modificação fosforotioato dos primers é altamente eficaz na prevenção target degradação vertente, tal como descrito 15. Escolhemos 40 minutos para T7 tempo de tratamento para minimizar o tempo de protocolo geral, mas é claro da Figura 2A que o tratamento T7 pode continuar por muito mais tempo. Determinou-se também o efeito do tempo de hibridização na geração de sinal (Figura 2B) e descobriu que 10 minutos era suficiente para a máxima do sinal, como nenhum novo aumento de sinal foi observada mesmo após 4 horas de hibridização. Portanto, um passo de hibridação de 10 minutos foi escolhido, novamente para minimizar o tempo de ensaio geral. Com estes resultados em mente, e com as técnicas de extração de DNA rápida como InstaGene (Bio-Rad), o ensaio geral, que inclui a extração de DNA, PCR, análise e Luminex pode ser concluído em 4-5 horas. Em uma nota de advertência, o nível de agregação das esferas de poliestireno durante uma corrida ou Luminex BioPlex pode ter um impacto importante sobre a eficiência do ensaio. O software BioPlex irá exibir o nível de agregação de talão, que ocorre quandomais de um talão é detectado no caminho de laser e resulta na exclusão do sinal de hibridização do agregado. Agregação de talão aparente também pode ser causada por qualquer partícula que não é o tamanho adequado para um cordão simples, e pode até mesmo ser causada por bolhas de ar. Em qualquer um desses eventos, o sinal do agregado talão, bolha de ar, ou partícula é descartado. Na maioria dos casos, descobrimos que a agregação de talão é mínima (Figura 3A) e do nível-alvo de 100 eventos de contagem para cada grânulo é facilmente realizável. Ocasionalmente, no entanto, as contas mostram uma moderada (Figura 3B) ou grave nível (Figura 3C) de agregação. Nestes casos, já que a maioria dos dados é descartado, o instrumento pode ter dificuldade para chegar a 100 eventos por tipo de contas e os resultados podem ser questionáveis. A etapa de sonicação (passo 3.2) é utilizado para minimizar a agregação de contas. Além disso, armazenar as contas como uma mistura diluída micro master (passo 1.20) pode ajudar. Temos notado que TMAC excluindo do hybritampão dization - adicionando-o ao diluente SA-PE vez (passo 3.5) - ajuda a minimizar a agregação de contas. Além disso, enquanto nós não testei isso, as contas mais recentes magnética disponível a partir de Luminex ou BioRad são pensados ​​para mostrar menos de uma tendência para agregar. Os resultados da aplicação de uma matriz 5 Luminex-plex segmentação G. vaginalis, A. vaginae, L. iners, L. crispatus, e L. gasseri juntamente com correspondentes Gram esfregaços vaginais corados swab são mostrados na Figura 4. Estas amostras foram tomadas a partir de um único indivíduo em momentos diversos. No tempo 0, o indivíduo foi diagnosticado com BV com base na coloração de Gram (Figura 4A) e os resultados Luminex a partir desta mesma amostra (Figura 4B) mostram que dos organismos representados na matriz, G. vaginalis foi mais prevalente, enquanto A. vaginae e L. iners também foram positivos. Nove dias depois, o indivíduo ainda era BV positivo eo signal para G. vaginalis tinha aumentado substancialmente, enquanto A. vaginae e L. iners ainda eram positivas. Importante, após esse tempo o indivíduo começou a transição para uma microbiota normal, como bacilos Gram positivos se tornou detectável nos esfregaços (Figura 4A), enquanto o sinal para G. vaginalis e diminuiu o sinal para L. iners aumentou (Figura 4B). Pela nossa definição original do BV com este método (amostras positivas para G. vaginalis e / ou A. vaginae foram considerados positivos BV) 13, esse indivíduo era BV positiva em todos os momentos, embora o Gram falhou em detectar G. vaginalis nos dois últimos pontos do tempo. Com o método descrito aqui Luminex, as tendências podem ser facilmente comparada com métodos baseados em seqüenciamento, e os resultados do ensaio Luminex