Name: optical control of living cells electrical activity by conjugated polymers
Uploaded: 2016-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
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The work was supported by EU through project FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA, 
Telethon - Italy (grants GGP12033 and GGP14022), Fondazione Cariplo (grant ID 2013-0738).

1. Preparação de Substratos fotoactivos <ol><li> Prepara-se uma P3HT: PCBM solução (1: 1 w / w) em clorobenzeno a uma concentração P3HT a 20 g / L. Misture a solução com um agitador magnético durante pelo menos 4 h a 60 ° C. Considere-se um volume de 150 ul de solução para cada substrato a ser preparado. </li><li> Limpas lâminas de vidro revestido de ITO (R-S = 10 Ω / sq, 18x18 mm 2, espessura 170 um) com lavagens sucessivas de água desionizada, acetona e isopropanol num sonicador (10 minutos para cada etapa). Seque as lamelas com uma arma de azoto. Coloque as amostras em um aspirador de plasma potência de 100 W durante 10 minutos. </li><li> Depositar uma película fina de a camada activa sobre os substratos limpos através de spin-coating. <ol><li> Com uma ponta de diamante, corte uma lâmina de vidro de microscópio, (≈ espessura 1 mm) para as mesmas dimensões laterais dos substratos revestidos com ITO. Remover o P3HT: PCBM solução de a placa de aquecimento e deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente. </li><li> Definir um dois-steps programa spin-coater: i) 30 segundos a 800 rpm; ii) 30 segundos a 1.600 rpm. Coloque o slide no mandril do spin-coater e iniciar o vácuo para corrigi-lo. Colocar uma gota de acetona na corrediça e, em seguida, o substrato limpo, com o lado do ITO voltado para cima-revestido. Comece a rotação spin-coater para se livrar do excesso de acetona. </li><li> Coloque 150 ul de P3HT: solução PCBM sobre os substratos e começar de novo o spin-coater (usar o mesmo protocolo descrito em 1.3.2). </li><li> Após o spin-coater tiver terminado, retire a amostra e retire cuidadosamente o substrato revestido a partir da lâmina de vidro. Limpar a parte de trás do substrato com um cotonete de sala limpa embebido em acetona. Nota: Os substratos fotoactivos pode ser armazenado durante alguns dias numa caixa escura até à sua utilização. Para períodos mais longos, mantê-los em uma caixa de luvas com gás inerte. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de Cultura de Células de médio e Eletrofisiologia Solutions <ol><li> Prepara-se o meio de crescimento completo (CGM) paraCélulas HEK-293: Dulbecco meio de Eagle modificado (DMEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) inactivado pelo calor não, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina. Esteriliza-se o meio com um sistema de filtração de 0,2 um e armazenar a 4 ° C. </li><li> Preparar a solução extracelular em água ultrapura (concentrações em mM): 135 NaCl, KCl 5,4, 5 HEPES, 10 de glucose, 1,8 CaCl 2, 1 MgCl2. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH. Esterilizar a solução com um sistema de filtração de 0,2 um e armazenar a 4 ° C. </li><li> Preparar a solução intracelular em água ultrapura (concentrações em mM): KCl 12, 125 K-gluconato, 1 de MgCl2, 0,1 de CaCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 de ATP-Na2. Note-se que o ATP-Na 2 é sensível ao calor e adicioná-lo pela última vez. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH. Esterilizar a solução com um sistema de filtração de 0,2 um, da alíquota em tubos de 1 ml e armazenar a -20 ° C. </li></ol> 3. chapeamento HEK-293sobre os substratos Activo <ol><li> Colocar o substrato fotoactivo em um copo de vidro coberto com alumínio ou uma placa de Petri fechada e colocar num forno a 120 ° C durante 2 horas, para a esterilização. A partir desse momento, realizar todas as operações em condições estéreis. Coloque as amostras em uma capa estéril e deixe-os arrefecer. </li><li> Revestir o substrato fotoactivo com uma camada de adesão para reduzir a hidrofobicidade de superfície e para promover a adesão celular. <ol><li> Coloque os substratos ativos em uma placa de Petri P35 ou uma placa com múltiplas cavidades 6. Dada a hidrofobia da camada de polímero conjugado, fazer um polidimetilsiloxano (PDMS) também para fixar a amostra e confinar as soluções. <ol><li> Misturar PDMS e catalisador em uma mistura 10: 1 de proporção com uma vareta de vidro para se obter uma suspensão viscosa. </li><li> Verter a suspensão em uma placa com múltiplas cavidades 6, distribuir uma quantidade suficiente para cobrir a metade de cada poço. </li><li> Espere por polimerização PDMS em RT. </li><li> Corte as PDMS curado no meio para obtaining uma forma quadrada da mesma dimensão da amostra de polímero. </li><li> Esteriliza-se o PDMS poços por imersão em uma mistura de etanol-água a 70% durante pelo menos 30 min. </li></ol></li><li> Se bem usando os PDMS, arranhar a camada fotoactivo ao longo de toda a borda do poço com uma pinça de pontas, a