Este protocolo, o ensaio de invasão in vitro, é uma ferramenta útil para medir quantitativamente uma capacidade de migração de linhas de células através de uma matriz rica em proteínas e passar por uma membrana porosa, em um processo semelhante aos estágios iniciais da invasão celular cancerosa. Essas linhas celulares podem ser geneticamente alteradas a fim de expressar um gene ou ter a expressão reduzida de um gene, a fim de determinar se esse gene desempenha um papel na migração celular ou invasão celular. Muitos cânceres agressivos envolvem mudanças drásticas no comportamento celular, incluindo aumento da migração e invasão.
Assim, este ensaio de invasão in vitro pode nos permitir entender melhor os genes e outros fatores envolvidos nesse processo. Para iniciar este procedimento, cresça células tumorais mamárias de camundongos aderentes em um frasco T25 a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 100% de umidade até que sejam 70% a 90% confluentes para o primeiro dia do experimento. Recupere as pastilhas da câmara de Boyden do armazenamento e transfira-as para um capô de cultura celular para aquecer à temperatura ambiente por 20 minutos.
Use três inserções para gerar dados estatisticamente válidos para cada linha celular para cada experimento. E, em seguida, adicione 500 microliters da mídia DMEM pré-aquecida sem soro às pastilhas para que a membrana porosa e o gel sejam hidratados em ambos os lados. Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 100% de umidade por pelo menos duas horas.
Depois disso, prepare as células removendo a mídia de crescimento e enxaguando as células com cinco mililitros de HBSS. Remova o HBSS e adicione um mililitro de solução EDTA de 0,25%. Incubar a 37 graus Celsius por um a cinco minutos ou até que as células apareçam arredondadas ou apresentem sinais de desprendimento.
Em seguida, toque suavemente no frasco para desprender todas as células. Suspenda as células em cinco mililitros de DMEM com 10% de FBS. E transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros estéreis.
Centrifugar as células e 1000 vezes g por cinco minutos para suavemente pelotar as células. Remova a mídia e suspenda a pelota em cinco mililitros de DMEM sem soro. Repita o processo de centrifugação e re-suspensão duas vezes adicionais para um total de três lavagens.
Depois disso, suspenda completamente as células nos últimos cinco mililitros de DMEM sem soro e garanta que não haja aglomerados de células. Use um hemótmetro para determinar a concentração celular, certificando-se de contar apenas células viáveis. E diluir a suspensão celular para 50.000 células por mililitro em cinco mililitros de DMEM sem soro.
Em seguida, retire o prato com as pastilhas da incubadora e aspire suavemente a mídia de uma inserção. Levante a pastilha e aspire a mídia do poço. Trabalhando rapidamente, adicione o quimioattractant à câmara inferior.
Coloque a inserção no poço, e para um prato de 24 poços, adicione 500 microliters da suspensão celular à pastilha. Certifique-se de que não há bolhas de ar presentes em ambos os lados da membrana. Devolva o prato à incubadora de cultura celular por 22 horas.
Após 22 horas, prepare uma solução de 1%paraformaldeído e um X PBS para fixação. Em um prato de cultura de 24 poços, adicione um mililitro do fixador aos poços individuais para que haja um bem para cada inserção. Em seguida, prepare a solução de coloração de 0,1% de violeta cristalina em uma solução de PBS com 10% de etanol.
Adicione um mililitro desta solução de coloração a um poço limpo para cada inserção. Usando fórceps, remova cada um de cada vez. Coloque um cotonete estéril dentro de cada inserção e cotonete na parte superior da membrana para remover quaisquer células não migradas.
Repita este processo com um segundo cotonete. Em seguida, remova qualquer mídia restante do interior da pastilha e adicione 750 microliters de PBS para lavar quaisquer células separadas. Retire o PBS e repita a lavagem com PBS fresco.
Em seguida, coloque a inserção em um poço que contenha fixação para fixar as células migradas na parte inferior da membrana. Repita este processo para todas as pastilhas e deixe as pastilhas fixar por 15 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, remova cada um de cada vez de seu poço e lave-o com 750 microliters de PBS.
Coloque a inserção em uma solução de coloração que contenha poços e deixe-a por 15 minutos para colorir todas as células migradas e fixas. Em seguida, remova as pastilhas e mergulhe-as em um béquer contendo água destilada até que a água que sai da pastilha esteja limpa. Remova qualquer excesso de gotículas de água e coloque a inserção lateralmente em um pedaço de papel filtro.
Deixe as pastilhas secarem. Prepare a membrana para imagens rotulando um slide de microscópio de vidro limpo para cada inserção, e colocando uma pequena gota de óleo de imersão de microscópio no centro de cada lâmina. Usando um bisturi, corte ao redor do perímetro da membrana no interior da inserção plástica para desprender a membrana.
Use fórceps para remover a membrana e coloque-a em cima da gota de óleo no slide rotulado. Usando um microscópio composto, visualize as células em cinco vezes, 10 vezes ou 20 vezes a ampliação. Para quantificação, leve várias imagens não sobrepostas em 10 vezes a ampliação.
Determine o número total de células invasoras ou células por área para todas as amostras. Para cada experimento, realize cada condição no ensaio com três inserções de replicação e repita várias vezes para resultados estatisticamente úteis. Neste estudo, a invasão in vitro através de uma matriz proteica é usada para avaliar os fenótipos agressivos em comportamentos celulares oncogênicos de células tumorais mamárias de camundongos com expressão alterada da proteína do dedo de zinco, Zc3h8.
Níveis mais elevados de expressão Zc3h8 é visto em linhas de células tumorais ou pela expressão mediada pelo promotor a partir de um plasmídeo, resultando em taxas rápidas de proliferação celular, migração rápida, crescimento em ambientes 3D e aumento da invasão dentro do ensaio de invasão in vitro. Por outro lado, a diminuição da expressão por construções de shRNA resulta em proliferação menos agressiva, migração e invasão. Enquanto a invasão celular diminui após o knockdown de Zc3h8, essa invasão é resgatada quando a expressão é resgatada.
A técnica de ensaio de invasão in vitro é extremamente útil, pois é uma abordagem rápida, barata, flexível e relativamente fácil para estudar o comportamento celular. Células cultivadas na cultura são fáceis de manipular geneticamente. Eles podem até ser testados para mutações específicas.
O sistema de invasão in vitro também permite a análise de inibidores de pequenas moléculas, bem como agentes biológicos como micro RNAs por seus efeitos na migração celular e invasão. Este ensaio também inclui uma grande quantidade de flexibilidade, permitindo a alteração do teor proteico da matriz, tamanho dos poros e quimioattractant.