normalmente corroboram manchas Gram 13 ao fornecer informações adicionais sobre a identidade organismo e abundância. <img src=&quot;/ Files/ftp_upload/3344/3344fig1.jpg&quot; alt = &quot;Figura 1&quot; /&gt; Figura 1. Diagrama esquemático do protocolo Luminex para determinar o perfil microbiota de uma amostra clínica complexa ou ambientais. O protocolo começa com DNA modelo que foi extraído da amostra de interesse. (1) Gerar produto da PCR de DNA modelo usando fio específico biotinilado, fosforotioato modificados cpn60 primers UT PCR juntamente com inalterado cpn60 UT PCR (Tabela 1), (2) Isto gera um pool de produtos PCR representando o microbiota com a biotina- fosforotioato modificação em uma fita (3); Digest o double-stranded produto de PCR com T7 exonuclease, que não pode degradar a vertente fosforotioato modificados e, portanto, gera single-stranded DNA que é modificado no terminal 5 &#39;com biotina; (4) Couple esferas de poliestireno a espécie-específicos cpn60 sondas UT - cada conta tem um endereço exclusivo espectral (indicado pela cor pérola) que is discernível pela Luminex ou Bio-Plex instrumento; (5) Combine o single-stranded produto de PCR gerados a partir da amostra de interesse para o conjunto de espécies específicas de oligonucleotídeos-coupled contas; (6) Adicionar estreptavidina-ficoeritrina conjugada que se liga a biotinilado o single-stranded produto de PCR e atua como um indicador da hibridação, (7) Determine o endereço espectral (talão de identidade) e intensidade de sinal de hibridização utilizando um Luminex ou Bio-Plex instrumento. Pelo menos 100 contas são contados para cada identidade de contas e da intensidade mediana de fluorescência (MFI) do sinal de ficoeritrina é relatada como a saída. Até 100 diferentes tipos do grânulo podem ser avaliados simultaneamente, mas um ensaio mostrando a discriminação de três tipos do grânulo é ilustrado. (8) Quando o MFI de PCR replica gerada a partir da mesma amostra é significativamente maior do que o controle negativo para um cordão de dado (unicaudal aluno t-test, p &lt;0,05), a amostra é considerada positiva para o organismo.<html><img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Otimização dos parâmetros de ensaio Luminex. Cinco sondas diferentes direcionados para anaerobius Peptostreptococcus foram usados ​​com amplicons gerados a partir de um modelo misto, composto por plasmídeos contendo o clonado cpn60 UT de 20 bactérias conhecidas para ser associado com a vagina, incluindo P. anaerobius. (A). Efeito do tempo de tratamento T7 exonuclease. O protocolo descrito acima foi seguido, mas o tempo de tratamento com exonuclease T7 foi variado antes de hibridação e da intensidade mediana de fluorescência (MFI) foi determinada para todas as sondas. (B). Efeito do tempo de hibridização. O protocolo descrito acima foi seguido com uma variedade de tempos de hibridização. Os mesmos conjuntos de sondas foram usadas com um amplicon gerado a partir do mesmo modelo como em A ea intensidade mediana de fluorescência (MFI) foi determinada para todas as sondas. &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Determinação de agregação talão usando software BioPlex. Três exemplos são dados de pistas BioPlex em que o nível de talão de agregação é (A) aceitável (5%); (B) borderline (50%), e (C) inaceitável (80%). <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Aplicação de uma matriz 5 Luminex-plex a BV diagnóstico em amostras seqüenciais retirado do mesmo indivíduo. (A). Gram slides mostrando o diagnóstico tradicionais utilizados para avaliar cada amostra de BV. (B). Aplicação de uma matriz 5 Luminex-plex preparado e executado, conforme descrito neste protocolo para as mesmas quatro amostras mostrado em (A). Alvos bacteriana cujo sinal MFI foi significativamente positiva por nossa definição (unicaudal teste t de Student, p &lt;0,05) são indicados por um asterisco (*).

