Os autores agradecem ao Dr. Paul Janmey na Universidade da Pensilvânia, para a prestação de linhas celulares utilizadas neste trabalho. QW também reconhecer JF Byfield e Evan Anderson para suas discussões criteriosas sobre técnicas de AFM.

1. Calibrar a constante da mola do cantilever <ol><li> Carregar o cantilever na AFM de acordo com as instruções do fabricante. É necessário limpar o titular do cantilever com etanol antes de todas as experiências. Isto irá ajudar a limitar a contaminação da cultura bacteriana durante as medidas de AFM. </li><li> Calibrar InvOLS (sensibilidade Lever Optical Inverse). Este parâmetro descreve a quantidade de resposta do fotodiodo (Volts) por nanómetro de deflexão do cantilever. </li><li> Coloque uma lâmina de vidro limpa para o estágio da amostra, em seguida, instala na cabeça AFM e ajustar o alinhamento do feixe de laser e de acordo com as instruções do fabricante. Envolver a ponta do AFM sobre a lâmina de vidro. </li><li> Com o piezo retirado, realinhar o espelho para uma leitura fotodiodo de -2 V. realizar uma medição de espectroscopia de força com um ponto de disparo (resposta máxima fotodiodo) de 2 V. </li><li> Com o piezo retirado, realinhar o espelho para uma leitura fotodiodo de -2 V. Realizar uma force medição espectroscopia com um ponto de disparo (resposta máxima fotodiodo) de 2 V. Nota: Os valores de tensão aqui são específicas para o Asilo AFM. Esse valor deve ser definido de acordo com as especificações fornecidas pelo fabricante. Após a aquisição de dados está completa, o zoom para a região de contacto de firme a curva da força. Realizar um ajuste linear a esta região para encontrar o declive, o que irá estar em V / nm. O valor recíproco da presente descreve a sensibilidade óptica do conjunto cantilever fotodiodo. </li><li> Redefinir o alinhamento espelho para uma deflexão livre de 0 V. </li><li> Calibrar a mola cantilever constante. Um método térmico de sintonia é usado para determinar a constante de mola cantilever 28. </li><li> Após calibragem dos InvOLS, aumentar o scanner afastada da fase da amostra de tal modo que não há interacções entre a ponta ea amostra. </li><li> Começar a capturar dados térmicos. Durante este processo, a vibração térmica do cantilever é Recorded. O software AFM analisa um espectro de uma vibração e parcelas em uma janela de dados térmica tal poder. </li><li> Depois de alguns segundos de aquisição de dados, executar um ajuste para o segmento de dados centralizada ao menor frequência (ressonância fundamental), pico de determinar a constante da mola. </li></ol> 2. Carregando o Sample <ol><li> Instale o acessório aquecedor Dish no palco AFM, se já não estiver equipada. </li><li> Ajustar a temperatura para 37 ° C, e esperar, durante 20 minutos para que o sistema atinja um equilíbrio térmico estável. </li><li> Colocar a placa de cultura na fase de AFM e fixá-lo usando a braçadeira fornecida com o aquecedor de prato. É importante minimizar o tempo entre a remoção do prato da incubadora e colocando-o sobre o palco, para evitar o trauma para as células. Para medições mais longos do que 30 minutos, 2 médias independentes CO deveria ser utilizada para substituir o meio de cultura normal. </li><li> Aplicar uma pequena gota de 37 ° C, meio de cultura para a ponta de tele AFM cantilever, e baixar a cabeça até a ponta do AFM é apenas submerso no líquido. </li><li> Utilizando a câmara superior com vista CCD, realinhar o feixe de laser sobre o braço de suporte (o alinhamento no estado líquido irá ser diferente do que no ar, devido à alteração no índice de refracção do meio). </li><li> Envolver a ponta do AFM em uma área limpa da placa de cultura. </li><li> Executar a calibragem dos InvOLS como acima descrito, para a sensibilidade do cantilever no meio líquido. </li></ol> Nota: a) Se as células são cultivadas em hidrogéis, a calibração de InvOLS devem ser realizados em avanço contra a superfície de fundo de um prato de cultura cheio com meio de cultura celular. Ao mudar para amostras de células, uma atenção especial deve ser dada para não mudar o alinhamento do feixe de laser com o cantilever. b) InvOLS tem de ser recalibrada sempre que houver uma alteração no alinhamento do laser. c) Recomenda-se também a tomar InvOLS como a média de valor de várias curvas de calibração, sesde a cada calibração que gera um diferente InvOLS. A variação no InvOLS é, contudo, pequena em comparação com o valor médio. Por exemplo, calibrar um Bruker DNP-10 cantilever com constante de 0,06 N / m em líquido por 100 vezes primavera produzir um valor médio InvOLS de 66,3 nm / V, com desvio padrão de apenas 0,5 nm / V. 3. Coleta de curvas força de recuo celular <ol><li> Selecione uma célula para recuo. Com o auxílio do microscópio óptico, a fase de mover a posição do braço de suporte acima da pilha de modo que a ponta está situada na região peri-núcleos. Ajuste preciso da posição do braço de suporte pode ser conseguida através da aplicação de deslocamentos para o X e Y scanners. Nota: O cantilever AFM tem de ser retirado da superfície da amostra, enquanto se deslocam a fase de amostra para seleccionar uma célula alvo. Isso protege o cantilever de bater na amostra, uma vez que a superfície da amostra não pode ser plana. </li><li> Mudar para forçar o modo de Espectroscopia. Definir o recuotaxa dentro da gama de 1-10 mM / seg, suficientemente baixa para evitar efeitos hidrodinâmicos. </li><li> Definir o ponto de disparo de deflexão, que limita a força de recuo máximo para evitar danos para as células. Seleccione a opção de disparo relativo, que irá corrigir qualquer desvio no sinal de deflexão. A força máxima de 2 nn é um bom ponto de partida para a maioria das amostras. Este valor, no entanto, devem ser ajustados de acordo com a rigidez da amostra. Para as amostras macias um valor mais baixo deve ser usado para evitar o recuo excessivo para a amostra. Para amostras rígidas um valor alto deve ser usado para gerar recuo mensurável. </li><li> Definir a distância força suficientemente grande para garantir que a ponta estará completamente separada da célula entre as medições de força. Geralmente, a distância força é fixado em 5 um. </li><li> Comandar o AFM para tomar uma curva de força única. </li><li> Recolher pelo menos três curvas de força em diferentes locais na região peri-núcleo de cada célula. Embora seja vantajoso ter múltiplascurvas em cada célula de dados estatísticos fiáveis, tendo muitas curvas de força pode levar a mudanças na rigidez da célula devido ao estresse da sonda AFM. </li><li> Quando a coleta de dados estiver concluída, retire a ponta, e repita os passos de 3,1-3,6 para o maior número de células, conforme necessário para bons dados estatísticos sobre a rigidez da célula sob uma determinada condição de amostra. Normalmente, as células 30 são medidos para cada condição. </li></ol> Para caracterizar a distribuição de rigidez dentro de uma única célula, o modo de mapa de força é aplicada. No modo Force-mapa, definir um tamanho de digitalização para incluir a região de interesse, definir uma resolução adequada, definir os parâmetros de recuo como os selecionados para as curvas de força única, o AFM será então raster em toda a área da amostra definida e ter curvas única força em cada pixel na região da amostra. 4. Análise de Dados As curvas de força registados são analisados ​​utilizando um procedimento MATLAB personalizado para calcular a rigidez da célula. A seguir, uma breve descrição do procedimento MATLAB: <ol><li> O programa Matlab identifica o ponto de contacto coordenadas z0 e d0 (ver figura 1), utilizando um algoritmo adoptada a partir de um método publicado por Lin et al 29.: </li><li> Para cada ponto de dados da curva de força, realizar um ajustamento linear dos dados para a esquerda do ponto de interesse, e um modelo de Hertz apto para a direita (com o ponto seleccionado como o ponto de contacto inicial), até o conjunto recuo máximo (200-300 nm recomendado). </li><li> Para cada ponto, calcular o erro RMS relativa de ambas as convulsões e somar esses valores. </li><li> O ponto que atinge o erro total mínimo adequado é selecionado como o ponto inicial de contato. Nota: O tempo de cálculo pode ser reduzida através da aplicação de uma pesquisa de secção dourada, em vez de digitalização linear da curva de força inteira. </li><li> Amostra δ deformação e recuo força F é calculado como: <img alt="Equação 1"fo: content-width = &quot;3.073in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1.jpg&quot; /&gt; </li><li> Um quadrados de montagem é aplicada a pelo menos encaixar a F vs δ dados na região pós-contacto, z ≥ z 0, para o modelo de Hertz para extrair o módulo de Young, E da célula: <img alt="Equação 2" fo:content-width="2.773in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2.jpg" /> , Onde v é o coeficiente de Poisson. Nota: Quando δ é mais do que 10% da espessura da amostra (altura da célula), a rigidez da célula medida é afectada pela rigidez do substrato. A espessura da região peri-nuclear é geralmente na ordem de alguns micrómetros. Portanto, somente os primeiros 200-300 nm de F-δ curva está apto para o modelo de Hertz. </li></ol>

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A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+effect+on+RhoA+signaling+modulation+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells.</a> Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de recuo AFM tem vantagens para caracterizar as propriedades mecânicas de células vivas. Embora menos sensível do que a citometria de torção magnética e pinças ópticas, que pode medir forças no nível piconewton 32, o AFM pode detectar a força de resistência de amostras variando de dezenas de pico-Newton para centenas de nano-Newton, comparáveis ​​a gama de força que pode ser aplicado a células utilizando uma micropipeta 19. Esta gama de força se adapta às necessidades...

As propriedades mecânicas, em especial a rigidez, de células individuais e as suas áreas de matrizes extracelulares (ECM) são críticos para muitos processos biológicos incluindo o crescimento celular, motilidade, divisão, diferenciação e na homeostase de tecido. Uma Foi demonstrado que a rigidez mecânica da célula é determinada principalmente pela do citoesqueleto, em particular as redes de filamentos de actina e intermédios e outras proteínas associadas a eles. 2 Resultados dos testes mecânicos nas redes em in vitro de filamentos de actina e intermediários sugerem que os mecanismos celulares é em grande parte dependente da estrutura do citoesqueleto e a pré-tensão no o citoesqueleto. 3-5 Rigidez de células vivas é então considerado como um índice para avaliar a estrutura do citoesqueleto 6, 7 e actividade miosina muitos outros processos celulares. Mais importante ainda, as alterações nas propriedades mecânicas das células são também frequentemente encontrado para ser estreitamente associadaciado a várias condições de doença, tais como a formação de tumores e metástases 8-10 Controlo da rigidez mecânica de células vivas podem, portanto, proporcionar uma nova forma de controlar a fisiologia da célula,. de detectar e diagnosticar doenças 8,. e para avaliar a eficácia dos tratamentos com medicamentos 11 , 12 Vários métodos, incluindo microrheology partícula de rastreamento, 13-16 citometria de torção magnética, 17 micropipeta aspiração microindentação 18,19 e 20-22 foram desenvolvidos para medir a elasticidade das células. Partícula de rastreamento microrheology traça as vibrações térmicas, tanto de partículas submicrométricas fluorescentes injectados em células ou marcadores fiduciais dentro do citoesqueleto celular. 23 propriedades elásticas e viscosas de células são calculados a partir dos deslocamentos de partículas medidos usando o teorema de dissipação de flutuação. 14,23 Este método permite medições simultâneas de locaispropriedades mecânicas com alta resolução espacial em diferentes lugares em uma célula. No entanto, a injeção de partículas fluorescentes em células pode levar a alterações na função celular, a estrutura do citoesqueleto, e, portanto, a mecânica da célula. O método aplica-se a aspiração de pressão negativa micropipeta em uma micropipeta de diâmetro variando entre 1 e 5 um para chupar um pequeno pedaço de membrana celular para a pipeta. Rigidez das células é calculada a partir da pressão negativa aplicada e deformação da membrana celular. 