fim de evitar o desprendimento da camada inteira quando a remoção do PDMS bem após a cultura de célula. </li><li> Cobrir toda a superfície de cada uma das amostras com uma solução de fibronectina (2 mg / L em PBS). Um volume entre 500-750 mL por amostra é geralmente suficiente se um PDMS bem é utilizado (superfície clara do bem: 15x15 mm 2). Sem o PDMS assim, cerca de 2 ml de solução de fibronectina são necessárias para imergir completamente a amostra; prestar atenção que o substrato não flutua na adição da solução. Incubar as amostras a 37 ° C durante pelo menos 1 h. </li><li> Remover a solução de fibronectina com uma pipeta de vidro e lavar uma vez com 2 ml de PBS. </li></ol></li><li> PlComeram células HEK-293 em amostras tratadas com fibronectina a uma densidade de 15.000 células / cm2 em meio de crescimento completo. Utilizar um volume de 750-1.000 ul de CGM para cada amostra, se um PDMS poço é usado, caso contrário, 2-3 ml de CGM são necessárias. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24-48 horas. </li></ol> 4. Optical Stimulation Protocolo e Medidas eletrofisiológicas <ol><li> Coloque a solução extracelular num banho de água a 37 ° C a thermalize; descongelar a solução intracelular, colocá-lo em uma seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 34 e mantê-lo em contato com o gelo para evitar a degradação do ATP. </li><li> Tomar um substrato revestido de células a partir do incubador e remover cuidadosamente o PDMS bem se presente. Remova o meio de crescimento com uma pipeta de vidro e enxaguar a amostra com solução extracelular. Prossiga lentamente para evitar desprendimento de células. </li><li> Coloque o dispositivo para dentro do porta-amostras da estação de electrofisiologia com solutio extracelularn eo eletrodo de referência. Preparar uma solução de micropipetas de vidro para patch-clamp com um puxador (resistência ideal é na gama de 2-4 MQ). Encha metade da pipeta com solução intracelular e montá-lo na micromanipulador. </li><li> Procure uma célula saudável para patch no dispositivo. Para evitar a excitação não desejada do substrato fotoactivo, utilize iluminação IR para a imagiologia, a colocação de um filtro de passagem de comprimento de onda longo (por exemplo, um corte de comprimento de onda λ = 750 nm, pode ser utilizado para os polímeros de absorção no visível) na frente do iluminador microscópio. </li><li> Remendo da célula seleccionada e aplicar o protocolo desejado para a estimulação óptica através da apresentação de luz para a amostra através do caminho de excitação de fluorescência do microscópio (Figura 1). Uma descrição detalhada do protocolo de patch-clamp podem ser encontrados na referência 20. <ol><li> Posicionar a pipeta de adesivo em estreita proximidade com a membrana celular com um manipulador micrométrica. Durante o posicionamento, aplicar overpressurE para a pipeta, a fim de evitar a aderência sujidade na ponta. A pipeta deve ser alguns mícrons acima da célula. </li><li> Começar a baixar a pipeta para a membrana celular, enquanto controla a resistência pipeta sobre o software de controle de patch. Quando a resistência da pipeta aumentou cerca de 1 mohms, remover a sobrepressão da pipeta durante a aplicação de uma sucção suave, a fim de formar o gigaseal entre a pipeta e a membrana da célula (isto é, a resistência medida deve aumentar para valores superiores a 1 GÊ) . </li><li> Aplicar um potencial negativo para a pipeta junto à célula esperado potencial de repouso (por célula HEK293 um potencial de -40 mV podem ser usados) para ajudar a estabilizar o vedante. Compensar os transientes capacitivos devido à capacitância pipeta com os comandos relativos, o amplificador de patch e / ou o software de controlo de remendo. </li><li> Quebrar a membrana para permitir o acesso eléctrico para o citoplasma da célula por aplicação de um breve pulso de sucção e intensapara a pipeta. Definir o amplificador de patch para o modo de fixação de corrente (i = 0, ou seja, sem corrente injectada para dentro da célula) para controlar o potencial de membrana celular. Espera alguns minutos para ver se o potencial da célula é estável. </li><li> Aplicar o protocolo de iluminação desejado para a célula e registar o efeito sobre o potencial de membrana. Nota: A iluminação pode ser entregue à amostra, quer a partir do fundo ou do topo, dependendo da arquitectura do microscópio. <ol><li> Seleccionar um comprimento de onda de excitação que é bem absorvido pelo material activo; para o P3HT: PCBM mistura, um comprimento de onda na gama de 450-600 nm podem ser usados. Densidades fotoexcitação adequados estão na gama de 10-100 mW / mm 2. Nota: pulsos curtos de luz (abaixo de 10-20 ms) resultam de uma despolarização transiente da célula, enquanto que com iluminação prolongada (centenas de milisegundos ou mais) de pulsos hiperpolarização prolongada é observado até que a luz é desligada. </li></ol></li&gt; </ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