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Não há conflitos de interesse declarados.

A especificidade da geração do sinal é de fundamental importância, você deve estar confiante de que o sinal observado reflecte verdadeiramente a detecção de amplicon gerado a partir desse organismo. Software, tais como PrimerPlex (Premier Biosoft) pode ajudar a projetar as sondas que hibridizam de forma eficiente, mas eles podem ou não podem cruzar-hibridizar espécies não-alvo. Quando primers universais PCR são utilizados, como descrito neste protocolo, é importante ter em mente que o amplicon gerado represe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome oligonucleotídeo </td><td> Companhia </td><td> Sequência 1 </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen, IDT, ou outros </td><td> Biotina-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> Biotina-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1O, fosforotioato-C, E, fosforotioato-G, F, fosforotioato-A; I, inosina, Y, C ou T; R, A ou G, K, T ou G, S, C ou G. </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Seqüências de oligonucleotídeos modificados para o universal cpn60 PCR. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente</td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 1-etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimida HCl (EDC) </td><td> Perfurar </td><td> 22980 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescentes esferas de poliestireno: Microplex microesferas (Luminex), ou Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad) </td><td> Luminex ou Bio-Rad </td><td> Bio-Rad: 171-506xxx onde xxx corresponde ao identificador de talão </td><td> Esferas magnéticas estão se tornando disponíveis para o acoplamento de oligonucleotídeos e podem oferecer algumas vantagens. Que não tenham sido julgados por esses autores. </td></tr><tr><td> Oligonucleotídeos de captura (5 &#39;amino C12 modificados) </td><td> Invitrogen, IDT, ou outros </td><td> vários </td><td> Grau de pureza dessalinizada é aceitável. Seqüências das sondas de captura usado para caracterizar swabs vaginal são fornecidos no manuscrito em que este protocolo é baseado em 13. </td></tr><tr><td> T7exonuclease </td><td> New England Biolabs </td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td> Estreptavidina-R-ficoeritrina (SA-PE) </td><td> Invitrogen </td><td> S-866 </td><td> Tenha o cuidado de obter alta pureza SA-PE, este número de catálogo é recomendado </td></tr><tr><td> Thermowell 96 placas bem PCR </td><td> Pescador </td><td> CS006509 </td><td> se encaixam em ambos os termociclador de 96 poços e máquina BioPlex </td></tr><tr><td> Thermowell vedação mat </td><td> Pescador </td><td> CS006555 </td><td> Pode ser re-utilizados; lavar com água e sabão, enxágüe bem e seque </td></tr><tr><td> TMAC 5M </td><td> Sigma </td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Plex ou Luminex instrumento </td><td> Bio-Rad ou Luminex </td><td> Bio-Rad: 171-000201 </td><td></td></tr><tr><td> PrimerPlex software para o projeto da sonda </td><td> Premier Biosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td> Sugerido para Luminex sonda desinal, apesar de outras plataformas de software pode ser usado </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Reagentes específicos e equipamentos. <table border="1"><tbody><tr><td> componente </td><td> mL / ensaio </td><td> ensaios μl/100 </td><td> concentração final </td></tr><tr><td> 10x PCR buffer (Invitrogen) </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 50 mM MgCl 2 (Invitrogen) </td><td> 2,5 </td><td> 250 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 1 </td><td> 100 </td><td> 0,2 mM de cada </td></tr><tr><td> H279BP, 25 mM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nM </td></tr><tr><td> H1612BP, 25 mM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> H280, 25 mM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nM </td></tr><tr><td> H1613,25 mM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> Água </td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td> Totais </td><td> 44,5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 3. Sugerida misturas de PCR com primers modificada cpn60 UT (Tabela 1). O ensaio está configurado para 5 mL de DNA modelo e 0,5 mL (2.5U) de Taq DNA polimerase (Invitrogen). Normalmente, grandes volumes são preparados (por exemplo, suficiente para 100 testes) e armazenadas a -20 ° C.

multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres

Vaginose bacteriana (BV) é uma síndrome recorrente polimicrobiana que se caracteriza por uma mudança na microbiota &quot;normal&quot; de Lactobacillus dominado a uma microbiota dominado por um número de espécies de bactérias, incluindo Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, e outros 1-3. Esta condição está associada com uma série de resultados negativos de saúde, incluindo HIV aquisição 4, e pode ser difícil de gerir clinicamente 5. Além disso, o diagnóstico de BV tem contado com o uso de manchas Gram de esfregaço de swab vaginal que são pontuados em vários critérios numéricos 6,7. Embora este diagnóstico é simples, barato e bem adequado para ambientes de recursos limitados, que podem sofrer de problemas relacionados com interpretações subjetivas e não dar um perfil detalhado da composição da microbiota vaginal 8. Recentes esforços de seqüenciamento de profundidade revelaram uma rica, diversificada microbiota vaginal comdiferenças claras entre as amostras retiradas de indivíduos que são diagnosticados com BV em comparação com aqueles indivíduos que são considerados normais 9,10, o que resultou na identificação de um número de alvos potenciais para o diagnóstico molecular da BV 11,12. Esses estudos têm fornecido uma riqueza de informação útil, mas seqüenciamento profunda ainda não é prática como um método de diagnóstico em um ambiente clínico. Recentemente, descreveu um método para rapidamente perfil da microbiota vaginal em um formato multiplex usando oligonucleotídeos-coupled partículas fluorescentes com detecção em uma plataforma Luminex 13. Este método, como o atual Gram métodos baseados, é rápido e simples, mas acrescenta a vantagem adicional de explorar os conhecimentos moleculares decorrentes de estudos de seqüenciamento no projeto da sonda. Este método, portanto, fornece uma maneira de perfil dos microorganismos mais importantes que estão presentes em um swab vaginal que podem ser usadas para diagnosticar BV, com alta especificidade e sensibilidade compared para Gram, fornecendo informações adicionais sobre a presença e abundância de espécies de uma forma semi-quantitativa e rápida. Este método multiplex é expansível bem além do alcance dos atuais ensaios de PCR quantitativo para os organismos particular, que é actualmente limitado a 5 ou 6 ensaios diferentes em uma única amostra 14. Importante, o método não se limita à detecção de bactérias em swabs vaginal e pode ser facilmente adaptado para rapidamente perfil quase qualquer comunidade microbiana de interesse. Por exemplo, temos recentemente começaram a aplicar esta metodologia para o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico para uso em estações de tratamento de águas residuais.

