Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal programma di ricerca intramurale del National Cancer Institute.

1. Cultura della manutenzione delle cellule dormienti e linee cellulari del tumore metastatico <ol><li> Crescere le cellule tumorali dormienti (D2OR / MCF7/K7M2-AS.46) e metastatico (D2A1 / MDA-MB-231 / K7M2) in piastre di cm 10 di coltura contenente Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM) glucosio e il 10% di siero fetale bovino ( FBS) e antibiotici. Una volta che le cellule raggiungono il 70-80% confluenza, procedere con il test seguente. </li></ol> 2. Proliferazione delle cellule saggio delle cellule tumorali dormienti (riposo) e metastatico (proliferazione) coltivate in un 3D-BME sistema Coltura di cellule dormienti / metastatico nel sistema 3D <ol><li> Scongelare la crescita Cultrex fattore ridotto Estratto membrana basale (BME) a ​​4 ° C frigo una notte prima di effettuare il test. Si noti la BME devono essere gestiti su ghiaccio in ogni momento. </li><li> Il giorno successivo, posto a 96 pozzetti su un vassoio di ghiaccio all&#39;interno di una cappa laminare. Cappotto di ogni bene con 50-100μl di BME ghiaccio a freddo con un distributore con una siringa. Assicurarsi che non bolle si formano nei pozzetti. Posizionare la piastra da 96 pozzetti rivestiti con BME in un incubatore umidificato al 5% di CO 2 a 37 ° C per 30 minuti. </li><li> Nel frattempo aspirare i media dalle cellule dormienti o metastatico e tumori (preparato in sezione 1). Sciacquare piastre di coltura con 10 ml di tampone fosfato salino, pH 7,4 (PBS). Aspirare il PBS e aggiungere 2 ml tripsina pre-riscaldato a 37 ° C, a piastre di coltura. Incubare le piastre in un CO umidificata 5% 2 a 37 ° C, per 5 min. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml conica contenente 5 ml di glucosio ad alta DMEM supplementato con 10% FCS e antibiotici e contare le cellule. </li><li> Spin il numero totale delle cellule di essere coltivate in una centrifuga coltura di tessuti ad una velocità di 1500 g, a temperatura ambiente per 5 min. Nel nostro test ci prepariamo 2X10 3 celle / e per ciascuna linea cellulare o punto di tempo da esaminare. Tuttavia, questo può variare a seconda delle linee cellulari utilizzate. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante. Si noti, nella maggior parte dei casi il pellet non è visibile. Pertanto, lasciare nessuno indietro media. Toccare il fondo del tubo 15 ml coniche con le dita per assicurare che una sospensione di singole cellule è ottenuta. Risospendere il pellet con glucosio DMEM bassa con antibiotici integrata con il 2% FCS BME + 2% (test di media). 100 l di media test deve essere aggiunto per ogni 2x10 3 celle. Triturare le cellule molte volte con una pipetta da 5 ml per garantire che una sospensione singola cella è mantenuta. </li><li> Piatto un 100μl della miscela di cellule per pozzetto in cima al piatto ben 96 BME rivestito. Per la valutazione di fondo (nella sezione 2.8) piastra in 100μl aggiunta per pozzetto di solo i supporti saggio sulla parte superiore della piastra 96 ​​pozzetti BME rivestito. Incubare il colto Piastre a 96 pozzetti in un umidificata al 5% CO 2 incubatore a 37 ° C. Le cellule devono essere ri-alimentato ogni 4 giorni con i mezzi di test. </li></ol> Proliferazione saggio: <ol start="8"><li> Saggio di proliferazione delle cellule: aggiungi ai pozzi al momento desiderato punti 20 microlitri della cella titolo 96 acquosa Un kit Soluzione saggio proliferazione delle cellule. Incubare in un umidificata al 5% CO 2 incubatore a 37 ° C per 2 ore. L&#39;utilizzo di un record di piastre Elisa Reader l&#39;assorbanza a 490nm. Per la valutazione di fondo e la sottrazione, aggiungere 20μl della cellula titolo 96 acquosa Un kit Soluzione saggio la proliferazione delle cellule di rivestimento pozzi pre con BME e solo sovrapposti con i media del saggio. L&#39;utilizzo di un record di piastre Elisa Reader l&#39;assorbanza a 490 nm. </li></ol> 3. Colorazione di immunofluorescenza per le molecole di segnalazione cellulare in sospeso (riposo), le cellule tumorali e / o metastatico (proliferazione) delle cellule tumorali Coltura di cellule dormienti / metastatico nel sistema 3D per la colorazione immunfluorescence * Il protocollo che