Pesquisa no laboratório dos autores é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R37-HL041026, R01-R01-HL086483 e HL056786 (SSS) e F32-HL097463 e T32-AR048523 (PB) do Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos.

1. Rato bordo, pedestal muscular, corpo e cunha solução superfusão <ol><li> Rato bordo: A bordo retangular transparente Plexiglas (6 &quot;de largura X 8&quot; X longo 3 / 16 &quot;de espessura) é feito para caber no palco do microscópio A&quot;. Bordo mouse &quot;é o lugar onde o rato anestesiado é garantido durante a preparação cirúrgica do o músculo cremaster. </li><li> Pedestal músculo: Um pedestal de borracha transparente silastic é preparado a partir Sylgard 184, que é misturado de acordo com as instruções do s · Fabricante. Um molde conveniente é a 15 mm de espessura x 50 mm de diâmetro diâmetro placa de Petri descartável. O bloco Sylgard é cortada no formato desejado com uma lâmina de barbear (ver Figura 1C).. Uma fina camada de adesivo de silicone à prova d&#39;água clara é usado para proteger o bloco Sylgard à placa de mouse. Dicas úteis: Após o vazamento do Sylgard em placa de Petri, desgaseificação em uma câmara de vácuo por uma hora remove as bolhas de ar e melhora a clareza. Seguintes desgaseificação, tempo de cura para Sylgard é encurtado, colocando o prato num forno de laboratório a 50 ° C por várias horas. </li><li> Cunha corpo e plataforma de aquecimento: Uma cunha (2 &quot;X 4&quot; X 15 °) posicionada embaixo do mouse e contra o pedestal inclina o corpo para a frente o que facilita a extensão do músculo cremaster sobre o pedestal de sua origem. Incorporação de uma plataforma de alumínio sobre a superfície fornece calor condutivo. A plataforma é aquecido por resistências conectado a uma fonte de alimentação DC (Figura 1A). Calibrar a temperatura plataforma para ~ 40 ° C mantém a temperatura do esôfago em ~ 37 ° C. Caso contrário, o calor radiante a partir de uma lâmpada é utilizada. </li><li> Pinos. Para proteger o músculo cremaster no pedestal, os pinos são preparados a partir de 0,15 milímetros pinos de insetos que foram dobrados em um &quot;L&quot;. </li><li> Solução salina fisiológica (PSS). Os preparativos estão superfused (irrigado) continuamente com bicarbonato-buffered PSS preparado em ultrapura (18,2 mohms) H 2 O. As soluções de reserva são preparadas na concentração final 20X de trabalho e esterilizadas através de um filtro M 0,2. As soluções de reserva permanecem boas por várias semanas quando armazenado a 4 ° C. Preparar sais separadamente do bicarbonato e mistura-los com a diluição no dia do experimento impede a precipitação de bicarbonato de cálcio. A solução de sal de ações é composto de (em mmol / L): 2638 NaCl, KCl 94, 40 MgS0 4, 23,4 CaCl 2. O bicarbonato de ações é de 360 NaHCO 3. No dia de um experimento, soluções respectivas são levados a um volume final (normalmente 2 L para um dado experimento) em um balão volumétrico e colocado em banho-maria a ~ 37 ° C. Equilibrar o PSS com 5% de CO 2 / N 2 95% para ~ 15 minutos usando um dispersor de gás ajusta o pH para ~ 7,4 e evita a precipitação. O PSS é borbulhado continuamente com 5% CO 2 / N 2 95% ao longo experimentos. A composição solução final de trabalho (em mmol / L) é: 132 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgS0 4, 2 CaCl 2, 18 NaHCO 3. </li></ol> 2. Anestesia e preparação para a cirurgia <ol><li> Após a aprovação do Animal Care Institucional e Comitê de Uso, camundongos machos, pelo menos, 12 semanas de idade são usados. O rato é anestesiados com pentobarbital sódico (60 mg / kg) via injeção intraperitoneal (ip). Um tubo de restrição se mostrou útil para proteger o mouse durante a injeção inicial. Ao longo de procedimentos cirúrgicos e protocolos experimentais, a anestesia é mantida por suplementos (10-20% da injeção inicial, ip), conforme necessário (a cada 30-60 minutos, indicado pela retirada de resposta aos pés ou beliscar a cauda). Dica: Diluir o pentobarbital 10 mg / ml em solução salina estéril antes da injeção reduz a possibilidade de overdose. </li><li> Anestesia compromete regulação da temperatura para que o mouse deve ser mantido quente imediatamente após a primeira injeção. Colocar o mouse em um portador de metal (alumínio cesta ventilado) em cima de uma placa de aquecimento (calibrado para ~ 37 ° C) funciona bem. Alternativamente, uma lâmpada de calor pode ser usado tendo o cuidado de posicioná-lo a uma distância adequada do mouse. O mouse deve ser monitorada a cada 5-10 minutos até que o nível adequado de anestesia é alcançado (falta de retirada aos pés ou beliscar a cauda). A dose suplementar pode ser necessária