Pesquisa no laboratório dos autores é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R37-HL041026, R01-R01-HL086483 e HL056786 (SSS) e F32-HL097463 e T32-AR048523 (PB) do Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos.

1. Animal Care e Uso Após análise e aprovação do Animal Care Institucional e Comitê Use, camundongos machos, pelo menos, 12 semanas de idade são usados. Um rato é anestesiados com pentobarbital sódico (60 mg / kg) via injeção intraperitoneal (ip). Ao longo de procedimentos cirúrgicos e protocolos experimentais, a anestesia é mantida por suplementos (10-20% da injeção inicial, ip), conforme necessário (a cada 30-60 minutos, indicado pela retirada de resposta aos pés ou beliscar a cauda). Após a conclusão do procedimento experimental o rato é uma overdose com pentobarbital (ip) e submetidos à eutanásia por deslocamento cervical. 2. Micropipetas e Microiontophoresis <ol><li> Micropipetas Microiontophoresis (diâmetro da ponta interna, ~ 1 mm) são preparados a partir de tubos de vidro de borosilicato capilar utilizando um extrator de pipeta horizontal. Nossa tem um cone ~ 5 mm para a rigidez; tapers já são mais flexíveis. </li><li> Micropipetas são backfilled com 1M ACh (Figura 1A-C) dissolvida em 18,2 mohms água. Para aterro, um tubo microcapilar está conectado a 0,2 mM de filtro acoplado a uma seringa contendo o agonista de interesse (Figura 1). Estes podem ser facilmente fabricado (abaixo) ou adquiridos de fornecedores comerciais. O tubo microcapilar é inserido no back-end da solução micropipeta e ACh é entregue dentro do lúmen ao retirar o tubo microcapilar como a micropipeta enche. Segurando a micropipeta com sua ponta apontando para baixo, as bolhas de ar são removidas suavemente flicking a micropipeta. </li><li> A micropipeta é garantido em um suporte montado em um micromanipulador (Figura 2). O titular tem um fio de prata que liga o ACh solução dentro do micropipeta para um pino externo, que por sua vez está ligado ao terminal positivo de um programador microiontophoresis. Um fio de prata segundo garantiu à margem da preparação do tecido é conectado ao terminal negativo para completar o circuito com a ponta da micropipeta é avançada na solução salina fisiológica sobre a preparação. </li><li> Uma corrente de retenção é aplicado para evitar a vasodilatação (ou resposta fluorescente) quando a ponta da micropipeta é posicionado adjacente à parede arteriolar. Retenção atuais variam de acordo com o tamanho da ponta micropipeta (diâmetro interno = 1 mm) e concentração agonista, mas é altamente reprodutível para os parâmetros definidos (usamos ~ 200 nA para 1M ACh, uma dica mm). A corrente de retenção cessa coincidente com a entrega de ejeção atual via o gatilho eletrônico (Figura Suplementar 1) sincronizado com o início da aquisição da imagem. </li></ol> 3. Micromanipulação <ol><li> Uma plataforma personalizada para um estágio do microscópio XY foi fabricado em aço inoxidável ferromagnéticos. Dimensões da plataforma (1 / 8 &quot;X 12&quot; X 13 &quot;) permitem espaço suficiente para micromanipuladores posição em torno da preparação experimental como micromanipuladores desejado (Figura 2A). Garantidos para bases magnética (Figura 2B) permitir o posicionamento como ditado pela preparação. Estes são colocado diretamente sobre a plataforma feita em função da preparação para micropipetas posicionamento em sites de interesse (Figura 2C). </li></ol> 4. Resultados representante <ol><li> Com a ponta micropipeta posicionado adjacente a uma arteríola, não há resposta de fluorescência para ACh (mantendo corrente do que ajustados para evitar vazamentos ACh). Abaixo de um limiar de estímulo não houve efeito. No entanto, como a intensidade do estímulo aumentava, fluorescência de cálcio das células endoteliais aumentou em distâncias progressivamente maior ao longo da arteríola, assim como a intensidade de fluorescência no local de estimulação (Figura 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Método para Backfilling Pipettes Microiontophoresis. A) Um tubo microcapilar (seta verde) é fixado em um encaixe de compressão (seta azul) conectada a um filtro de 0,2 mM (seta roxa), que é então anexado a uma seringa cheia de 1M ACh. B) O tubo microcapilar é alimentado no pipeta microiontophoresis através do back-end e solução é deslocado para preencher o lúmen do micropipeta. C) Uma vez que a pipeta está cheia, segure a ponta para baixo e suavemente dê pequenos toques acima do cone para remover as bolhas (seta preta). <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Plataforma personalizado para Colocação micromanipulador. .. A) A plataforma de aço inoxidável ferromagnéticos foi colocado sobre uma base de microscópio personalizado MVX10 contendo um estágio de translação XY B) Circular bases magnética afixada na parte inferior do compacto de 3 eixos micromanipuladores C) micromanipuladores posicionado em torno da preparação experimental (Ver protocolo associado: JOVE ID # 2874) para estudar locais específicos de interesse. Oir tamanho compacto e versatilidade permitem micropipetas múltiplos sejam usados ​​simultaneamente. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Fluorescência de cálcio nas arteríolas. Fluorescência de cálcio das células endoteliais que revestem a parede arteriolar aumentou com a intensidade do estímulo. Os 3 primeiros painéis mostrado imagens de fluorescência para as respostas A) 250 nA, B) 500 nA e C) 1000 ejeção nA de corrente (todas as 500 ms duração do pulso). A distância a que fluorescence de cálcio das células endoteliais aumento é indicado por colchetes no AC (~ 130, 270 e 400 m, respectivamente). A linha de referência em todo o arteríola em cada painel indica onde as respostas de fluorescência (F / Fo) para ACh foram registrados no local da estimulação. D) As gravações de F / Fo versus tempo para estímulos aumentando ACh. Como de ejeção corrente aumentou, F / Fo aumentou em amplitude e duração. Note-se que 100 nA estímulo foi abaixo do limite e não teve efeito. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900sup1.jpg" alt="Figura complementar 1" /> Figura suplementares 1. Diagrama de circuito para acionar eletrônico. Este circuito é conectado com uma porta paralela de um computador pessoal. Quando ativado ele fornece uma constante TTL pulso de 5V. O chip 7805 é um regulador de tensão 5V conectado a um adaptador de 9-12V DC (uma bateria de tensão adequada é bom). Saída do 7805 fornece energia ao Switch Quad bilaterais e à saída do circuito. De entrada através do resistor de 1K é a partir do computador.

<ol>
	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Observation+of+Skeletal+Muscle+Blood+Vessels+(Rat+Cremaster).">Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster).</a> J. Physiol. 172, 123-137 (1964).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. 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J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles.">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li><li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+importance+of+the+endothelial+K++channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction.">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li><li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li><li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+among+arteriolar,+regional,+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle.">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+Role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li><li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels.">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li></ol>

Todos os procedimentos e protocolos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use da Universidade de Missouri e realizada de acordo com o Guia de Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Produção deste artigo foi patrocinado pela Stanford Photonics.

O protocolo aqui descrito demonstra métodos para preparação e execução de micropipetas para microiontophoresis. Entrega de acetilcolina é usado para ilustrar a sinalização de cálcio vasodilatação dependente do endotélio subjacente nas arteríolas do rato anestesiado. Nossos resultados mostram que a distância a que ACh aumenta célula endotelial aumenta a fluorescência de cálcio com a intensidade de ejeção atual da micropipeta microiontophoresis (Figura 3). A falta de aumento de fluorescência em condições de repouso indica fuga desprezível de ACh da micropipeta. A falta de resposta a 100 nA intensidade do estímulo (Figura 3, legenda) mostra que uma intensidade de limiar de estimulação é necessária para o cálcio das células endoteliais a aumentar. Estas técnicas podem ser facilmente adaptadas para outros agentes vasoativos e preparações de tecido. Considerações de ordem prática: Ao trabalhar com microiontophoresis para estudar a reatividade arteriolar, várias coisas devem ser reconhecidos. Embora tenha sido difícil para determinar a concentração real de agonista entregue, estímulo-resposta curvas são reproduzíveis dentro e entre as preparações. Estes podem ser realizados mantendo a duração de pulso constante (por exemplo, 500 ms) e variando a ejeção de corrente (por exemplo, 250, 500 e 1000 nA; Figura 3). Alternativamente, de ejeção atual pode ser mantida constante (por exemplo, a 500 nA) e duração de pulso variável (por exemplo, 250, 500 e 1000 ms). Para uma referência para as ações de um agonista de concentração definida, a preparação pode ser superfused com a solução adequada 5. Porque a força motriz para a ejeção de soluto é o movimento de carga elétrica, o agente a ser entregue deve carregar uma carga líquida a ser deslocados da micropipeta. Para garantir que o agente de interesse é o portador de carga primária, é dissolvido em concentração elevada (por exemplo, 1 M de ACh) para minimizar electro-osmose. Quando isso requer manipulação do pH da solução de enchimento micropipeta, comandos do veículo são obrigados a verificar a existência de efeitos não-específicos. Controles apropriados devem ser realizados para a passagem de corrente sozinho (por exemplo, usando micropipetas preenchido com solução salina isotônica). A distância efetiva de difusão do agente de seu local de libertação deve ser esclarecida e é mais prontamente determinada empiricamente pelo desaparecimento de uma resposta fisiológica (por