As etapas críticas do protocolo relatado para in-vitro estimulação óptica de células essencialmente com a escolha do polímero sensível à luz, os parâmetros de esterilização térmica, a intensidade ea duração dos estímulos luminosos. A P3HT: película fina PCBM foi selecionada aqui, uma vez que garante uma boa estabilidade temporal e eletroquímica. No entanto, deve-se notar que nem todos os polímeros sensíveis à luz pode oferecer performances analógicos, 22, mais especificamente, so...

A possibilidade de manipular a actividade celular com uma resolução espacial e temporal precisa representa uma estratégia importante na investigação neuroscientific e no tratamento de distúrbios neurológicos e psiquiátricos. 1 Os métodos tradicionais são baseados na estimulação eléctrica de células usando eléctrodos posicionado na proximidade ou em contacto com o sistema-alvo, 2 que pode ser de complexidade diferente (célula única rede celular, fatias de cérebro, in vivo tecidos cerebrais). Durante o século passado, o uso de patch-clamp, metal e eletrodos integrados de substrato proporcionaram um quadro detalhado da fisiologia e fisiopatologia de neurônios individuais e dos mecanismos de funcionamento das redes neurais. No entanto, a estimulação elétrica sofre de limitações importantes. O primeiro está relacionado com uma resolução espacial geralmente pobres devido às dimensões físicas dos eléctrodos e sua geometria fixa, que não pode ser facilmente adaptadopara sistemas complexos organizados como tecidos biológicos. Além disso, os problemas relacionados com a impedância de eléctrodos e de conversas cruzadas entre os sistemas de estimulação e de registo pode deteriorar-se a proporção final de sinal-para-ruído das medições. 3 Por outro lado, o uso de luz para a estimulação pode ajudar a superar muitas limitações da abordagem eléctrica. Primeiro de tudo, oferece espacial sem precedentes (&lt;1 mm) e a resolução temporal (&lt;1 ms), tornando-se possível para atingir tipos celulares específicos ou mesmo compartimentos sub-celulares. Além disso, é altamente não-invasivo, uma vez que evita qualquer contacto físico com o tecido de interesse e disentangles estimulação de gravação. Além disso, tanto a intensidade da luz de comprimento de onda e pode ser regulada com precisão e, consequentemente, diferentes protocolos de estimulação pode ser aplicada. 3,4 No entanto, a grande maioria das células de animais não apresentam sensibilidade específica à luz. Várias estratégias para stimulatio ópticoN foram assim propostas, quer explorando mediadores moleculares sensível à luz próxima ou no interior das células, ou utilizando um dispositivo fotoactivo colocado externamente, perto da célula. A primeira categoria refere-se a mecanismos endógenos como a estimulação através de (IR) de luz infravermelha ou visível, bem como a utilização quer de compostos photoisomerizable / fotoclivável ou a expressão genética de actuadores moleculares fotossensíveis (Optogenetics). Esta última classe inclui técnicas de estimulação exógena alcançado com o uso de nano / micro-partículas inorgânicas ou substratos de silício fotocondutoras. 