após 15-20 minutos. É melhor ser paciente e proceder com cautela para evitar overdose, especialmente com animais obesos ou idosos. </li><li> O cabelo é removido da parte inferior do abdome, costas, pernas e escroto com cuidado barbear respectivas regiões. Atenção especial deve ser tomado para evitar o trauma do escroto e dos testículos, que de outra forma prejudicar o músculo cremaster. Remover cabelo solto com um algodão embebido em álcool fresco. </li><li> Se a bexiga está cheia ele vai se sentir como uma uva pequena através da parede abdominal. Esvaziar a bexiga com uma leve pressão para evitar que o rato de urinar na preparação cremaster durante as experiências. A Kimwipe é uma esponja efeito a coletat urina. </li><li> Posicione o mouse em suas costas, deitado sobre a cunha com as pernas straddling o pedestal. Um fio de seda (4-0 ou 5-0) ligada a cada pé fornece uma corda para segurar o mouse com a sua virilha contra o pedestal. Um pedaço de fita colocada frouxamente no peito e preso à cunha mantém a posição do corpo em geral. Procedimentos cirúrgicos são realizados durante a visualização através de um estereomicroscópio com uma tesoura de microdissecção e pinças anguladas. </li></ol> 3. Preparação cirúrgica do músculo cremaster aberto <ol><li> Um pino é colocado através do ápice do saco escrotal (ou o lado esquerdo ou direito) e fixado no pedestal para colocar a tensão na pele. Superfusão com ESP (34-35 ° C) é iniciado sobre o campo cirúrgico e mantida durante toda a dissecção para manter o tecido exposto quente e úmido. Um pavio (feito de Kimwipe) posicionados com uma ponta ao lado do saco escrotal e no próximo demais para uma linha de vácuo remove o PSS efluentes. Um cordão de selante de silicone adere à placa de Plexiglas e completamente circundando a cunha e pedestal serve como &quot;fosso&quot; para coletar qualquer PSS que não é aspirado, servindo como uma precaução eficaz para evitar vazamento de PSS para o microscópio. </li><li> É feita uma incisão ao longo da superfície ventral do saco escrotal. Se o testículo foi recolhido pelo músculo cremaster na cavidade abdominal, pressão suave sobre o abdome inferior direciona o testículo no saco. A superfície do músculo cremaster cobre o testículo deve ser identificado no momento. Tecido conjuntivo entre a pele escrotal eo músculo cremaster é cuidadosamente removida para liberar o músculo cremaster do tecido circundante. </li><li> A pele escrotal é suavemente recolhido por trás da borda proximal do pedestal e protegido em cada lado com um alfinete. A superfície exterior da superfície do músculo cremaster é, então, limpa de tecido conjuntivo. Superfusão contínua durante hidratos dissecção do tecido conjuntivo, facilitando a visibilidade e remoção. </li><li> Um pino através do ápice do músculo cremaster é usado para colocá-la sob tensão longitudinal. Uma incisão longitudinal é feita através da superfície ventral do músculo com grande cuidado para minimizar a interrupção do suprimento vascular. Dinâmica do fluxo de sangue perto da periferia da preparação são alteradas pelo presente 14 dano tecidual. Portanto, para minimizar esses efeitos sobre a coleta de dados, os vasos sanguíneos perto do centro da preparação são usados ​​para geração de imagens e estudos fisiológicos. </li><li> O músculo cremaster está ligado por um ligamento fino para o epidídimo debaixo do testículo. Refletindo o testículo de um lado expõe esse ligamento, que é cuidadosamente separado do epidídimo. Próximo ao ápice do músculo cremaster é pequena artéria e veia que conectá-lo ao epidídimo. Oclusão desses vasos entre fórceps e separá-las minimiza o sangramento. O testículo, epidídimo, artéria e veia testicular são ligadas proximalmente (4-0 ou 5-0 fio de seda), cortada e descartada (orquiectomia), juntamente com a almofada de gordura associado inguinal. Alternativamente, o testículo pode ser empurrou de volta para a cavidade abdominal e retidos com um pedaço de algodão ou Kimwipe. A orquiectomia serve para evitar possíveis trauma para o tecido ao empurrar os testículos de volta para a cavidade abdominal. Não encontramos diferenças notáveis ​​na qualidade da preparação microcirculação cremaster (ver secção 3.8) usando o procedimento 7,15. </li><li> A superfície externa do músculo cremaster é inocentado de remanescentes do tecido conjuntivo e depois se espalhou radialmente sobre a superfície do pedestal. As bordas são fixados com pinos (ver secção 1.4) em 5-6 lugares para criar uma folha plana de músculo estriado com microcirculação intacta. </li><li> A preparação pronta é transferida para o estágio de um microscópio intravital, superfused