segue è una modifica di un protocollo di cultura 3D pubblicato da Debnath J et al 18. <ol><li> Preparare BME come descritto nella sezione 2.1. Il giorno seguente: posto un 8-camera di sistema vetrino su un vassoio di ghiaccio all&#39;interno di una cappa laminare. Cappotto ogni pozzetto con 50ul del freddo BME utilizzando un 200μl Pipetman. Assicurarsi BME si diffonde in modo uniforme e senza bolle si formano nei pozzetti. Posizionare gli 8 vetrino da camera rivestita con BME in un CO umidificata 5% 2 a 37 ° C per 20 min. </li><li> Raccolta e cellule dormienti o metastatico dalla sezione 1 e preparare alla cultura, come descritto nella sezione 2.3-2.4. Raccogliere il numero totale di cellule da coltura in un tubo da 15 ml. Prepariamo 5 x10 3 celle / e per ciascuna linea cellulare e il punto di tempo per essere esaminato. Spin giù le cellule in una centrifuga di coltura ad una velocità di 1500 g, a temperatura ambiente per 5 min. Aspirare il supernate attenzione. Si noti che il pellet non è visibile, e quindi lasciare un po &#39;mezzi alle spalle. Toccare il fondo del tubo 15 ml coniche con le dita per assicurare che una sospensione singola cella si ottiene.Risospendere il pellet con i media del saggio. 400μl dei media test deve essere aggiunto per ogni 5x10 3 celle. Triturare le cellule più volte con pipetta 5 ml. Questo passaggio è molto importante per garantire che la sospensione singola cellula è mantenuta. </li><li> 400μl targa della miscela di cellule per pozzetto in cima ad ognuna delle 8 camere rivestite con BME. Incubare la coltura 8 camere di vetro sistema di scorrimento in una umidificata al 5% CO 2 incubatore a 37 ° C. Le cellule devono essere ri-alimentato ogni 4 giorni con i mezzi di test. </li></ol> Immunofluorescenza: <ol start="4"><li> Nei punti di tempo desiderato, aspirare lo strato superiore del supporto e aggiungere 200μl del fissativo contenente 4% paraformaldeide (PFA), 5% di saccarosio e lo 0,1% Triton X-100 e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Aspirare il fissativo e aggiungere 200μl del 4% PFA contenente 5% di saccarosio e incubare a temperatura ambiente per 25 minuti. </li><li> Aspirare il fissativo; aggiungere 400 ml di tampone fosfato (PBS) in ciascun pozzetto. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il PBS e aggiungere 400 μ PBS contenente 0,05% di Tween 20 per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Bloccare le cellule fissate a temperatura ambiente con 200μl di asino o di siero al 10% o al 3% BSA per 1 ora (blocco soluzione da utilizzare devono essere determinati empiricamente per ogni anticorpo primario). </li><li> Aspirare la soluzione di saturazione e aggiungere 200μl di anticorpo primario (diluizione deve essere determinato empiricamente per ogni anticorpo primario da utilizzare). Diluire l&#39;anticorpo primario nel siero asino al 10% se il 10% asino siero è stato utilizzato per bloccare o diluire l&#39;anticorpo primario nel 3% BSA se il 3% soluzione BSA blocco è stato utilizzato. Incubare con l&#39;anticorpo primario overnight a 4 ° C. </li><li> Aspirare l&#39;anticorpo, lavare i pozzetti con 400μl di PBS per 15 minuti e ripetere due volte. Aspirare il PBS e aggiungere 200μl di asino anti-rispettive-IgG coniugato con rodamina rosso (diluizione deve essere determinato empiricamente), coprire gli 8 scivolo da camera con foglio di alluminio e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i pozzetti con 400μl di PBS (3x15 minuti ogni lavaggio). Aspirare il PBS. Montato con Vectashield montaggio media con DAPI. Diapositive a secco per 40 minuti a temperatura ambiente al buio. I vetrini possono essere conservati per 1 settimana a 4 ° C. Conservare i vetrini al buio. Immagine diapositive mediante microscopia confocale. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Un esempio di analisi di proliferazione delle D2.0R dormienti e D2A1 metastatica delle cellule tumorali in coltura 3D è mostrato nella Figura 1A. Cellule D2.0R sono dormienti (quiescenti) attraverso l&#39;intero periodo di sperimentazione della cultura 14 giorni mentre il altamente metastatico D2A1 cellule rimangono inattivi solo per 4-6 giorni, quindi cominciano a proliferare. Durante la fase iniziale dormiente, molte cellule rimangono solitarie in 3-D cultura (Figura 1B; giorno 4), mentre le altre cellule non proliferanti forma pluricellulare sferoidi. Il passaggio di D2A1 cellule da una latente allo stato proliferativo in 3-D cultura (Figura 1B; giorno 12) è associata a cambiamenti drammatici nella morfologia cellulare. Quindi, questo test può essere usato per testare quale fattore / s può scatenare D2.0R cellule dormienti di uscire dal loro stato sospeso e quale fattore / s D2A1 può impedire alle cellule di transizione dal loro stato dormiente. Figura 2 è un esempio di un agente prevenire D2A1 cellule di transizione da uno stato dormiente a proliferativa. Come illustrato nella figura 2, i trattamenti di D2A1 cellule con un inibitore specifico della chinasi catena leggera della miosina (ML-7) mantenuto D2A1 cellule in uno stato inattivo. Segnalazione cellulare nelle cellule dormienti e proliferanti tumorali in coltura nel sistema 3D può essere studiato da immunofluorescenza per le molecole di segnalazione cellulare. Come illustrato in figura 3 un significativo aumento della fosforilazione della catena leggera della miosina in D2A1 cellule (colorazione rossa), seguita dalla riorganizzazione del f-actina, filamenti di actina che formano le fibre di stress (colorazione verde) si verifica durante il passaggio dalla dormienza (1-4 giorni) per proliferazione (giorno 7). Tuttavia, bloccando l&#39;attività della chinasi della catena leggera della miosina in D2A1 cellule shRNA o farmaco specifico (ML-7) conserva D2A1 cellule in uno stato inattivo e provoca l&#39;inibizione della fosforilazione di miosina catena leggera e f-actina organizzazione delle fibre di stress (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig1.jpg" /> Figura 1. Modello in vitro per lo studio solitario dormienza delle cellule tumorali e l&#39;interruttore di crescita metastatica. A) La proliferazione delle D2.0R sospeso e metastatico D2A1 in 3-D Cultrex BME, n = 8 (media ± SE). Risultati rappresentativi di tre esperimenti (* p ≤ 0,05). B) immagini di microscopia ottica e D2.0R D2A1 cellule in coltura in 3-D Cultrex x20 ingrandimento BME.Figura modificata da Barkan et al 17. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig2.jpg" /> Figura 2. Impedendo il passaggio di cellule dal D2A1 dormienza (quiescenza) alla proliferazione nel sistema cultura 3D attraverso l&#39;inibizione della chinasi catena leggera della miosina (MLCK). Durata di D2A1 proliferazione delle cellule in coltura in 3-D Cultrex BME, n = 8 (media ± SE). Le cellule sono state trattate (controllo), o trattati con un inibitore specifico della MLCK (ML-7, 5 mM) per 48 ore al giorno a partire cultura 5. Figura modificata da Barkan et al 17. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig3.jpg" /> Figura 3. Fosforilazione della catena leggera della miosina seguito da f-actina riorganizzazione durante il passaggio di cellule dal D2A1 dormienza alla crescita proliferativa. D2A1 cellule sono state coltivate in 3-D Cultrex BME l&#39;8 scivolo camera di vetro. Le cellule sono state fissate e colorate con DAPI (blu) per la localizzazione nucleare, falloidina (verde) per f-actina e con un anticorpo contro la forma fosforilata della catena leggera della miosina (MLC-p) (rosso), come indicato in vari momenti. Fusione di f-actina, e MLC-p colorazione (giallo). Espressione di MLC-p è stata aumentata durante la transizione di D2A1 cellule dal letargo (giorni1-4) alla crescita proliferativa (giorno 7) seguito dalla formazione di fibre di stress l&#39;actina (frecce). Microscopia confocale, ingrandimento x63. Bianco bar equivale a 20 micron. Figura modificata da Barkan et al 17. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig4.jpg" /> Figura 4. . Inibizione della chinasi catena leggera della miosina (MLCK) mediata f-actina formazione delle fibre di stress in cellule D2A1 D2A1 Le cellule sono state trattate (controllo), o trattati con inibitori per MLCK (ML-7, 5 micron), per 48 ore il giorno di inizio della cultura 5, o trattati con strapazzate o MLCK shRNA e colorate per la forma fosforilata della catena leggera della miosina (MLC-p) (rosso), f-actina (verde), e nuclei (blu). Fusione di f-actina, e MLC-p colorazione (giallo). Microscopia confocale, ingrandimento x63. Bianco bar equivale a 20 micron.