5 No entanto, todos estes sistemas têm lados e inconvenientes brilhantes. Em particular, a absorção de células endógenas na gama do visível é fraco e não é fiável, e a geração concomitante de espécies de oxigénio reactivas pode ser prejudicial para a célula. Em geral, RI é usado para a indução de aquecimento térmico local, devido à absorção de água, mas o coeficiente de extinção de água é pequena, necessitando assim de rRong luz infravermelha (a partir de dezenas a centenas de W / mm2), que é difícil de entregar através de microscopia óptica padrão e podem representar as preocupações de segurança para aplicações in vivo. Por outro lado, os compostos de enjaulamento foto-comutável têm uma ação limitada de tempo e muitas vezes necessitam de luz UV que é difícil de entregar devido à penetração nos tecidos limitado. Além disso, eles sofrem de problemas de difusão dos compostos activada após fotólise fora da área iluminada. Finalmente, ferramentas optogenética permitiram aos cientistas direcionar subpopulação celular específica e sub-compartimentos e estão a emergir rapidamente como uma das tecnologias-chave na pesquisa neurocientífica. No entanto, a inserção de um segmento de DNA exógeno através de um vetor viral levanta questões importantes de segurança, especialmente em vista da adopção, em pacientes humanos. 5,6 Por estas razões, a investigação sobre novos materiais e dispositivos capazes de manipulação óptica celular é um tema extremamente quente. Recentemente, um romanceabordagem com base na utilização de polímeros conjugados sensíveis à luz, capaz de transduzir eficientemente um estímulo óptico numa modulação da actividade eléctrica da célula, tem sido proposto. A estimulação das células por Polymer fotoexcitação (CSPP) técnica explora muitas características-chave de habilitação típico de semicondutores orgânicos: são intrinsecamente sensível à luz na faixa visível; 7 eles são biocompatíveis, macio e moldável e sua flexibilidade mecânica permite uma interface íntimo com o tecido tanto in vitro e in vivo 8-10. Além disso, eles podem ser facilmente funcionalizados para uma melhor adaptação à interface com células vivas, e para permitir a excitação específica, sentindo capacidades sondagem e 11,12. Além disso, eles oferecem suporte electrónico, bem como transporte iônico, tornando-os ideais para a combinação da biologia anúncio eletrônica 13,14 Curiosamente., eles podem trabalhar no modo fotovoltaico, evitando a necessidade de aplicar um viés externo f15 ou a estimulação da célula óptica eficiente. A fiabilidade da técnica CSPP foi anteriormente demonstrada em vários sistemas, incluindo neurónios primárias, 15,16 astrócitos, 17 linhas de células secundárias 18 e tecidos da retina explantados. 16 Neste trabalho, todos os passos necessários para o fabrico de um bio-polímero sensível à luz de interface 19 para a estimulação óptico de sistemas in vitro são descritos em detalhe. Como estudo de caso, uma mistura fotovoltaica orgânica prototípico da região regular poli (3-hexiltiofeno) (rr-P3HT), funcionando como o doador de elétrons, e éster de fenil-C61-butírico-ácido-metil (PCBM), atuando como o receptor de elétrons é empregado. À medida que o sistema biológico, rim embrionário humano (HEK-293), as células são usadas. Um exemplo de um protocolo fotoestimulação com a gravação relativa da actividade das células através de medições electrofisiológicas é fornecido. A plataforma descritoNo entanto, é de aplicabilidade geral, e pode ser facilmente adaptado para o uso de outros polímeros conjugados (ajustando adequadamente o processo de solução de preparação e os parâmetros de deposição), diferentes tipos de células (por mudar apropriadamente o protocolo de cultura de células, chapeamento procedimento e tempo requerido para semeadura e proliferação celular) e diferentes protocolos de estimulação (comprimento de onda de luz, estímulos de frequência e duração, densidade fotoexcitação).