continuamente (3-5 ml / min, 34 ° C) e equilibrado por 30 minutos. </li><li> Integridade da preparação cremaster é avaliada de acordo com vários critérios. Espontânea tônus ​​vasomotor com trauma cirúrgico mínimo é indicado pelo fluxo rápido nas arteríolas e falta de leucócitos aderentes em vênulas. O índice mais sensível de uma preparação adequada é a constrição das arteríolas para elevar o teor de oxigênio superfusão solução por 5-10 minutos. Isto é feito através de equilíbrio com 21% O 2 (vs. 5% O 2; ver Seção 1.5, todos com 5% de CO 2, o balanço N 2). A presença de leucócitos nas arteríolas, a ausência de células vermelhas do sangue que flui através de vasos capilares, e / ou leucócitos acumulando em vênulas e tecido circundante são sinais de dano tecidual e inflamação. </li></ol> 4. Imagem intravital da microcirculação do músculo cremaster <ol><li> Intravital imagem é realizada em um microscópio personalizado com base em uma plataforma Zoom Olympus MVX10 Stereo. O corpo do microscópio MVX10é montado em um híbrido MVX10 estar equipado com transiluminação (lâmpada halógena) para campo claro de imagem (Köhler) e com epi-iluminação (lâmpada de mercúrio) para imagens de fluorescência. Usando epi-iluminação, GCaMP2 está animado com nm 472/30 com emissão coletadas em nm 520/35. Imagens são adquiridas através de um PLAPO MV 2XC lente (abertura numérica = 0,50; Olympus) usando um XR/Mega-10 intensificou câmera digital (Stanford Photonics, Inc.; SPI), através de Piper Controle Software (SPI) em um computador pessoal. Com este sistema, o campo observado de visão (FOV) pode variar de 553 mM mM X 442 a 22 mm X 18 mm. </li><li> Após a conclusão de experimentos com imagens intravital, o mouse é anestesiado sacrificados com overdose de pentobarbital seguido por deslocamento cervical. </li></ol> 5. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura bordo do rato 1. Intravital para geração de imagens da preparação cremaster mouse. A) Corpo cunha com plataforma de alumínio (isolados com plástico amarelo) visto de baixo. Resistências de aquecimento garantido ao lado de baixo da plataforma de fornecer calor conduzida. B) A plataforma de aquecimento repousa sobre uma cunha de plástico. C) A cunha corpo é colocado em uma placa de Plexiglas para cirurgia e posterior transferência para o palco do microscópio intravital. Pedestal Sylgard é indicado com a seta vermelha. Um cordão de silicone à prova d&#39;água envolve toda a preparação para conter qualquer solução que podem vazar durante o procedimento intravital, impedindo que gotejava sobre o microscópio. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Microscópio MacroZoom personalizado para campo amplo de imagem. A) MVX10 corpo do microscópio (Olympus) com câmera XR/Mega-10 ICCD (Stanford Photonics) montado na porta trinocular. B) ver Close-up do corpo do microscópio. (A) ampliar o controle (0,63 a 6,3 vezes); (b) roda de filtros, (c) Imagem do dobrador (NA = 0,50 com ampliação de 25X óptico). C) condensador Substage para brightfield iluminação (Köhler) (Condensador NA = 0,55 Distância, Trabalho = 27 mm). <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Completed do mouse preparação cremaster. Rato anestesiado em decúbito dorsal na plataforma de alumínio revestido de plástico quentes (amarelo). Posição do corpo é presa com fita adesiva. O músculo cremaster se espalha radialmente sobre o pedestal de borracha transparente silastic e preso nas bordas. Superfusão solução é introduzida na extremidade proximal por meio de um gotejador de plástico (seta branca). A linha de vácuo (seta branca) remove a solução através de um pavio Kimwipe. Duas micropipetas são mostrados posicionados com as pontas do tecido. Um eletrodo de referência (fio de prata) é fixado na borda inferior do músculo cremaster. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Ilustrando a gama de ampliação para a visualização de redes arteriolar expressar GCaMP2 no endotélio. A) fluorescentes e B) imagem de campo claro tomada em uma ampliação ótica de 3,2 x para uma ampliação total = 42X no monitor de vídeo. [Campo de visão (FOV) = 4.375 x 3.470 M]. Barra de escala = 500 mm. Trabalhando com este aumento, facilita a colocação de micropipetas nos locais desejados. C) fluorescentes e D) imagem de campo claro tomadas na ampliação ótica de 6.4X para ampliação total = 83X (FOV = 2.200 x 1.759 mm). Barra de escala = 200 mM. E) fluorescentes e F) imagem de campo claro tomadas na ampliação ótica de 12,6 vezes para ampliação total = 165X (FOV = 1.100 x 885 mm). Barra de escala = 100 mm. G) Com doubler imagem ampliação, óptico = 25.2X. Barra de escala = 50 mm.

