Esta pesquisa foi suportada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural do National Cancer Institute.

1. Manutenção de cultura de células de dormentes e metastático linhagens de células tumorais <ol><li> Crescer dormente (D2OR / MCF7/K7M2-AS.46) e metastático de células tumorais (D2A1 / MDA-MB-231 / K7M2) em 10 centímetros placas de cultura contendo meio modificado Dulbecco Águia (DMEM), glicose alta e 10% de soro fetal bovino ( FBS) e antibióticos. Quando as células atingem confluência de 70-80%, vá para os ensaios seguintes. </li></ol> 2. Ensaio de proliferação celular de células tumorais dormentes (quiescente) e metastático (proliferação) cultivadas em um sistema 3D-BME A cultura de células dormentes / metastático no sistema 3D <ol><li> Descongelar crescimento Cultrex fator reduzida Extract membrana basal (BME), em 4 ° C geladeira uma noite antes de realizar o ensaio. Observe o BME deve ser tratado no gelo em todos os momentos. </li><li> No dia seguinte, coloque uma placa de 96 poços em uma bandeja de gelo dentro de uma capa laminar. Casaco de cada poço com 50 100μl da BME gelada utilizando um dispensador com uma seringa. Verifique se não há bolhas se formam nos poços. Coloque a placa de 96 poços revestidos com BME em uma incubadora umidificada com 5% de CO 2 a 37 ° C por 30 minutos. </li><li> Nesse meio tempo aspirar a mídia a partir de células dormentes e ou metastático do tumor (preparado na seção 1). Enxágüe placas de cultura com 10 ml de fosfato tamponada pH, solução salina 7,4 (PBS). Aspirar o PBS e adicionar 2 ml de tripsina pré-aquecido a 37 ° C, para as placas de cultura. Incubar as placas em um CO 2 umidificado 5% a 37 ° C, por 5 min. </li><li> Transferência de células para um tubo cônico de 15 ml contendo 5 ml de DMEM suplementado com glicose 10% SFB e antibióticos e contagem das células. </li><li> Spin para baixo o número total de células a serem cultivadas em uma centrífuga de cultura de tecidos a uma velocidade de 1500g, em temperatura ambiente por 5 min. Em nossos ensaios nos preparamos 2X10 3 células / poço para cada linha de célula ou ponto de tempo para ser examinada. No entanto, isto pode variar dependendo de linhas celulares utilizadas. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Note, na maioria dos casos, o pellet não é visível. Portanto, deixar para trás alguns meios de comunicação. Toque no fundo do tubo de 15ml cônica com os dedos para garantir que uma suspensão de células simples é obtido. Re-suspender o pellet com DMEM baixa glicose com antibióticos complementado com FCS a 2% + 2% BME (teste de mídia). 100 l da mídia ensaio deve ser adicionado para cada 2x10 3 células. Triturar as células muitas vezes com uma pipeta de 5 ml para garantir que uma suspensão única célula é mantida. </li><li> 100μl um prato da mistura de células por poço em cima da placa de 96 BME bem revestido. Para a avaliação de fundo (na seção 2.8) Placa em 100μl por poço além de apenas a mídia ensaio em cima da placa de 96 poços BME revestido. Incubar a 96 placas de cultura bem em um umidificado 5% CO 2 incubadora a 37 ° C. As células devem ser re-alimentados a cada 4 dias com a mídia ensaio. </li></ol> Ensaio de proliferação: <ol start="8"><li> Ensaio de proliferação das células: adicione aos poços no momento desejado pontos 20 l da Célula 96 aquosas testes sorológicos Um kit solução da célula de ensaio Proliferação. Incubar em 5% umidificado incubadora de CO 2 a 37 ° C por 2h. Usando um leitor de placas Elisa registro da absorbância em 490nm. Para a avaliação de fundo e subtração, adicionar 20μl da Célula 96 aquosas testes sorológicos Um kit de ensaio Proliferação Celular Solution para poços revestidos com pré BME e apenas coberta com a mídia ensaio. Usando um leitor de placas Elisa registro a absorvância a 490 nm. </li></ol> 3. Coloração de imunofluorescência para as moléculas de sinalização celular no dormente (quiescente) células tumorais e / ou metastático (proliferação) de células tumorais A cultura de células dormentes / metastático no sistema 3D para a coloração