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Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Nós descrevemos um método multiplex para a detecção de microorganismos em uma amostra usando oligonucleotídeos-coupled partículas fluorescentes. Amplicon de todos os organismos dentro de uma amostra é hibridizada com um painel de sonda acoplada contas. Um instrumento Luminex ou Bio-Plex é usado para consultar cada grânulo para o tipo de grânulo e sinal de hibridização.

Detecção de multiplex de bactérias em amostras clínicas e Complexo Ambiental utilizando Oligonucleotídeos-coupled microesferas fluorescentes

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

multiplex-detection-bacteria-complex-clinical-environmental-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.1K visualizações.  Agriculture and Agri-Food Canada. Nós descrevemos um método multiplex para a detecção de microorganismos em uma amostra usando oligonucleotídeos-coupled partículas fluorescentes. Amplicon de todos os organismos dentro de uma amostra é hibridizada com um painel de sonda acoplada contas. Um instrumento Luminex ou Bio-Plex é usado para consultar cada grânulo para o tipo de grânulo e sinal de hibridização.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Imunologia e Infecção

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to the best of these authors' knowledge, no method has been developed to allow for the in situ visualization of the 
bacteria in histological sections.
While bacterial localization has been determined in vivo in previous studies using plate counts 3, radiometric labeled 4, 
or bioluminescent bacteria 5, most of these studies have only been performed at the gross organ level, with one exception 6. This limitation 
is of particular concern because E. ictaluri has a complex infection cycle 1,7, and it has a variety of virulence factors 8,9. 
The complex interaction of E. ictaluri with its host is similar in many respects to Salmonella typhi 10, which is in the same taxonomic family.
Here we describe a technique allowing for the detection of bacteria using indirect immuno-histochemistry using the monoclonal Ed9 antibody described by Ainsworth et al.11.
Briefly, a blocking serum is applied to paraffin embedded histological sections to prevent non-specific biding. Then, the 
sections are incubated with the primary antibody: E. ictaluri specific monoclonal antibody Ed9. Excess antibodies are rinsed away and the FitC 
labeled secondary antibodies are added. After rinsing, the sections are mounted with a fluorescent specific mounting medium. 
This allowed for the detection of E. ictaluri in situ in histological sections of channel catfish tissues.

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Here we describe a procedure allowing the labeling of Edwardsiella ictaluri in situ in histological sections from channel catfish Ictalurus punctatus using indirect immunohistochemistry with monoclonal antibodies Ed9 as a primary, and fluorescent FitC labeled antibodies as a secondary. This allowed for the detection of the bacterium using fluorescent microscopy.

Uso de fluorescentes Imuno-Química para a detecção de Edwardsiella ictaluri Em bagre do canal ( I. punctatus) Amostras

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

Determinação da atividade fagocítica de amostras de anticorpos Clínica

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

Rápida identificação de bactérias gram-negativas de Sangue Cultura Caldo Usando MALDI-TOF Espectrometria de Massa

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

A detecção in situ de células T CD4 autoreactive em Cérebro e Coração Usando principal de histocompatibilidade Dextramers classe II

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

A detecção in situ de bactérias dentro dos tecidos de parafina-encaixados Usando um marcado com Digoxina DNA Probe Segmentação 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Uma estratégia rápida para o isolamento de novos Faustoviruses de amostras ambientais Usando<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

O desenvolvimento de uma salivar Antibody Multiplex imunoensaio para medir a exposição humana a patógenos ambientais

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.