MKK graças Engenharia do Reino Unido e Ciências Físicas Research Council (EPSRC) programa Life Sciences interface para uma bolsa pessoal. Gostaríamos também de agradecer pelo financiamento de Biotecnologia do Reino Unido e Ciências Biológicas Research Council (BBSRC).

Os protocolos para a preparação da amostra FLIM não diferem daquelas para as confocal ou de grande intensidade microscopia de campo baseado em fluorescência. A aquisição de dados é seguido pela tarefa principal da análise de dados, isto é, extraindo os tempos de vida de fluorescência a partir dos dados em bruto. Uma vez que estes tenham sido obtidos, a interpretação dos dados ajuda a verificar ou falsificar as hipóteses. 1. Células marcadas com rotores moleculares <ol><li> Preparar uma solução-mãe (10 ml) por dissolução de aproximadamente 1 mg / ml do corante num solvente apropriado (por exemplo metanol para BODIPY-C 12) 6,7 usando uma balança com uma precisão e uma pipeta. </li><li> As células (um modelo da linha de células cancerosas, HeLa, no nosso caso) de serem coradas são cultivados em em uma placa de poços múltiplos com um lado de baixo coverslide para microscopia, numa incubadora a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO 2 até ~ 80% confluente . </li><li> Adicionar 10-20 ul da solução de estoque para as células vivas que crescem em um multi-well placa (50 SmartSlide sistema de incubação de micro-, Wafergen) em 4 ml de meio Opti-MEM (GIBCO) por poço para uma placa de 6 poços. Isso produz uma concentração de corante micro-molar no poço. </li><li> Retornar a placa multi-poço para uma incubadora a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO2 durante 10-45 minutos, para a coloração. </li><li> Remova a placa de poços múltiplos da incubadora e lavar as células de 3-4 vezes com 4 ml meio de cultura de células opticamente transparente (por exemplo, Opti-MEM) para remover o excesso de corante. </li><li> Transferir a placa de poços múltiplos para a platina do microscópio e ligar a um controlador de temperatura / 5% de CO de entrada de gás 2, conforme necessário, em preparação para a imagem latente. </li></ol> 2. FLIM de fluorescentes rotores moleculares em células <ol><li> Colocar a amostra sobre a platina do microscópio e obter uma transmissão e uma imagem de fluorescência para identificar as células fluorescentes. Um diagrama esquemático do conjunto experimental acima é mostrada na fig. 1.Verify que emana de fluorescência a partir da expe localizaçõesCTED (por exemplo, da membrana celular, citoplasma). Obter um espectro de emissão de fluorescência, e verificar que é a do corante ou da proteína esperado, neste caso, o espectro do rotor molecular. Como um controlo negativo de imagem, uma amostra não-coradas e verificar que não fluorescente. Embora este passo não é essencial especificamente para FLIM, é uma boa prática, em geral, e não ajuda a verificar que a amostra é o que você pensa que é. </li><li> Mude para o modo FLIM - isto é facilmente conseguido através de um espelho se movendo para fora do caminho de fluorescência de detecção de feixe (&quot;detector externo&quot; botão &quot;caminho configuração de feixe&quot; painel sobre o SP2 TCS Leica software de controle de aquisição). Um filtro de emissão de fluorescência apropriado para bloquear qualquer luz de excitação de alcançar o detector deve estar no beampath detecção de fluorescência. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig1.jpg" /> Figura 1. Arranjo experimental para domínio do tempo FLIM usando acdo laser onfocal microscópio de varredura. <ol start="3"><li> Digitalizar a amostra e verificar, no computador que controla a aquisição FLIM, que a taxa de contagem de detector (barra preta rotulado CFD em software de aquisição de controlo do Becker e Hickl SPC 830 da placa) não é mais do que cerca de 1% da taxa de repetição do laser ( barra verde marcado SYNC software de controle de aquisição). Se for, reduzir a intensidade de excitação laser, por exemplo, pela colocação de um filtro de densidade neutro no caminho do feixe de laser, para evitar a recolha de pilha-up distorcidas curvas de decaimento da fluorescência. </li><li> Adquirir uma imagem FLIM, geralmente durante 3-5 minutos, parar a busca e salvar os dados em bruto (um 3D de dados &quot;cubo&quot;, que consiste de coordenadas espaciais x e y, e tempo). </li><li> Abra os dados brutos na fluorescência pacote de software decadência análise, por exemplo TRI-2 14 ou software comercial, para exibir a imagem de intensidade de fluorescência. Isto é simplesmente o decaimento integrado de fluorescência, isto é, a área sob a curva de decaimento da fluorescência, em cadapixel. </li><li> Selecione um pixel típico, colocando o cursor sobre ele, e inspecionar o decaimento de fluorescência em que pixel. Se a contagem de pico é abaixo de 100, utilizar binning espacial de pixels. As contagens de pixels adjacentes (por exemplo, 3x3 ou 5x5) são adicionados ao pixel central, de modo que um maior número de pico é obtido lá. Isto proporciona uma maior precisão estatística para o passo seguinte. Alternativamente, a medição pode ser repetido para um tempo de aquisição (passo 5). Para 30-50min, uma contagem de cerca de 10 vezes maior pico (e contagens totais) é obtido, mas esta é muito tempo um tempo de aquisição para a maioria das amostras biológicas por causa do perigo de introdução de artefactos devidos ao movimento da amostra, deriva microscópio, fototoxicidade e fotodegradação. </li><li> Seleccionar um valor de limiar global pixel (acima do qual o decaimento num pixel está equipado) e aplicar um ajuste de decaimento exponencial simples para a imagem. O resultado produz um tempo de vida de fluorescência para cada pixel acima do limiar, o qual é então codificado emcor. Cada pixel é colorida com o resultado do ajuste, e um mapa FLIM é obtido. Verifique os reduzidos valores de qui-quadrado de pixels diferentes - cerca de 1 (e até 1,3) indica um bom ajuste. Inspecione os resíduos correspondentes, que devem ser distribuídos aleatoriamente em torno de zero. </li><li> As parcelas da vida de fluorescência do histograma como muitas vezes vidas de fluorescência certas ocorrem contra a vida de fluorescência em si. Ajuste o intervalo de cor tal que a distribuição tempo de vida de fluorescência se encaixa na gama de cores. </li><li> Se um ajuste monoexponencial não produzir um valor de qui-quadrado de cerca de 1 (e até 1,3), e há um desvio sistemática dos resíduos a partir de zero, um modelo mais sofisticado é necessária. Por exemplo, tente ajustamento de um modelo exponencial dupla para os decai de fluorescência, a conta de dois ambientes diferentes a sonda pode ser polegadas O ajuste também irá produzir os factores pré-exponencial ou amplitudes que dão uma indicação da quantidade relativa de corante em um ambientemento ou o