immunfluorescence * O protocolo a seguir é uma modificação de um protocolo de cultura 3D publicado pela Debnath J et al 18. <ol><li> Prepare BME como descrito na seção 2.1. No dia seguinte: colocar uma câmara de 8-sistema de lâmina de vidro em uma bandeja de gelo dentro de uma capa laminar. Casaco de cada poço com 50uL de gelada BME usando um Pipetman 200μl. Certifique-se de BME é distribuído uniformemente e sem bolhas se formam nos poços. Coloque o 8 lâmina de vidro revestida com câmara de BME em CO 2 umidificado 5% a 37 ° C por 20 min. </li><li> Colheita de células dormentes e ou metastáticos da secção 1 e se preparar para a cultura como descrito na seção 2,3-2,4. Recolher o número total de células a serem cultivadas em um tubo de 15 ml. Nós preparamos 5 x10 3 células / poço para cada linha celular e tempo para ser examinada. Girar as células em uma centrífuga de cultura de tecidos a uma velocidade de 1500g, em temperatura ambiente por 5 min. Aspirar o sobrenadante com cuidado. Note que o pellet não é visível, portanto deixe alguns meios de comunicação por trás. Toque no fundo do tubo de 15ml cônica com os dedos para garantir que uma suspensão única célula é obtido.Re-suspender o pellet com a mídia ensaio. 400μl dos meios de comunicação de ensaio deve ser adicionado para cada 5x10 3 células. Triturar as células muitas vezes com uma pipeta de 5 ml. Este passo é muito importante para garantir que a suspensão única célula é mantida. </li><li> 400μl placa da mistura de células por poço em cima de cada uma das oito câmaras revestido com BME. Incubar a cultura oito câmaras sistema lâmina de vidro em um umidificado 5% CO 2 incubadora a 37 ° C. As células devem ser re-alimentados a cada 4 dias com a mídia ensaio. </li></ol> Imunofluorescência: <ol start="4"><li> Nos pontos de tempo desejado, aspirar a camada superior da mídia e adicionar 200μl do fixador contendo paraformaldeído 4% (PFA), sacarose 5% e 0,1% Triton X-100 e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. Aspirar o fixador e adicionar 200μl de PFA 4% contendo 5% de sacarose e incubar em temperatura ambiente por 25 minutos. </li><li> Aspirar o fixador; adicionar mL 400 de tampão fosfato (PBS) a cada poço. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Aspirar o PBS e adicionar 400 μ PBS contendo 0,05% Tween 20 por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Impedir as células fixado em temperatura ambiente com 200μl de ambos 10% de soro de burro ou com BSA 3% para 1 hora (solução de bloqueio a ser utilizado deve ser determinado empiricamente para cada anticorpo primário). </li><li> Aspirar a solução de bloqueio e adicionar 200μl do anticorpo primário (diluição deve ser determinado empiricamente para cada anticorpo primário a ser utilizado). Diluir o anticorpo primário no soro burro de 10% se 10% de burro soro foi utilizado para bloquear ou diluir o anticorpo primário em BSA 3%, se 3% BSA solução de bloqueio foi usado. Incube com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. </li><li> Aspirar o anticorpo, lavar os poços com 400μl de PBS por 15 minutos e repita duas vezes. Aspirar o PBS e adicionar 200μl de burro anti-respectivos-IgG conjugada a rodamina vermelho (diluição deve ser determinada empiricamente), cubra o slide câmara de 8 com papel alumínio e incubar por 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Lavar os poços com 400μl de PBS (3x15 minutos cada lavagem). Aspirar PBS. Montado com VECTASHIELD meio de montagem com DAPI. Slides secar por 40 minutos em temperatura ambiente no escuro. Slides pode ser mantida por uma semana a 4 ° C. Armazenar os slides no escuro. Slides de imagem por microscopia confocal. </li></ol> 4. Resultados representativos: Um exemplo de uma análise de proliferação do D2.0R dormentes e D2A1 metastático de células tumorais na cultura 3D é mostrado na Figura 1A. Células D2.0R estão dormentes (quiescente) durante o período experimental cultura inteira 14 dias enquanto o altamente metastáticas D2A1 células permanecem latentes apenas para 4-6 dias após os quais começam a proliferar. Durante a fase inicial dormente, muitas células permanecem solitários na cultura 3-D (Figura 1B; dia 4), ​​enquanto que outras células não-proliferação de forma multi-celular esferóides. A transição de D2A1 células de um dormente para o estado proliferativo em 3 D-cultura (Figura 1B, dia 12) está associada a mudanças dramáticas na morfologia celular. Assim, este ensaio pode ser usado para testar o fator / s pode desencadear células dormentes D2.0R a emergir de seu estado dormente e que fator / s pode impedir D2A1 células a transição de seu estado dormente. Figura 2 é um exemplo de um agente prevenção D2A1 células a transição de um estado dormente para proliferativa. Como ilustrado na Figura 2, os tratamentos de D2A1 células com um inibidor específico da miosina quinase da cadeia leve (ML-7) manteve D2A1 células em um estado dormente. Sinalização celular nas células dormentes e proliferação do tumor cultivadas em sistema 3D pode ser estudada por imunofluorescência para as moléculas de sinalização celular. Como ilustrado na Figura 3 um aumento significativo na fosforilação da miosina de cadeia leve no D2A1 células (coloração vermelha), seguido de reorganização dos filamentos de actina-f formando fibras de actina stress (coloração verde) ocorre durante a transição de dormência (1-4 dias) para proliferação (dia 7). No entanto, bloqueando a luz miosina atividade quinase da cadeia em D2A1 células shRNA ou medicamento específico (ML-7) mantém D2A1 células em um estado dormente e resulta em inibição da fosforilação da cadeia leve da miosina e actina-f organização fibra de estresse (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig1.jpg" /> Figura 1. Modelo in vitro para estudar a dormência cela solitária tumor ea chave para o crescimento metastático. A proliferação) de D2.0R dormentes e D2A1 metastático em 3-D Cultrex BME, n = 8 (média ± SE). Resultados representativos de três experimentos (* p ≤ 0,05). B) As imagens de microscopia de luz e de D2.0R D2A1 células cultivadas em 3-D Cultrex x20 ampliação BME.Figura modificada de Barkan et al 17. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig2.jpg" /> Figura 2. Evitar que o interruptor de D2A1 células de dormência (quiescência) para a proliferação do sistema de cultura 3D pela inibição da miosina quinase da cadeia leve (MLCK). Curso de tempo de D2A1 proliferação celular cultivadas em 3-D Cultrex BME, n = 8 (média ± SE). Células foram tratadas (controle) ou tratados com um inibidor específico da MLCK (ML-7, 5 mM) por 48 hr início no dia 5 de cultura. Figura modificada de Barkan et al 17. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig3.jpg" /> Figura 3. Fosforilação da miosina de cadeia leve seguido por f-actina reorganização durante a mudança de D2A1 células de dormência para o crescimento proliferativa. D2A1 células foram cultivadas em 3-D Cultrex BME em 8 de lâmina de vidro de câmara. As células foram fixadas e coradas com DAPI (azul) para a localização nuclear, phalloidin (verde) para f-actina e com um anticorpo contra a forma fosforilada da cadeia leve de miosina (MLC-p) (vermelho), como indicado em várias alturas. Fusão de f-actina e MLC-p coloração (amarelo). Expressão de MLC-p foi aumentado durante a transição de D2A1 células de dormência (dias1-4) para o crescimento proliferativa (dia 7) seguido por actina formação das fibras de estresse (setas). Microscopia confocal, ampliação X63. Branco bar é igual a 20 microns. Figura modificada de Barkan et al 17. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig4.jpg" /> Figura 4. . Inibição da miosina quinase da cadeia leve (MLCK) mediada f-actina formação das fibras de estresse em células D2A1 D2A1 As células foram tratadas (controle) ou tratados com inibidor de MLCK (ML-7, 5 mM), por 48 hr início no dia da cultura 5, ou tratados com embaralhada ou shRNA MLCK e corados para a forma fosforilada da cadeia leve de miosina (MLC-p) (vermelho), f-actina (verde), eo núcleo (azul). Fusão de f-actina e MLC-p coloração (amarelo). Microscopia confocal, ampliação X63. Branco bar é igual a 20 microns.

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+carcinoma+cell+lines+of+high+and+low+metastatic+potential+differ+not+in+extravasation+but+in+subsequent+migration+and+growth.">Mammary carcinoma cell lines of high and low metastatic potential differ not in extravasation but in subsequent migration and growth.</a> Clin Exp Metastasis. 12, 357-367 (1994).</li><li>Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane-cytoskeleton+linker+ezrin+is+necessary+for+osteosarcoma+metastasis.">The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis.</a> Nat Med. 10, 182-186 (2004).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os mecanismos subjacentes que mantêm as células tumorais disseminadas em um estado dormente ou resultar na sua transição para o crescimento metastático permanecem largamente desconhecidos. Esse fenômeno tem sido extremamente difícil de estudar em pacientes humanos 4,12 e poucos modelos pré-clínicos têm sido desenvolvidos para resolver este problema. No entanto, alguns sistemas in vivo e ex-vivo modelo de dormência tumor têm sido caracterizadas (revisto em 1,12). No ent...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> DMEM alta glicose </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM baixa glicose </td><td> Invitrogen </td><td> 11885-092 </td><td></td></tr><tr><td> De soro fetal bovino (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10091-148 </td><td></td></tr><tr><td> Do fator de crescimento reduzido em 3-D Cultrex Extract Membrana Basal </td><td> Trevigen Inc. </td><td></td><td> Concentração de proteína entre 14-15mg/ml </td></tr><tr><td> D2.0R e D2A1 linhas celulares </td><td></td><td></td><td> 5,19 </td></tr><tr><td> K7M2 e K7M2AS1.46 células </td><td></td><td></td><td> 20 </td></tr><tr><td> MCF-7 e MDA-MB-231 células de câncer de mama </td><td> ATCC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Um sistema de câmara de 8 lâmina de vidro </td><td> (Lab-TEK, Thermo científico) </td><td> 177402 </td><td></td></tr><tr><td> Os testes sorológicos 96 células aquoso uma solução celular kit ensaio de proliferação </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td> VECTASHIELD meio de montagem com DAPI </td><td> Vector Laboratories Inc. </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Normais burro soro </td><td> ImmunoResearch Jackson </td><td> 017-000-121 </td><td></td></tr><tr><td> Leitor de placas ELISA </td><td> Bio-Tec </td><td></td><td> 490nm registro </td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Zeiss-LSM-510 </td><td></td><td> Ampliação X63 </td></tr></tbody></table>

an in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth

Recorrência de câncer de mama geralmente segue um longo período de latência em que não há sinais de câncer e metástases não pode tornar-se clinicamente aparente até muitos anos após a remoção do tumor primário e terapia adjuvante. Uma provável explicação desse fenômeno é que as células tumorais têm semeado sítios metastáticos, são resistentes às terapias convencionais, e permanecem dormentes por longos períodos de tempo 1-4. A existência de células cancerosas dormentes em sites secundários tem sido descrita anteriormente como células quiescentes solitária que nem proliferam nem apoptose 5-7. Além disso, essas células solitária foi mostrado para disseminar a partir do tumor primário em um estágio inicial de 10/08 a progressão da doença e permanecer preso em crescimento dos pacientes medula óssea, sangue e linfonodos 1,4,11. Portanto, a compreensão dos mecanismos que regulam a dormência ou a mudança para um estado proliferativo é fundamental para descobrir novos alvos e intervenções para prevenir a recorrência da doença. No entanto, desvendar os mecanismos que regulam a passagem de dormência tumor metastático para o crescimento tem sido dificultada pela falta de sistemas modelo disponível. in vivo e sistemas modelo ex vivo para estudar a progressão metastático das células tumorais têm sido descritos anteriormente 1,12-14. No entanto, estes sistemas modelo não tenha fornecido em tempo real e em uma alta taxa de idéias em forma mecanicista o que desencadeia o aparecimento de células tumorais dormentes solitária a proliferar a doença metastática. Recentemente, desenvolvemos um sistema in vitro 3D para modelar as características de crescimento em vivo de células que apresentam ambos os dormentes (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) ou proliferativa (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) comportamento metastático in vivo. Nós demonstramos que as células tumorais que apresentam dormência in vivo em um local metastático permanecem quiescentes quando cultivadas em um 3-dimensão extrato de membrana (3D) cave (BME), enquanto que as células altamente metastáticas in vivo prontamente proliferar em cultura após 3D variável, mas relativamente curta períodos de quiescência. Importante, utilizando o 3D in vitro sistema modelo demonstramos pela primeira vez que a composição ECM desempenha um papel importante na regulação se dormente células tumorais irá mudar para um estado proliferativo e confirmaram isso em estudos in vivo 15-17. Assim, o sistema modelo descrito no presente relatório fornece um método in vitro para a dormência tumor modelo e estudar a transição para o crescimento proliferativa induzida pelo microambiente.

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An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modificação em 3-D in vitro sistema é apresentado em que características de crescimento de várias linhagens de células tumorais na membrana basal reconstituída se correlacionam com o comportamento dormentes ou proliferativa das células tumorais em um local metastático secundário<em&gt; In vivo</em&gt;.

Um In Vitro Sistema para Estudo de dormência Tumor ea Mude para o crescimento metastático

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

15.7K visualizações.  University of Haifa. A modificação em 3-D in vitro sistema é apresentado em que características de crescimento de várias linhagens de células tumorais na membrana basal reconstituída se correlacionam com o comportamento dormentes ou proliferativa das células tumorais em um local metastático secundário In vivo.

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Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade. While the use of TMS has expanded to the study of many systems and processes during this time, the original application and perhaps one of the most common uses of TMS involves studying the physiology, plasticity and function of the human neuromuscular system. Single pulse TMS applied to the motor cortex excites pyramidal neurons transsynaptically 2 (Figure 1) and results in a measurable electromyographic response that can be used to study and evaluate the integrity and excitability of the corticospinal tract in humans 3. Additionally, recent advances in magnetic stimulation now allows for partitioning of cortical versus spinal excitability 4,5. For example, paired-pulse TMS can be used to assess intracortical facilitatory and inhibitory properties by combining a conditioning stimulus and a test stimulus at different interstimulus intervals 3,4,6-8. In this video article we will demonstrate the methodological and technical aspects of these techniques. Specifically, we will demonstrate single-pulse and paired-pulse TMS techniques as applied to the flexor carpi radialis (FCR) muscle as well as the erector spinae (ES) musculature. Our laboratory studies the FCR muscle as it is of interest to our research on the effects of wrist-hand cast immobilization on reduced muscle performance6,9, and we study the ES muscles due to these muscles clinical relevance as it relates to low back pain8. With this stated, we should note that TMS has been used to study many muscles of the hand, arm and legs, and should iterate that our demonstrations in the FCR and ES muscle groups are only selected examples of TMS being used to study the human neuromuscular system.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive tool to gain insight on the physiology and function of the human nervous system. Here, we present our TMS techniques to study cortical excitability of the upper limb and lumbar musculature.