exemplo, vasodilatação, ou um aumento de cálcio intracelular em cima de ejeção de ACh) como a micropipeta é posicionado no definidas distâncias do site de destino. Na prática, a distância de difusão efetivo é muito influenciada pela forma como a ponta da micropipeta é posicionado no tecido, por exemplo, se a ponta pressionado para baixo no tecido e sua ponta é ocluída, do que de ejeção é prejudicada. Tecido conectivo excessiva é particularmente problemático e deve ser removido da superfície do tecido durante a preparação cirúrgica. Atenção deve ser dada à possibilidade de esgotar a ponta do agente designado. Este é minimizado usando pulsos relativamente curto (por exemplo, ≤ s 1). Com correntes sustentada (por exemplo, alguns segundos), o agonista pode ser expulso da ponta mais rapidamente do que ele pode ser substituído por difusão a partir da solução a granel o preenchimento do micropipeta. Porque o volume insignificante é deslocado com microiontophoresis, se alguém está tentando mudar o meio local iônicos (por exemplo, para entregar um K despolarizantes estímulo +), isso não pode ser efetivamente realizado com microiontophoresis mas é facilmente alcançada com ejeção pressão de fluido em massa tendo o desejado composição. Para a estimulação local de uma arteríola, dicas micropipeta com diâmetros internos de 2-3 mM trabalhar bem com a pressão de ejeção 4-5 psi (28-35 kPa) e duração do pulso (por exemplo, 1 segundo) controlada com uma válvula solenóide 10. Se a entrega sustentada de um agente de uma micropipeta em um microvascular é necessária, de ejeção pressão é preferível usar micropipetas de diâmetro da ponta interna adequada (por exemplo, ~ 10 mm) 11,12. Uma coluna hidrostática de altura conhecida com uma válvula torneira fornece um barato, bem definidas on / off carga de pressão constante. Taxas de fluxo são determinados pelo diâmetro interno da ponta da pipeta ea pressão de condução. Como sempre, os controles do veículo são essenciais para excluir ações inespecíficas de ejeção de pressão.

<table><tbody><tr><td> Material Usado </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Tubos de vidro de borosilicato capilar </td><td> Warner Instruments </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> Horizontal Pipetar Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> modelo P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de acetilcolina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6625 </td><td></td></tr><tr><td> adaptador para Luer hub </td><td> Martech </td><td> AC1343 </td><td> Para garantir tubulação microcapilar </td></tr><tr><td> 0,2 m Nylon Titan filtro </td><td> Dom Sri </td><td> 42204-NN </td><td> Volume de retenção baixa para minimizar a perda </td></tr><tr><td> Seringa de 5 ml </td><td> Becton-Dickinson Co. </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td> Titular da pipeta </td><td> Warner Instruments </td><td> E45W-M12VH </td><td></td></tr><tr><td> Fio de prata </td><td> Warner Instruments </td><td> AG10W </td><td> 0,25 milímetros de diâmetro </td></tr><tr><td> 3 eixos micromanipulador </td><td> Siskiyou design Instruments </td><td> DT3-100, MXB, MXC, MGB / 8 </td><td> Componentes para manipulador, como mostrado </td></tr><tr><td> programador microiontophoresis atual </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> Modelo 260 </td><td></td></tr><tr><td> dispositivo de disparo </td><td> Personalizado </td><td> personalizado </td><td> circuito fornecido em Suppl. Figura 1 </td></tr><tr><td> chapa de aço inoxidável </td><td> McMaster-Carr </td><td> 1 / 8 &quot;X 12&quot; X 12 &quot; </td><td> Acordo com o projeto </td></tr><tr><td> Intensificou Câmera Digital </td><td> Stanford Photonics Inc </td><td> XR/Mega-10 </td><td> Integrado com software de Controle Piper </td></tr></tbody></table>

microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation

Microiontophoresis implica passagem de corrente por meio de uma micropipeta ponta para proporcionar um soluto em um local designado dentro de uma preparação experimental. Microiontophoresis pode simular uma transmissão sináptica através da apresentação de neurotransmissores e neuropeptídeos em neurônios reproducibly 2. Volume negligenciável (líquido) de deslocamento evita distúrbio mecânico para a preparação experimental. Adaptar essas técnicas para a microcirculação 3 permitiu mecanismos de vasodilatação e vasoconstrição a ser estudada em nível microscópico in vivo 4,5. Uma das principais vantagens do parto localizada como está permitindo respostas vasomotor a ser estudado em locais definidos dentro de uma rede microvascular sem evocar mudanças sistêmicas ou reflexa da pressão arterial e fluxo sanguíneo do tecido, revelando assim as propriedades intrínsecas de microvasos. Uma limitação do microiontophoresis é que a concentração precisa de agente entregue no local de interesse é difícil verificar a 6. No entanto, o seu lançamento a partir da ponta micropipeta é proporcional à intensidade e duração da ejeção do atual 2,7, de modo que reprodutíveis relações estímulo-resposta pode ser facilmente determinada em determinadas condições experimentais (descritas abaixo). Fatores adicionais que afetam a entrega microiontophoretic incluem concentração de soluto e sua ionização em solução. O diâmetro interno da ponta da micropipeta deve ser ~ 1 mm ou menos para minimizar o &#39;vazamento&#39; de difusão, que pode ser combatido com uma corrente de retenção. Assim, uma corrente (positiva) para fora é usada para ejetar um cátion e uma corrente negativa, utilizado para retê-lo dentro da micropipeta. Fabricação de micropipetas é facilitada com puxadores sofisticados eletrônicos 8. Micropipetas são extraídos de tubos capilares de vidro contendo um filamento que a solução &quot;mechas&quot; na ponta da micropipeta quando cheio de back-end (&quot;preenchidos&quot;). Isto é feito através da inserção de um tubo microcapilar conectado a uma seringa contendo a solução de interesse e solução de ejetar o para dentro do lúmen da micropipeta. Micromanipuladores permitir a colocação desejada de micropipetas dentro da preparação experimental. Micromanipuladores montado em uma base móvel pode ser posicionado em torno da preparação de acordo com a topografia das redes microvasculares (desenvolvido abaixo). O presente protocolo demonstra microiontophoresis de acetilcolina (ACh + Cl -) em uma arteríola da preparação do músculo cremaster de rato (Veja associados protocolo: JOVE ID # 2874) para produzir vasodilatação dependente do endotélio. Entrega estímulo é sincronizada com a aquisição de imagens digitalizadas usando um disparador eletrônico. O uso de BAC-CX40 GCaMP2 ratos transgênicos 9 permite a visualização das respostas de cálcio intracelular subjacente vasodilatação arteriolar em células endoteliais na microcirculação vida.

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Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis implica movimento de íons de uma micropipeta, em resposta a uma diferença de potencial elétrico entre o interior eo exterior da micropipeta. Moléculas biologicamente ativas são, assim, entregue em proporção à corrente elétrica. Nós ilustramos microiontophoresis acetilcolina em conjunto com micromanipulação para estudar vasodilatação dependente do endotélio na microcirculação.

Microiontophoresis e Micromanipulação para imagens de fluorescência intravital da Microcirculação

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

microiontophoresis-micromanipulation-for-intravital-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K visualizações.  University of Missouri. Microiontophoresis implica movimento de íons de uma micropipeta, em resposta a uma diferença de potencial elétrico entre o interior eo exterior da micropipeta. Moléculas biologicamente ativas são, assim, entregue em proporção à corrente elétrica. Nós ilustramos microiontophoresis acetilcolina em conjunto com micromanipulação para estudar vasodilatação dependente do endotélio na microcirculação.

Vídeo: Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

Normalização nascido para Tomografia Projeção de fluorescência óptica para imagens de todo o coração

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Biologia

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

O Mouse Preparação Muscle Cremaster for Imaging intravital da Microcirculação

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Microscopia intravital da Microcirculação no músculo Rato Cremaster de Análise de Migração Stem Peripheral celular

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Análise rápida e Exploração de microscopia de fluorescência Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Imagens de fluorescência com um nanômetros Precisão (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Técnicas de micromanipulação, permitindo a análise da dinâmica morfogenética e rotatividade dos reguladores do citoesqueleto

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Imagem de fluorescência para a reconstrução da único-partícula de Chlamydomonas centríolos e isolamento

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...