outro. Alternativamente, uma função exponencial estirado pode ser apropriado para explicar uma distribuição de tempos de vida de fluorescência. </li><li> Os resultados para os tempos de vida de fluorescência, pré-exponencial factores, ea relação de tempo de vida ea razão factor de pré-exponencial para cada pixel pode então ser codificado em cor. Cada pixel é colorido de acordo com o seu valor, eo contraste devido ao tempo de vida de fluorescência, pré-exponencial factores e as suas proporções é obtido. Mais uma vez, verificar as reduzidas de qui-quadrado valores (que também pode ser codificado em cor e exibidos como uma imagem) - cerca de 1 (e até 1,3) indica um bom ajuste. Inspecione os resíduos, que devem ser distribuídos aleatoriamente em torno de zero. </li><li> Histogramas vida de fluorescência deve acompanhar todas as imagens para uma fácil visualização de valores médios de vida de fluorescência, ea distribuição da vida de fluorescência. </li></ol> 3. Os resultados representativos Decai fluorescência medida parao rotor fluorescente molecular a aumentar a viscosidade em metanol / glicerol misturas são mostrados na fig. 2. Os decai de fluorescência são monoexponencial, eo tempo de vida de fluorescência varia marcadamente como uma função da viscosidade. Ela aumenta de cerca de 300 ps em metanol (viscosidade 0,6 cP) a 3,4 ns em glicerol 95% (cP viscosidade 950). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig2.jpg" /> Figura 2. Fluorescência perfis de decaimento para BODIPY-C em metanol 12 / glicerol misturas de viscosidade variando. 6 A curva de calibração logarítmica do tempo de vida de fluorescência τ contra viscosidade η para o rotor fluorescente molecular é mostrado na fig. 3. É uma linha reta como exigido pela equação de Hoffman Förster 9 <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq1.jpg" alt="Equação 1" /> onde k é a 0 radiativtaxa constante e e z e x são constantes, com 0 &lt;x &lt;1. Tomando o logaritmo sobre os rendimentos de ambos os lados <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq2.jpg" alt="Equação 2" /> onde x é o gradiente da linha recta. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig3.jpg" /> Figura 3. Um lote de viscosidade log log fluorescência vida vs para BODIPY C-12 produz uma linha reta de acordo com a equação Förster-Hoffmann. 6 Após a incubação de células vivas com o rotor fluorescente molecular uma distribuição corante ponteada é observada nas imagens de fluorescência. Imagens Flim de células HeLa incubadas com um corante BODIPY meso-substituída são mostrados na fig. 4. Os decai de fluorescência em cada pixel da imagem pode ser adequadamente ajustada utilizando um modelo de decaimento exponencial simples. Figura 4. (A) A intensidade da fluorescência e as imagens (b) Flim de células HeLa coradas com BODIPY-C 12. As regiões brilhantes e pontuam exibem uma vida mais curta do que outras regiões. Esta menor liftime corresponde a uma viscosidade mais baixa no puncta, gotículas provavelmente lipídicos, de acordo com a equação Förster-Hoffmann. Traçando os tempos de vida extraídos de cada pixel, obtém-se um histograma tempo de vida de fluorescência de toda a imagem, como mostrado na fig. 5. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig5.jpg" /> Figura 5. Histogramas de vidas de fluorescência a partir de imagens Flim de células HeLa coradas com meso-substituida rotores BODIPY moleculares.