Utilizando Estimulação Magnética Transcraniana para o Estudo do sistema neuromuscular humano

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

Medicina

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

A Medição e Tratamento de Supressão de ambliopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Criação de um Modelo de Xenoenxerto Humano mieloma múltiplo na galinha para estudar o crescimento tumoral, invasão e angiogênese

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In Vivo e Ex Vivo Abordagens para o Estudo do cancro do ovário metastático Colonização de Estruturas Láctea natural em Peritoneal adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Injeção de células Singênico Murino melanoma para determinar o seu potencial metastático nos pulmões

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

Utilizando imagens da retina para estudar a demência

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Surgical Labyrinthectomy of the Rat to Study the Vestibular System

To study the vestibular system or the vestibular compensation process, a number of methods have been developed to cause vestibular damage, including surgical or chemical labyrinthectomy and vestibular neurectomy. Surgical labyrinthectomy is a relatively simple, reliable, and rapid method. Here, we describe the surgical technique for rat labyrinthectomy. A postauricular incision is made under general anesthesia to expose the external auditory canal and the tympanic membrane, after which the tympanic membrane and the ossicles are removed without the stapes. The stapes artery, which is located between the stapes and the oval window, is a vulnerable structure and must be preserved to obtain a clear surgical field. A hole to fenestrate the vestibule is made with a 2.1-mm drill bur superior to the stapes. Then, 100% ethanol is injected through this hole and aspirated several times. Meticulous dissection under a microscope and careful bleeding control are essential to obtain reliable results. Symptoms of vestibular loss, such as nystagmus, head tilting, and a rolling motion, are seen immediately after surgery. The rotarod or rotation chair test can be used to objectively and quantitatively evaluate the vestibular function.

This protocol describes the surgical labyrinthectomy of a rat, which is a useful method for studying the vestibular system.

Vestibulotóxicos cirúrgico do rato para estudar o sistema Vestibular

To study the vestibular system or the vestibular compensation process, a number of methods have been developed to cause vestibular damage, including ...

Protocolo Tuina Padronizado para Modelo de Compactação DRG de Rato

Analgesic Effect of Tuina on Rat Models with Compression of the Dorsal Root Ganglion Pain

Neuropathic pain is a prevalent condition that affects 6.9%-10% of the population and results from nerve damage due to various etiologies, such as lumbar disc herniation, spinal canal stenosis, and intervertebral foramen stenosis. Although Tuina, a traditional Chinese manual therapy, has shown analgesic effects in clinical practice for the treatment of neuropathic pain, its underlying neurobiological mechanisms remain unclear. Animal models are essential for elucidating the basic principles of Tuina. In this study, we propose a standardized Tuina protocol for rats with compression of the dorsal root ganglion (DRG), which involves inducing DRG compression by inserting a stainless steel rod into the intervertebral foramen, performing Tuina manipulation with specific parameters of location, intensity, and frequency in a controlled environment, and assessing the behavioral and histopathological outcomes of Tuina treatment. This article also discusses the potential clinical implications and limitations of the study and suggests directions for future research on Tuina.

Autor em destaque: Efeito analgésico da Tuina em modelos de ratos com compressão da dor do gânglio da raiz dorsal  

This article presents a manipulation for treating chronic compression of the dorsal root ganglion in rats using Tuina therapy, along with a method for evaluating its effectiveness based on pain behavior and histopathological results.

Efeito Analgésico de Tuina em Modelos de Rato com Compressão da Dor do Gânglio da Raiz Dorsal

Neuropathic pain is a prevalent condition that affects 6.9%-10% of the population and results from nerve damage due to various etiologies, such as lumbar ...