18 Este método, no entanto, não é possível detectar a distribuição heterogénea da rigidez em toda a célula. Citometria de torção magnética (MTC) se aplica o campo magnético para gerar binário em grânulos super-paramagnéticas ligadas à membrana celular. Celular rigidez 17 é derivado no presente método a partir da relação entre o binário aplicado e a deformação de torção da membrana celular. É difícil controlar a localização das esferas magnéticas no método MTC, e é também challenging a caracterizar a deformação de torção, com alta resolução. Microindentação aplica um penetrador com uma geometria bem definida, para perfurar na célula. A força de recuo e o recuo, resultando em células seguem frequentemente a previsão do modelo Hertz. Módulos de Young de células pode ser calculada a partir das curvas de força de recuo, equipando-os com o modelo Hertz. Este método tem sido amplamente utilizado para testar as propriedades mecânicas do tecido, e as células, apesar de as suas limitações, tais como a incerteza na determinação do ponto de contacto, a aplicabilidade do modelo de Hertz, e o potencial para danificar fisicamente as células. Entre os muitos dispositivos para microindentaion 20, o Microscópio de Força Atômica (AFM) está disponível comercialmente e tem sido amplamente aplicada para caracterizar as propriedades mecânicas das células vivas e tecidos 21,24-27. Este trabalho demonstra o procedimento de usar um Asylum MFP3D-Bio AFM para caracterizar mecânica celulares. AFM não emly fornece topografia de alta resolução das células, mas também tem sido amplamente aplicada para caracterizar as propriedades mecânicas das células dos tecidos. O princípio da AFM recuo é ilustrada na Figura 1. O braço de suporte de AFM se aproxima da pilha de alguns micrómetros acima; faz contacto com a célula, travessões, a célula de modo que a deformação do cantilever atinge um ponto de ajuste pré-seleccionado, e puxa para fora da célula. Durante este processo, a deformação do cantilever é registada como uma função da sua posição, como mostrado na Figura 1. Antes de fazer o contacto com a célula, o cantilever se move no meio sem qualquer deflexão aparente. Quando recuo sobre a célula, as curvas em cantilever e os aumentos de sinal de deflexão. As vigas são modeladas como vigas elásticas, de modo que a sua deformação é proporcional à força aplicada à célula. Ao definir a deflexão máxima cantiléver, a magnitude da força máxima aplicada à amostra é limitado para evitar dAmage às células. A parte da curva de força a partir do ponto b ao ponto C na Figura 1, onde os travessões da ponta para dentro da célula, está apto para o modelo hertz para extrair a rigidez da célula. <img src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1highres.jpg"/> Figura 1. Ilustração da AFM microindentação e interpretação da curva de força. O painel superior mostra o movimento de AFM cantilever impulsionado pelo scanner piezo. A localização vertical do braço de suporte e o braço de suporte z deflexão d sinal é registado durante o processo. O braço de suporte começa a partir de um ponto, alguns micrómetros acima da célula. Ao aproximarem-se da célula, o recuo δ amostra permanece zero até atingir o ponto b, onde a ponta entra em contacto com a célula. As coordenadas do ponto b no gráfico são os valores críticospara a análise de dados, indicado por (z 0, d 0&gt;). De b para c, os travessões cantilever na célula até que a deflexão do cantilever atinge um ponto de ajuste, que é definido como sendo a relação entre a força de recuo máximo alvo ea constante da mola cantilever. Uma vez que o sinal de deflexão atinge o valor máximo pré-definido, o cantilever é então retirado a partir da célula até ao ponto d, em que, muitas vezes, ser puxado para baixo devido à adesão de ponta-amostra, destaca a partir da célula e retorna à sua posição inicial em E. O painel da direita mostra a relação entre a reentrância e o sinal gravado e z d. Em no painel inferior esquerdo é um gráfico de uma curva representativa de força, o recuo máximo de um braço de suporte, das quais a constante de mola é medido para ser 0.07N / m, é ajustado para ser de 17 nm, de modo que a máxima força de recuo aplicada ao amostra é de 1,2 nN. Os locais-chave durante o recuo são marcadas.

<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>Atomic Force Microscope </td>
<td>Asylum Research</td>
<td>MFP3D-BIO</td>
</tr>
</tbody>
</table>

measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy

As propriedades mecânicas das células e da matriz extracelular (ECM) desempenham papéis importantes em muitos processos biológicos, incluindo a diferenciação de células estaminais, a formação de tumores e cicatrização de feridas. Alterações na rigidez de células e de ECM são frequentemente sinais de alterações na fisiologia da célula ou doenças em tecidos. Assim, a rigidez da célula é um índice para avaliar a qualidade de culturas de células. Entre a multiplicidade de métodos aplicados para medir a rigidez das células e tecidos, micro-recuo usando um Microscópio de Força Atômica (AFM) fornece uma maneira de medir de forma confiável a rigidez das células vivas. Este método tem sido amplamente utilizado para caracterizar a rigidez em micro-escala de uma variedade de materiais que vão desde as superfícies metálicas para os tecidos moles e as células biológicas. O princípio básico deste método é recuar um celular com uma ponta do AFM da geometria selecionada e medir a força aplicada a partir da flexão do cantilever AFM. Montagem da curva força-recuo para o modo de Hertzl para a geometria da ponta correspondente pode dar medições quantitativas de rigidez do material. Este documento revela o procedimento para caracterizar a rigidez de células vivas utilizando AFM. Etapas-chave, incluindo o processo de AFM calibração, aquisição de força curva, e análise de dados usando uma rotina MATLAB são demonstrados. As limitações deste método também são discutidos.

A Figura 2a mostra três curvas representativas força tomadas a partir de fibroblastos 3T3 cultivadas na superfície de plástico, em gel de poliacrilamida de módulos de Young 3000 Pa e 17.000 Pa, respectivamente. Depois de identificar cuidadosamente os pontos de contacto nas curvas, a força de recuo em função da deformação celular está representada na Figura 2b. Sob uma força de magnitude menor do que 0,3 nN, uma pirâmide de forma da ponta travessões 3 micrômetros em uma c?...

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Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Este documento revela um protocolo para caracterizar as propriedades mecânicas de células vivas por meio de microindentação utilizando um microscópio de força atómica (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

39.6K visualizações.  Worcester Polytechnic Institute. Este documento revela um protocolo para caracterizar as propriedades mecânicas de células vivas por meio de microindentação utilizando um microscópio de força atómica (AFM).

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Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Bioengenharia

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantificar as propriedades mecânicas do Glicocálix endotelial com Microscopia de Força Atômica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Um novo método para localizar Repórter fluorescentes Beads perto da superfície de cultivo celular para Tração Microscopia de Força

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superfície de Medição de Potencial de Bactérias Usando Kelvin Probe Microscopia de Força

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Usando biologia sintética para manipular células vivas que fazem interface com materiais programáveis

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Um milímetro escala Flexural sistema de testes para medir as propriedades mecânicas de espículas de esponja marinha

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Medição da dinâmica de força-sensível da proteína em células vivas, usando uma combinação de técnicas fluorescentes

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...