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C., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> Journal of the Royal Society - Interface. 6, S93-S105 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

FLIM oferece algumas vantagens sobre a intensidade baseada em imagens de fluorescência. Pode informar sobre acontecimentos fotofísicas que são difíceis ou impossíveis de observar por imagem intensidade de fluorescência, porque pode separá-los contra os efeitos de concentração fluoróforo. Isto é particularmente útil para o mapeamento de viscosidade intracelular por imagem fluorescente rotores moleculares. O tempo de vida de fluorescência pode ser prontamente convertido em uma viscosidade usando um gráfico de calibração, como mostrado na fig. 3, independente da concentração de fluorescentes rotores moleculares. Em FLIM pode haver artefactos que possam complicar a interpretação dos dados. 10 artefactos incluem Instrumental luz dispersa que vai aparecer como um pico no topo do início do decaimento da fluorescência e pode ser confundida com um tempo de decaimento curto, ou um pequeno pico após o IRF que pode ser causada por reflexões no interior do microscópio. Estes artefactos de luz dispersos podem ser identificados como talporque eles podem ser distinguidos com a discriminação espectral - eles estão sempre no mesmo comprimento de onda da luz excitante. Lembrando que no ar, a luz viaja 30 cm em 1 nanossegundo ajuda a identificar a origem de reflexões. Filtro de vidro ou de fluorescência pode também causar um artefacto, especialmente a fluorescência da amostra baixa, mas isto pode ser facilmente identificado por tendo uma medição sem a amostra: se um decaimento é obtido sob estas circunstâncias, é devido ao instrumento e não tem nada a ver com a amostra! Por outro lado, note que autofluorescência amostra pode também contribuir para um decaimento da fluorescência. Em tempo de contagem correlacionada fotão único (TCSPC), tempo-para-amplitude conversor (TAC) não-linearidades podem causar ataques pobres, mas podem ser identificadas através do bloqueio da excitação e brilhante de luz ambiente, por exemplo, a partir da fonte de luz transmitida sobre a amostra e medindo o tempo. Um fundo deve ser constanteobtido em cada pixel da imagem. Regiões onde desvios a partir de um fundo constante ocorrer, nunca irá produzir um bom ajuste e deve ser evitado para a medição se eles não podem ser eliminados por ajustar os parâmetros para a placa de TCSPC. Um artefato é infame em TCSPC fóton pile-up que é causada por demasiado elevada taxa de detecção de um fóton. 11,12 Isto leva a apenas fóton o primeiro a ser cronometrado, ignorando os fótons subseqüentes porque os componentes eletrônicos são tempo ocupado e processar o primeiro fóton. Amontoado conduz a um encurtamento do tempo de vida de fluorescência, ea melhor maneira de evitar esta é a de manter a taxa de contagem de fotão em cerca de 1% da taxa de repetição do laser. Perspectiva Existem várias implementações de FLIM, e, dependendo da aplicação, cada um tem as suas vantagens e desvantagens. 13 microscópio de fluorescência O ideal seria adquirir a totalidade multidimensional fluorescência emission contorno de intensidade, posição, comprimento de onda da vida, e polarização em uma única medição, com sensibilidade de fóton único, resolução espacial máximo e mínimo tempo de aquisição. Não há atualmente tecnologia com esta combinação única de características, e para construir um continua sendo um desafio para os desenvolvedores de instrumentação. A aplicação de novas técnicas físicas para problemas importantes em biologia celular é muitas vezes o caminho para descobertas inesperadas, e há um longo caminho a percorrer antes de estarmos perto de saturar as capacidades de imagens de fluorescência para a biologia celular. Com efeito, os parâmetros de imagens de fluorescência, tais como tempo de vida, espectro e polarização, bem como uma imagem mais rapidamente em 3D com maior resolução espacial, são determinados para revelar novos aspectos da biologia celular.

Amostra com rotores moleculares fluorescentes Hardware: invertido Leica TCS SP2 microscópio confocal Coerente Mira 900 Ti: Sapphire laser de femtossegundos com um V6 Verdi bomba laser ou Hamamatsu PLP-10 470 picossegundos pulsados ​​diodo fontes de excitação laser Becker &amp; Hickl SPC 830 placa em 3GHz, Pentium IV, 1GB RAM do computador com o Windows XP cabeça Becker &amp; Hickl refrigerado PMC100-01 detector baseado em Hamamatsu H5773P-01 fotomultiplicadores, montado na porta microscópio X1, ou detectores de híbridos DCC 100 módulo de controle do detector Software: TRI-2 14 ou SPCImage 2,8 por Becker &amp; Hickl