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	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. 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C., &amp;amp, S. e. g. a. l., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle.">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li><li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo.">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li><li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. 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Todos os procedimentos e protocolos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use da Universidade de Missouri e realizada de acordo com o Guia de Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Produção deste vídeo-artigo foi patrocinado pela Stanford Photonics.

Aqui, descrevemos a preparação do músculo cremaster em aberto o mouse para observar a microcirculação in vivo. Este procedimento é modelado após o preparo cremaster &quot;aberto&quot; descrita pela primeira vez no rato 4. Com a prática todo o procedimento cirúrgico pode ser concluída em menos de uma hora. A versatilidade desta preparação permite uma variedade de manipulações experimentais e é facilmente adaptada para hamsters, bem como ratos, permitindo uma variedade de modelos experimentais para ser estudado de maneira similar. A preparação é limitada a animais machos e as medições devem ser feitas para o centro do tecido, evitando regiões danificadas perto das bordas do músculo 14. Também deve-se reconhecer que, enquanto as distribuições de pressão e fluxo são alteradas quando os vasos comunicantes do músculo cremaster são cortadas 16, microvasos permanecer ágil e adequado para a coleta de dados reproduzíveis. A principal limitação para visualizar a microcirculação do músculo cremaster é o acúmulo de tecido conjuntivo como animais maduros e aumentam de tamanho, principalmente em ratos, mas também em hamsters. Além disso, como os animais engordam, torna-se mais difícil de controlar porque a anestesia pentobarbital é lipofílica e pode ser absorvido no tecido adiposo. A melhor maneira de proceder é de ser paciente, garantindo que a temperatura o ° s animais corporal é mantido em ~ 37 ° C, enquanto tecido exposto é irrigado continuamente com PSS.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente ou dispositivo </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Pescador </td><td> S642-212 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de Potássio </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfato de Magnésio </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio </td><td> Sigma </td><td> C1016 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio </td><td> Pescador </td><td> S233 </td><td></td></tr><tr><td> Solução de sódio Nembutal </td><td> Lundbeck </td><td> NDC 67386-501-55 </td><td> Também referida como pentobarbital sódico </td></tr><tr><td> Controlador de temperatura </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td> Suplente: ajustável Alimentação 12V DC </td></tr><tr><td> Série 20 kit aquecedor plataforma RH-2 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0274 </td><td> Requer custom-built placa de alumínio </td></tr><tr><td> Mega-10 Camera </td><td> Stanford Photonics </td><td> XR/Mega-10 </td><td></td></tr><tr><td> MVX10 </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MV PLAPO 2XC lente </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MVX10 ficar híbrido </td><td> Leeds </td><td> LBX-Hybrid </td><td></td></tr><tr><td> Piper Controle de Software </td><td> Stanford Photonics </td><td></td><td> Programa para Mega-câmera de 10 </td></tr><tr><td> Microscópio estéreo </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> Selante de silicone à prova d&#39;água (Clear) </td><td> General Electric </td><td> 47.970-72.643-LW5000 </td><td> Outros selantes de silicone claro também trabalhar </td></tr><tr><td> 60 x 15 milímetros Petri Dish </td><td> Pescador </td><td> 08-757-13A </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td><td></td></tr><tr><td> Tesoura microdissecção </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pinça Dumont </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> # 5 / 45 </td><td></td></tr><tr><td> GP Millipore Express Plus Membrana </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td> Insect Pinos Minutiens </td><td> Austerlitz </td><td> Tamanho M 0,15 milímetros </td><td></td></tr><tr><td> Trimmer Pet Compact </td><td> Wahl Clipper Corp </td><td> Modelo 9966 </td><td> Limpo após cada utilização </td></tr></tbody></table>

the mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation

Todo o corpo, a manutenção da homeostase requer o fornecimento constante de oxigênio e nutrientes concomitante com a remoção de subprodutos metabólicos. Este equilíbrio é conseguido pelo movimento do sangue através da microcirculação, que engloba o menor ramos do suprimento vascular em todos os tecidos e órgãos. Arteríolas ramo das artérias, formando redes que controlam a distribuição e magnitude de sangue oxigenado flui para o grande número de capilares intimamente associados às células do parênquima. Capilares fornecem uma grande superfície para a troca de difusão entre as células do tecido e o fornecimento de sangue. Vênulas coletar efluentes capilar e convergem como o retorno do sangue oxigenado para o coração. Para observar esses processos em tempo real requer uma abordagem experimental para visualizar e manipular a microcirculação vida. O músculo cremaster de ratos foi usado primeiramente como um modelo para estudar a inflamação com histologia e microscopia eletrônica de 1,2 post mortem. O primeiro relatório vivo do músculo cremaster de ratos expostos intactos investigado microvascular respostas a drogas vasoativas usando luz refletida 3. No entanto curvatura do músculo e da falta de iluminação focada para limitar a utilidade desta preparação. O grande avanço implicou a abertura do músculo, destacando-o do testículo e espalhando-radialmente como uma folha de apartamento em transiluminador sob um microscópio composto 4. Enquanto demonstrado ser uma preparação valiosa para estudar a fisiologia da microcirculação em ratos 5 e 6 hamsters, o músculo cremaster em camundongos 7 tem-se revelado particularmente úteis em dissecar as vias celulares envolvidos na regulação da função microvascular 8-11 e imagens em tempo real da intercelular sinalização 12. O músculo cremaster é derivada da musculatura abdominal oblíquo interno e transverso como os testículos descem pelo canal inguinal 13. Ela serve para dar suporte (em grego: cremaster suspender =) e manter a temperatura dos testículos. Como descrito aqui, o músculo cremaster é preparado como uma folha fina apartamento em excelente resolução óptica. Com o mouse mantido a uma temperatura do corpo estável e plano de anestesia, preparo cirúrgico envolve a desinserção do músculo do tecido circundante e os testículos, espalhando-a sobre pedestal transparente de borracha silastic e assegurar as bordas com alfinetes de insetos, enquanto irrigando-lo continuamente com solução salina fisiológica . O presente protocolo utiliza camundongos transgênicos expressando GCaMP2 arteriolar em células endoteliais. GCaMP2 é geneticamente codificado fluorescente de cálcio 12 molécula de indicador. Widefield de imagem e uma câmera do dispositivo de carga acoplado intensificou-enable estudo in vivo de sinalização de cálcio no endotélio arteriolar.

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The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

A preparação do tecido é descrito para visualização e manipulação experimental da microcirculação vida. Anestesiados em camundongos machos, o fino, altamente vascularizado do músculo cremaster está preparado para microscopia intravital para estudar redes microvasculares incluindo arteríolas, vênulas e capilares. Esta preparação é facilmente adaptada para ratos e hamsters.

O Mouse Preparação Muscle Cremaster for Imaging intravital da Microcirculação

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

32.1K visualizações.  University of Missouri. A preparação do tecido é descrito para visualização e manipulação experimental da microcirculação vida. Anestesiados em camundongos machos, o fino, altamente vascularizado do músculo cremaster está preparado para microscopia intravital para estudar redes microvasculares incluindo arteríolas, vênulas e capilares. Esta preparação é facilmente adaptada para ratos e hamsters.

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Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

Microiontophoresis e Micromanipulação para imagens de fluorescência intravital da Microcirculação

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Biologia

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Microscopia intravital da Microcirculação no músculo Rato Cremaster de Análise de Migração Stem Peripheral celular

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Isolamento de Murino vasculares coronários células musculares lisas

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Visualização e quantificação da Camada de livre-Cell nas arteríolas do músculo Rat Cremaster

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Um Protocolo Automatizado Rápido para Muscle Fiber Análise População em músculo secções transversais Usando Cadeia miosina pesada Imunohistoquímica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Um método versátil para a montagem de Arabidopsis deixa para Intravital imagem de lapso de tempo

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Preparação de amostras para perfil metabólico usando imagem de espectrometria de massa MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Um ensaio de quimiotaxis melhorado para a identificação rápida de quimioattractants rizobacterianos em Exudates radiculares

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...