<table><tbody><tr><td>rr-P3HT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>698989-5G</td><td></td></tr><tr><td>ITO-coated substrates</td><td>Nano-CS</td><td>IT10300100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>chlorobenzene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319996</td><td></td></tr><tr><td>PCBM</td><td>Nano-C</td><td>Nano-CPCBM-BF</td><td></td></tr><tr><td>acetone&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270725</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>HEK cells</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>E-MEM</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-30-2003</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8008-</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-30-2020</td><td></td></tr></tbody></table>

optical control of living cells electrical activity by conjugated polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

As células podem ser facilmente cultivadas em P3HT: substratos PCBM, desde que uma camada de adesão é depositado adequado (como a fibronectina usado no passo 3.2 do protocolo descrito). P3HT: PCBM picos de absorção óptica na parte verde do espectro visível; No entanto, outros polímeros conjugados sensíveis à luz pode ser seleccionada, de acordo com a faixa de comprimentos de onda preferida fotoestimulação (Figura 2). A biocompatibilidade destes substratos foi...

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Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

optical-control-living-cells-electrical-activity-conjugated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K visualizações.  Istituto Italiano di Tecnologia. A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

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An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Um método de Optogenetic para controlar e analisar os padrões de expressão de Gene em interações de célula para célula

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Genética

Monitoring the Effects of Illumination on the Structure of Conjugated Polymer Gels Using Neutron Scattering

We demonstrate a protocol to effectively monitor the gelation process of a high concentration solution of conjugated polymer both in the presence and absence of white light exposure. By instituting a controlled temperature ramp, the gelation of these materials can be precisely monitored as they proceed through this structural evolution, which effectively mirrors the conditions experienced during the solution deposition phase of organic electronic device fabrication. Using small angle neutron scattering (SANS) and ultra-small angle neutron scattering (USANS) along with appropriate fitting protocols we quantify the evolution of select structural parameters throughout this process. Thorough analysis indicates that continued light exposure throughout the gelation process significantly alters the structure of the ultimately formed gel. Specifically, the aggregation process of poly(3-hexylthiophene-2,5-diyl) (P3HT) nano-scale aggregates is negatively affected by the presence of illumination, ultimately resulting in the retardation of growth in conjugated polymer microstructures and the formation of smaller scale macro-aggregate clusters.

A protocol for the analysis of gels formed from the optoelectronic conjugated polymer poly(3-hexylthiophene-2,5-diyl) (P3HT) using small and ultra-small angle neutron scattering in both the presence and absence of illumination is presented.

Monitorização dos efeitos de iluminação sobre a estrutura do polímero conjugado géis usando Neutron Scattering

We demonstrate a protocol to effectively monitor the gelation process of a high concentration solution of conjugated polymer both in the presence and ...

