Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da microscopia óptica, como como tirar imagens de super resolução, bem como imagens FRET usando o mesmo microscópio. A principal vantagem desta técnica é que poderíamos combinar três módulos de imagem diferentes em um microscópio, reduzindo significativamente o custo global. A demonstração visual deste método é fundamental, pois a montagem do caminho de excitação é difícil de aprender.
Eles exigem a escolha adequada de peças e um alinhamento óptico sensível. Para começar, instale um cartão de aquisição de dados através de uma interface PCI e use-o para conectar os lasers ao computador. Controle os comportamentos de liga e saída dos lasers pela saída lógica transistor-transistor e seu ajuste de energia pela saída analógica desta placa.
Em seguida, prepare uma tabela óptica isolada de vibração com espelhos e divisores de feixe, como mostrado aqui e descrito no protocolo de texto que acompanha. Combine os raios laser em uma fibra óptica de modo único, montando pela primeira vez uma placa adaptadora de fibra em um suporte de tradução de eixo z. Em seguida, monte uma lente acromática doublet em uma placa de gaiola.
Use uma haste de extensão para conectar o adaptador e a lente para formar uma gaiola. Em seguida, use postes ópticos de uma polegada de espessura para montar a gaiola na mesa óptica. Alinhe o laser de 647 nanômetros ajustando os componentes para obter a potência máxima do laser através da fibra.
Uma vez feito o alinhamento do primeiro laser, instale temporariamente um par de íris e alinhe o resto dos lasers um a um. Verifique a eficiência de alinhamento de cada laser com um medidor de potência. Certifique-se de deixar uma íris na frente da placa adaptadora para reduzir os reflexos dos lasers.
Em seguida, projete e instale a lente de ampliação conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. A fim de criar o efeito astigmatismo necessário para extrair as coordenadas z de cada molécula, coloque uma lente 3D com uma distância focal de 10 metros no e insira-a no caminho do feixe de emissão. Para minimizar as vibrações durante a imagem de epifluorescência multicolorida sequencial, use filtros de emissão colocados em uma roda de filtro de barreira conectada ao lado do microscópio.
Para detecção simultânea de multicoloridos durante experimentos fret de molécula única, coloque outro filtro definido em um divisor de emissões. Para configurar para imagens limitadas à difração usando epi-excitação, primeiro ajuste o ângulo incidental do laser de excitação para o modo epi no braço de iluminação. Em seguida, desengatar a lente 3D e inserir o cubo de bypass no divisor de emissões.
Em seguida, insira a lente mag para iluminação ampliada. Uma vez configurado, pegue imagens em vários canais, pilhas z e/ou tempo de sua amostra com base nos resultados desejados. Para configurar a detecção multicolorida de moléculas imobilizadas por moléculas imobilizadas, primeiro mova a roda do filtro para uma posição vazia.
Isso permitirá que os lasers passem. Em seguida, ajuste o ângulo incidental dos lasers de excitação para o ângulo de grama e desengatar as lentes mag e 3D. Em seguida, engaje o modo de três canais no divisor de emissões substituindo primeiro o cubo de bypass por um cubo de calibração que permite que toda a luz passe por todos os canais.
Em seguida, ligue a câmera sob DIC e ajuste a abertura do divisor de emissões até que três canais totalmente separados apareçam na tela. Gire os botões de controle de ajuste vertical-horizontal no divisor de emissões e alinhe aproximadamente os três canais. Em seguida, desligue a câmera e substitua o cubo de calibração pelo cubo triplo.
Coloque uma amostra de contas multicanais de 100 nanômetros. Após a excitação a 488 nanômetros, as contas multicanais de 100 nanômetros emitem diferentes comprimentos de onda de luz, permitindo o alinhamento de três canais. Em seguida, ligue a câmera e o laser de 488 nanômetros, amplie em uma das contas brilhantes e, finalmente, alinhe os três canais girando os botões de controle de ajuste novamente.
Com a amostra agora no lugar, usando um laser fraco, navegue até uma área com uma densidade de ponto razoável e ajuste a potência do laser e o tempo de exposição para alcançar níveis aceitáveis de sinal para ruído e fotobleaching. Em seguida, use o software de imagem para tirar imagens de lapso de tempo. Para imagens de super resolução, comece inserindo a lente 3D e remova a lente mag.
Em seguida, determine o ângulo incidental do laser de excitação ideal para ser o ângulo de grama. Para encontrar a altura objetiva adequada para a imagem de RS, use imagens DIC para encontrar o plano médio das células. Identifique o plano pela altura em que as células se tornam transparentes.
Uma vez determinado o plano focal desejado, inicie a imagem de super resolução. Durante a imagem, altere a potência do laser de 405 nanômetros para manter uma densidade razoável de pontos piscando. Comece a imagem sem poder laser violeta.
Conte o número de pontos piscando em um determinado período e aumente a potência do laser violeta para que o número de pontos piscando seja mantido acima de um limiar de contagem definido pelo usuário no campo de visão. Analise os dados detectando os centroides de cada ponto nos quadros de imagem e extraia valores z para cada ponto das larguras X e Y. Construa uma imagem reconstruída e visualize objetos em 3D.
Esta configuração do microscópio permite uma comutação flexível e reprodutível entre diferentes métodos de imagem, incluindo imagens epifluorescentes convencionais, imagens de super-resolução baseadas em detecção de molécula única e detecção de moléculas únicas multicoloridas. A fim de revelar detalhes mais finos na montagem molecular, a microscopia de super-resolução combina milhares de imagens como esta. Essas imagens são então reconstruídas para gerar uma imagem final de super-resolução.
Técnicas de super-resolução permitem alta resolução espacial, fornecendo detalhes que não podem ser vistos com outras técnicas. Isso é destacado nas duas imagens mostradas aqui. A imagem de super-resolução mostra o mesmo RNase regulatório bacteriano que a imagem de epifluorescência, mas permite a detecção de moléculas únicas.
SmFRET é outro método capaz de angstrom para resolução de nanômetros. Aqui, moléculas de RNA dobradas foram rotuladas com um corante doador verde e um corante aceitador vermelho. Trajetórias de intensidade de fluorescência podem ser extraídas de moléculas individuais únicas, gerando eficiência de FRET em função do tempo.
Não se esqueça que trabalhar com lasers pode ser perigoso, e precauções como usar proteção ocular ou diminuir poderes laser devem ser sempre tomadas quando realizar este procedimento.