fluorescence lifetime imaging of molecular rotors in living cells

A difusão é muitas vezes um passo de taxa de determinação importante nas reacções químicas ou processos biológicos e desempenha um papel em uma grande variedade de eventos intracelulares. A viscosidade é um dos parâmetros importantes que afectam a difusão de moléculas e proteínas, e as alterações na viscosidade têm sido associados a doença e mau funcionamento, ao nível celular. 1-3 Embora os métodos para medir a viscosidade a granel são bem desenvolvida, microviscosidade imagiologia permanece um desafio . Mapas de viscosidade de objectos microscópicos, tais como as células individuais, têm até recentemente sido difícil de obter. Viscosidade mapeamento com técnicas de fluorescência é vantajoso porque, semelhante a outras técnicas ópticas, é minimamente invasiva, não destrutivo e pode ser aplicado a células vivas e tecidos. Fluorescentes rotores moleculares exibem tempos de vida de fluorescência e os rendimentos quânticos que são uma função da viscosidade do seu microambiente. Torção intramolecular 4,5 ourotação leva a não-radiativa de decaimento da parte de trás estado animado para o estado fundamental. Um ambiente viscoso diminui essa rotação ou torção, restringindo o acesso a esta via decomposição não-radiativa. Isto leva a um aumento do rendimento quântico de fluorescência eo tempo de vida de fluorescência. Imagens Lifetime fluorescência (FLIM) de modificados corantes BODIPY hidrofóbicos que actuam como fluorescentes rotores moleculares mostram que o tempo de vida de fluorescência destas sondas é uma função do microviscosidade do seu ambiente. 6-8 Um gráfico logarítmico do tempo de vida de fluorescência versus os rendimentos viscosidade do solvente uma linha recta que obedece à equação Förster Hoffman. 9 Este lote também serve como uma curva de calibração para converter tempo de vida de fluorescência em viscosidade. Após a incubação de células vivas com o modificado BODIPY rotor fluorescente molecular, uma distribuição de corante ponteada é observada nas imagens de fluorescência. O valor da viscosidade obtida em poe puncta em células vivas é de cerca de 100 vezes maior do que a da água e do citoplasma celular. 6,7 tempo resolvido medições de anisotropia de fluorescência produzir tempos de correlação rotacional de acordo com estes valores microviscosidade grandes. Mapeamento o tempo de vida de fluorescência é independente da intensidade de fluorescência, e, assim, permite a separação de concentração da sonda e efeitos de viscosidade. Em resumo, temos desenvolvido uma abordagem prática e versátil para mapear o microviscosidade em células baseado em FLIM de fluorescentes rotores moleculares.

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Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Imagens Lifetime fluorescência (FLIM) emergiu como uma técnica de imagem chave para o meio ambiente e interacção de proteínas específicas e corantes em células vivas. FLIM de rotores moleculares fluorescentes permite o mapeamento de viscosidade em células vivas.

Imagem Lifetime fluorescência de rotores moleculares em células vivas

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.8K visualizações.  King's College London. Imagens Lifetime fluorescência (FLIM) emergiu como uma técnica de imagem chave para o meio ambiente e interacção de proteínas específicas e corantes em células vivas. FLIM de rotores moleculares fluorescentes permite o mapeamento de viscosidade em células vivas.

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Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Bioengenharia

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis Estudos de pulmão células de câncer usando um Multichannel Dual-elétrico-campo Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Realização de vários modos de imagem com um microscópio de fluorescência

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Medição da dinâmica de força-sensível da proteína em células vivas, usando uma combinação de técnicas fluorescentes

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built high viscous injector, Lipidico, as part of the macromolecular crystallography (MX2) beamline to measure large numbers of small crystals at room temperature. The goal of this technique is to enable crystals to be grown/transferred to&#160;glass syringes to be used directly in the injector for serial crystallography data collection. The advantages of this injector include the ability to respond rapidly&#160;to changes in the flow rate without interruption of the stream. Several limitations for this high viscosity injector (HVI) exist which include a restriction on the allowed sample viscosities to &#62;10 Pa.s. Stream stability can also potentially be an issue depending on the specific properties of the sample. A detailed protocol for how to set up samples and operate the injector for serial crystallography measurements at the Australian synchrotron is presented here. The method demonstrates preparation of the sample, including the transfer of lysozyme crystals into a high viscous media (silicone grease), and the operation of the injector for data collection at MX2.

The goal of this protocol is to demonstrate how to prepare serial crystallography samples for data collection on a high viscous injector, Lipidico, recently commissioned at the Australian synchrotron.

Protocolo de injeção de lipidico para medições de cristalografia serial no Síncrotron Australiano

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Tensão controlada de hidrogéis 3D sob imagem de microscopia ao vivo

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...