Química

Fabrication of Polymer Microspheres for Optical Resonator and Laser Applications

This paper describes three methods of preparing fluorescent microspheres comprising &#960;-conjugated or non-conjugated polymers: vapor diffusion, interface precipitation, and mini-emulsion. In all methods, well-defined, micrometer-sized spheres are obtained from a self-assembling process in solution. The vapor diffusion method can result in spheres with the highest sphericity and surface smoothness, yet the types of the polymers able to form these spheres are limited. On the other hand, in the mini-emulsion method, microspheres can be made from various types of polymers, even from highly crystalline polymers with coplanar, &#960;-conjugated backbones. The photoluminescent (PL) properties from single isolated microspheres are unusual: the PL is confined inside the spheres, propagates at the circumference of the spheres via the total internal reflection at the polymer/air interface, and self-interferes to show sharp and periodic resonant PL lines. These resonating modes are so-called "whispering gallery modes" (WGMs). This work demonstrates how to measure WGM PL from single isolated spheres using the micro-photoluminescence (&#181;-PL) technique. In this technique, a focused laser beam irradiates a single microsphere, and the luminescence is detected by a spectrometer. A micromanipulation technique is then used to connect the microspheres one by one and to demonstrate the intersphere PL propagation and color conversion from coupled microspheres upon excitation at the perimeter of one sphere and detection of PL from the other microsphere. These techniques, &#181;-PL and micromanipulation, are useful for experiments on micro-optic application using polymer materials.

Protocols for the synthesis of microspheres from polymers, the manipulation of microspheres, and micro-photoluminescence measurements are presented.

Fabricação de Microsferas de Polímeros para Resonadores Ópticos e Aplicações Laser

This paper describes three methods of preparing fluorescent microspheres comprising &#960;-conjugated or non-conjugated polymers: vapor diffusion, ...

Engenharia

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve intracellular structures and the dynamics of biomolecules with ~20 nm precision. A prerequisite for SMLM are fluorophores that transition from a dark to a fluorescent state in order to avoid spatio-temporal overlap of their point spread functions in each of the thousands of data acquisition frames. BODIPYs are well-established dyes with numerous conjugates used in conventional microscopy. The transient formation of red-shifted BODIPY ground-state dimers (DII) results in bright single molecule emission enabling single molecule localization microscopy (SMLM). Here we present a simple but versatile protocol for SMLM with conventional BODIPY conjugates in living yeast and mammalian cells. This procedure can be used to acquire super-resolution images and to track single BODIPY-DII states to extract spatio-temporal information of BODIPY conjugates. We apply this procedure to resolve lipid droplets (LDs), fatty acids, and lysosomes in living yeast and mammalian cells at the nanoscopic length scale. Furthermore, we demonstrate the multi-color imaging capability with BODIPY dyes when used in conjunction with other fluorescent&#160;probes. Our representative results show the differential spatial distribution and mobility of BODIPY-fatty acids and neutral lipids in yeast under fed and fasted conditions. This optimized protocol for SMLM can be used with hundreds of commercially available BODIPY conjugates and is a useful resource to study biological processes at the nanoscale far beyond the applications of this work.&#160;

Conventional BODIPY conjugates can be used for live-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) through exploitation of their transiently forming, red-shifted ground state dimers. We present an optimized SMLM protocol to track and resolve subcellular neutral lipids and fatty acids in living mammalian and yeast cells at the nanoscopic length scale.