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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+human+tumor+dormancy:+an+angiogenic+switch+from+the+nonangiogenic+phenotype.">A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype.</a> J Natl Cancer Inst. 98, 316-325 (2006).</li><li>Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment.">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).</li><li>Barkan, D., Green, J. E., Chambers, A. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+carcinoma+cell+lines+of+high+and+low+metastatic+potential+differ+not+in+extravasation+but+in+subsequent+migration+and+growth.">Mammary carcinoma cell lines of high and low metastatic potential differ not in extravasation but in subsequent migration and growth.</a> Clin Exp Metastasis. 12, 357-367 (1994).</li><li>Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane-cytoskeleton+linker+ezrin+is+necessary+for+osteosarcoma+metastasis.">The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis.</a> Nat Med. 10, 182-186 (2004).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I meccanismi alla base che mantengono le cellule tumorali disseminate in uno stato inattivo o risultato nella loro transizione verso una crescita metastatica rimangono in gran parte sconosciuti. Questo fenomeno è stato estremamente difficile da studiare nei pazienti umani 4,12 e pochi modelli preclinici sono stati sviluppati per risolvere questo problema. Tuttavia, alcuni in vivo ed ex-vivo sistemi modello per la dormienza tumorale sono state caratterizzate (recensione a 1,12). T...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> DMEM glucosio </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM glucosio </td><td> Invitrogen </td><td> 11885-092 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10091-148 </td><td></td></tr><tr><td> Fattore di crescita ridotto 3-D Estratto di Basement Cultrex membrana </td><td> Trevigen Inc. </td><td></td><td> Concentrazione di proteine ​​tra 14-15mg/ml </td></tr><tr><td> D2.0R e D2A1 linee cellulari </td><td></td><td></td><td> 5,19 </td></tr><tr><td> K7M2 e K7M2AS1.46 cellule </td><td></td><td></td><td> 20 </td></tr><tr><td> MCF-7 e MDA-MB-231 cellule di cancro al seno </td><td> ATCC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Una camera di vetro 8 sistema di scorrimento </td><td> (Lab-TEK, Thermo scientifico) </td><td> 177402 </td><td></td></tr><tr><td> Titolo cellula 96 acquosa Una cellula soluzione proliferazione kit di analisi </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield montaggio medio con DAPI </td><td> Vector Laboratories Inc. </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Normale asino siero </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 017-000-121 </td><td></td></tr><tr><td> Lettore di piastra ELISA </td><td> Bio-Tec </td><td></td><td> Record 490nm </td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Zeiss-LSM-510 </td><td></td><td> Ingrandimento x63 </td></tr></tbody></table>

an in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth

Recidiva del tumore al seno spesso segue un lungo periodo di latenza in cui non ci sono segni di cancro e metastasi non può diventare clinicamente evidente solo molti anni dopo la rimozione del tumore primario e la terapia adiuvante. Una probabile spiegazione di questo fenomeno è che le cellule tumorali hanno seminato siti metastatici, resistenti alle terapie convenzionali, e rimangono inattivi per lunghi periodi di tempo 1-4. L&#39;esistenza di cellule tumorali dormienti presso le sedi secondarie è stato descritto in precedenza come le cellule quiescenti solitaria che non proliferano nè apoptosi 5-7. Inoltre, queste cellule solitarie ha dimostrato di diffondere dal tumore primario in una fase iniziale di 8-10 progressione della malattia e di soggiornare crescita arrestato nel midollo osseo dei pazienti &#39;, il sangue e linfonodi 1,4,11. Pertanto, la comprensione dei meccanismi che regolano dormienza o il passaggio ad uno stato proliferativo è fondamentale per scoprire nuovi obiettivi e interventi per prevenire la recidiva di malattia. Tuttavia, svelando i meccanismi che regolano il passaggio dalla dormienza alla crescita del tumore metastatico è stata ostacolata dalla mancanza di sistemi di modelli disponibili. in vivo ed ex vivo sistemi modello per studiare la progressione metastatica delle cellule tumorali sono state descritte in precedenza 1,12-14. Tuttavia questi sistemi modello non hanno fornito in tempo reale ed in maniera meccanicistica intuizioni alta velocità in quello che fa scattare l&#39;emergenza di solitario cellule tumorali dormienti a proliferare come malattia metastatica. Abbiamo recentemente sviluppato un sistema in vitro 3D per modellare le caratteristiche di crescita in vivo delle cellule che presentano inattive (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) o proliferativa (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) comportamento metastatico in vivo. Abbiamo dimostrato che le cellule tumorali che presentano dormienza in vivo in un sito metastatico rimanere quiescente quando coltivate in un 3-dimensione (3D) estratto membrana basale (BME), mentre le cellule altamente metastatico in vivo facilmente proliferare nella cultura 3D dopo variabile, ma relativamente breve periodi di quiescenza. È importante sottolineare che utilizzando il 3D nel sistema modello in vitro, abbiamo dimostrato per la prima volta che la composizione ECM svolge un ruolo importante nella regolazione delle cellule tumorali dormienti se passerà ad uno stato proliferativo e lo hanno confermato in studi in vivo 15-17. Quindi, il modello di sistema descritte nella presente relazione fornisce un metodo in vitro per dormienza modello di tumore e lo studio della transizione alla crescita proliferativa indotta dal microambiente.

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An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Un modificato 3-D in vitro del sistema è presentato in cui caratteristiche di crescita di diverse linee cellulari tumorali in membrana basale ricostituita in correlazione con il comportamento inattivo o proliferativa delle cellule tumorali in un sito secondario metastatico<em&gt; In vivo</em&gt;.

Un In Vitro Sistema per studio dormienza tumorale e l&#39;interruttore di crescita metastatica

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

15.8K Views.  University of Haifa. Un modificato 3-D in vitro del sistema è presentato in cui caratteristiche di crescita di diverse linee cellulari tumorali in membrana basale ricostituita in correlazione con il comportamento inattivo o proliferativa delle cellule tumorali in un sito secondario metastatico In vivo.

Video: An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade. While the use of TMS has expanded to the study of many systems and processes during this time, the original application and perhaps one of the most common uses of TMS involves studying the physiology, plasticity and function of the human neuromuscular system. Single pulse TMS applied to the motor cortex excites pyramidal neurons transsynaptically 2 (Figure 1) and results in a measurable electromyographic response that can be used to study and evaluate the integrity and excitability of the corticospinal tract in humans 3. Additionally, recent advances in magnetic stimulation now allows for partitioning of cortical versus spinal excitability 4,5. For example, paired-pulse TMS can be used to assess intracortical facilitatory and inhibitory properties by combining a conditioning stimulus and a test stimulus at different interstimulus intervals 3,4,6-8. In this video article we will demonstrate the methodological and technical aspects of these techniques. Specifically, we will demonstrate single-pulse and paired-pulse TMS techniques as applied to the flexor carpi radialis (FCR) muscle as well as the erector spinae (ES) musculature. Our laboratory studies the FCR muscle as it is of interest to our research on the effects of wrist-hand cast immobilization on reduced muscle performance6,9, and we study the ES muscles due to these muscles clinical relevance as it relates to low back pain8. With this stated, we should note that TMS has been used to study many muscles of the hand, arm and legs, and should iterate that our demonstrations in the FCR and ES muscle groups are only selected examples of TMS being used to study the human neuromuscular system.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive tool to gain insight on the physiology and function of the human nervous system. Here, we present our TMS techniques to study cortical excitability of the upper limb and lumbar musculature.

Utilizzando la Stimolazione Magnetica Transcranica per studiare il sistema neuromuscolare umano

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

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Medicina

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

La misurazione e trattamento di soppressione in Ambliopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Un romanzo ad alta risoluzione<em&gt; In vivo</em&gt; Tecnica di imaging per studiare la risposta dinamica di strutture intracraniche alla crescita del tumore e Terapeutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Iniezione ortotopico di cellule di carcinoma mammario nel mammaria Fat Pad di Mice per studiare la crescita del tumore.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Istituzione di un mieloma multiplo umano Xenograft modello nel pollo per studiare la crescita del tumore, invasione e l&#39;angiogenesi

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo ed ex vivo approcci per studiare il cancro ovarico metastatico colonizzazione delle strutture Lattea Spot in peritoneale adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Iniezione di cellule singenici del topo melanoma per determinare il loro potenziale metastatico nei polmoni

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

Usando la formazione immagine retinica per studiare la demenza

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Surgical Labyrinthectomy of the Rat to Study the Vestibular System

To study the vestibular system or the vestibular compensation process, a number of methods have been developed to cause vestibular damage, including surgical or chemical labyrinthectomy and vestibular neurectomy. Surgical labyrinthectomy is a relatively simple, reliable, and rapid method. Here, we describe the surgical technique for rat labyrinthectomy. A postauricular incision is made under general anesthesia to expose the external auditory canal and the tympanic membrane, after which the tympanic membrane and the ossicles are removed without the stapes. The stapes artery, which is located between the stapes and the oval window, is a vulnerable structure and must be preserved to obtain a clear surgical field. A hole to fenestrate the vestibule is made with a 2.1-mm drill bur superior to the stapes. Then, 100% ethanol is injected through this hole and aspirated several times. Meticulous dissection under a microscope and careful bleeding control are essential to obtain reliable results. Symptoms of vestibular loss, such as nystagmus, head tilting, and a rolling motion, are seen immediately after surgery. The rotarod or rotation chair test can be used to objectively and quantitatively evaluate the vestibular function.

This protocol describes the surgical labyrinthectomy of a rat, which is a useful method for studying the vestibular system.

Labyrinthectomy chirurgica del ratto per studiare il sistema vestibolare

To study the vestibular system or the vestibular compensation process, a number of methods have been developed to cause vestibular damage, including ...

Manipolazione standardizzata di Tuina per l'artrosi del ginocchio nei ratti

Tuina Manipulation to Reduce Inflammation and Cartilage Loss in Knee Osteoarthritis Rats

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its mechanism. Therefore, the manipulation of animal models of knee osteoarthritis is critical. This protocol provides a standard process for Tuina manipulation on KOA rats and a preliminary exploration of the mechanism of Tuina for KOA. The press and kneading manipulation method (a kind of Tuina manipulation that refers to pressing and kneading the specific area of the body surface) is applied on 5 acupoints around the knee joint of rats. The force and frequency of the manipulation were standardized by finger pressure recordings, and the position of the rat during manipulation is described in detail in the protocol. The effect of manipulation can be measured by pain behavior tests and microscopic findings in synovial and cartilage. KOA rats showed significant improvement in pain behavior. The synovial tissue inflammatory infiltration was reduced in the Tuina group, and the expression of tumor necrosis factor (TNF)-&#945; was significantly lower. Compared to the control group, chondrocyte apoptosis was less in the Tuina group. This study provides a standardized protocol for Tuina manipulation on KOA rats and preliminary proof that the therapeutic effects of Tuina may be related to reducing synovial inflammation and delayed chondrocyte apoptosis.

Autore in primo piano: Comprendere il meccanismo della manipolazione del tuina nei ratti 

We present a protocol for Tuina manipulation performed on plaster-immobilized-induced knee osteoarthritis rats. Based on the preliminary results, it suggested that the efficacy of the method relied on the reduction of inflammation and cartilage loss.

Manipolazione del tuina per ridurre l'infiammazione e la perdita di cartilagine nei ratti affetti da osteoartrite del ginocchio

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its ...

Un In Vitro Sistema per studio dormienza tumorale e l'interruttore di crescita metastatica

Riepilogo

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