Conjugados BODIPY convencionais para microscopia de super-resolução de células vivas e rastreamento de moléculas únicas

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Bioquímica

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular processes. There is a need for culturing and measuring systems that incorporate programmed illumination and stimulation of optogenetic systems. We present a protocol for building and using a continuous culturing apparatus to illuminate microbial cells with programmed doses of light, and automatically acquire and analyze images of cells in the effluent. The operation of this apparatus as a chemostat allows the growth rate and the cellular environment to be tightly controlled. The effluent of the continuous cell culture is regularly sampled and the cells are imaged by multi-channel microscopy. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses in the fluorescence intensity and cellular morphology of cells sampled from the culture effluent are measured over multiple days without user input. We demonstrate the utility of this culturing apparatus by dynamically inducing protein production in a strain of Saccharomyces cerevisiae engineered with an optogenetic system that activates transcription.

We designed a continuous culturing apparatus for use with optogenetic systems to illuminate cultures of microbes and regularly image cells in the effluent with an inverted microscope. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses to illumination can be measured over several days.

Design e Implementação de um Automated Illuminating, A cultura e sistema de amostragem para Aplicações Microbial optogenética

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Bioengenharia

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Controlo óptico de uma proteína neuronal utilizando um ácido Unnatural Amino geneticamente codificados em neurónios

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Neurociência

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

Engenharia confiável e controle de circuitos genéticos estáveis em células mamíferas

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular compartments while circumventing complications arising from natural cell-to-cell variations. To standardize cell shape, cells are either confined in 3D molds or controlled for adhesive geometry through adhesive islands. However, traditional micropatterning techniques based on photolithography and deep UV etching heavily depend on clean rooms or specialized equipment. Here we present an infrared laser assisted micropatterning technique (microphotopatterning) modified from Doyle et al. that can be conveniently set up with commercially available imaging systems. In this protocol, we use a Nikon A1R MP+ imaging system to generate micropatterns with micron precision through an infrared (IR) laser that ablates preset regions on poly-vinyl alcohol coated coverslips. We employ a custom script to enable automated pattern fabrication with high efficiency and accuracy in systems not equipped with a hardware autofocus. We show that this IR laser assisted micropatterning (microphotopatterning) protocol results in defined patterns to which cells attach exclusively and take on the desired shape. Furthermore, data from a large number of cells can be averaged due to the standardization of cell shape. Patterns generated with this protocol, combined with high resolution imaging and quantitative analysis, can be used for relatively high throughput screens to identify molecular players mediating the link between form and function.

The protocol presented here enables automated fabrication of micropatterns that standardizes cell shape to study cytoskeletal structures within mammalian cells. This user-friendly technique can be set up with commercially available imaging systems and does not require specialized equipment inaccessible to standard cell biology laboratories.

Controle da Geometria Celular através de Micropatterning Assistido por Laser Infravermelho

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

A Cardiac Microphysiological System for Studying Ca2+ Propagation via Non-genetic Optical Stimulation

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely accepted by the scientific community, these systems are still limited in longevity due to the absence of non-invasive stimulation techniques. Phototransducers provide an efficient stimulation method, offering a wireless approach with high temporal and spatial resolution while minimizing invasiveness in stimulation processes. In this manuscript, we present a fully optical method for stimulating and detecting the activity of an in vitro cardiac microphysiological model. Specifically, we fabricated engineered laminar anisotropic tissues by seeding human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) generated in a 3D bioreactor suspension culture. We employed a phototransducer, an amphiphilic azobenzene derivative, named Ziapin2, for stimulation and a Ca2+ dye (X-Rhod 1) for monitoring the system&#39;s response. The results demonstrate that Ziapin2 can photomodulate Ca2+ responses in the employed system without compromising tissue integrity, viability, or behavior. Furthermore, we showed that the light-based stimulation approach offers a similar resolution compared to electrical stimulation, the current gold standard. Overall, this protocol opens promising perspectives for the application of Ziapin2 and material-based photostimulation in cardiac research.

Using light to control cardiac cells and tissue enables non-contact stimulation, thereby preserving the natural state and function of the cells, making it a valuable approach for both basic research and therapeutic applications.

Um sistema microfisiológico cardíaco para estudar a propagação de Ca2+ via estimulação óptica não genética

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely ...