Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant GM086822. Os autores gostariam de agradecer as Dras. Alec Pakhomov &amp; Paul Wallace (Univ. de Washington Facility Usuário Nanotecnologia (NTUF)) e Andrea Slade (Bruker AXS) para a sua assistência técnica especializada. DNA AFM foi realizado na Univ. de Washington NTUF, membro da Rede Nacional de Nanotecnologia Infra-estrutura. O plasmídeo 2xGal4-2xGRE-luciferease foi gentilmente cedido pelo laboratório do Dr. Keith Yamamoto (Univ. of California, San Francisco).

1. Preparação de amostras de DNA e proteínas a ser trabalhada livre de contaminantes <ol><li> Biomoléculas isolar a ser trabalhada e coloque em um tampão adequado aquosa. Proteínas a ser trabalhada pode ser purificado por cromatografia líquida de 6 de imunoadsorção seguida da remoção de anticorpos e pellet 1,2, ou purificação Profinity eXact e remoção tag 7 (Figura 2A). Isolar moléculas de DNA a ser trabalhada por miniprep purificação (Figura 2B). </li><li> Confirmar composição e pureza das amostras de proteína para ser fotografada usando SDS-PAGE e Western blotting. Para DNA, confirme seqüência e pureza, completando uma restrição digestão e eletroforese em gel de agarose. </li><li> Incubar as amostras em um tampão de adsorção AFM para promover a adesão da amostra a mica. Para amostras de proteínas, 10 mM tampão HEPES pode ser usado. Adicionais de sais de baixa força iônica ou co-fatores podem ser adicionados outros também. Para amostras de DNA, incluem um cátion bivalente (por exemplo, Mg 2 + ou Ni 2 +) para promover a adsorção ao substrato mica. A Mg 2 + adequada, contendo tampão de DNA é de 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 3. Ni uma alternativa buffer de 2 + é de 10 mM HEPES, pH 6.8, 10 mM NiCl 2. </li><li> Diluir a amostra a uma concentração de 5 mg / ml em tampão de adsorção. Misturar suavemente. Loja no gelo, enquanto o microscópio está sendo preparada. </li></ol> 2. Montagem AFM sonda <ol><li> Coloque o suporte da sonda líquido da célula para a correspondente estação de acoplamento cantilever instalação. </li><li> Localize o cantilever, longos e grossos (referido como o cantilever &#39;B&#39;) da sonda de nitreto de alavanca afiada (SNL) a ser utilizado para geração de imagens. Cuidadosamente transferi-lo para o titular líquido celular sonda, assegurando que a ponta permanece em pé. Nota técnica: Extremo cuidado deve ser pago, enquanto a sonda está em trânsito, como deixá-la cair de qualquer altura pode danificar ou destruir o cantilever ou ponta. A microlever SNL sonda (MSNL) pode ser usado como uma alternativa à sonda SNL. </li><li> Remova o suporte da sonda da estação de ancoragem e examinar o cantilever sob um microscópio de luz para assegurar que ele está intacto e devidamente sentado no porta-líquido celular sonda. </li><li> Remova cuidadosamente a cabeça AFM do conjunto se encaixam instrumento, apertando o parafuso de fixação serrilhado cabeça. Nota técnica: Extremo cuidado deve ser paga enquanto manipulando a cabeça AFM, como deixá-la cair até mesmo a uma curta distância (por exemplo, se não estão encaixados corretamente na montagem se encaixam) pode causar danos substanciais. </li><li> Inverter a cabeça AFM e empurre o suporte da sonda líquido da célula para os quatro pinos na base da cabeça AFM. Voltar cuidadosamente a cabeça AFM no conjunto se encaixam instrumento. Solte o parafuso de fixação da cabeça serrilhada para prender a cabeça AFM no instrumento. </li></ol> 3. Localizando ponta cantilever, alinhando laser, e ajustando fotodetector <ol><li> Usando o software do aparelho AFM, localize a ponta cantilever movendo os botões do microscópio de luz a bordo. Ajustar a iluminação do microscópio, se necessário para melhorar a identificação ponta. Trazer o fim da ponta do cantilever em estreita proximidade da mira exibido no software do aparelho. </li><li> Traga a ponta cantilever em foco, ajustando as setas para cima e para baixo do controlador de ótica sobre o software. Use lento (S) ou velocidade média (M) enquanto ajusta o sistema ótico. </li><li> Alinhar o laser na ponta cantilever usando os botões de ajuste laser. Mova os botões de ajuste até o ponto de laser vermelho está dentro do local de iluminação branca. Traço ao longo do braço cantilever usando um padrão zig-zag até que o laser é posicionado na ponta cantilever. Quando devidamente alinhados, um ponto forte reflexo aparecerá na janela da frente da cabeça AFM. </li><li> Centro do fotodetector, ajustando os botões fotodetector na cabeça AFM. Isso irá alinhar o ponto de laser na mira do visor fotodetector do software do aparelho. A soma do sinal observado deve ser de aproximadamente 4-6. </li></ol> 4. Posicionamento da cabeça e AFM cantilever ajuste <ol><li> Coloque uma folha recém-clivada de mica ligado a um disco de metal espécime AFM no porta-amostras magnetizadas em cima do suporte da placa AFM. Esta configuração será usada para posicionar a cabeça antes de AFM imagem da amostra de DNA ou proteína preparada na Etapa 1. <ol><li> Nota técnica: O porta-amostras magnetizadas e suporte da sonda líquidos celulares são mais espessas do que outra amostra de fixação de mecanismos e os detentores da sonda. Se existe actualmente depuração insuficiente entre o conjunto do suporte de amostra-mica e cabeça AFM, mover a cabeça até AFM, selecionando o ícone retirar no software do aparelho várias vezes. </li></ol></li><li> Gire o suporte da placa AFM para o disco de amostra é posicionada para a imagem inicial. Garantir o substrato de mica está centrada sob a cabeça AFM. </li><li> Mova a cabeça para baixo em direção a AFMsuperfície do disco mica espécimes usando o controle de superfície foco do software do aparelho. Selecione a velocidade média (M) no motor Z, e continuar em direção à superfície até que a cabeça AFM é de aproximadamente 2 mm acima da mica. Neste momento, passar a usar o lento (S) Z velocidade do motor, a fim de evitar o contato brusco entre a sonda ea superfície (referido como bater a ponta). </li><li> Proceder para mover a sonda mais próxima à superfície do substrato de mica até características distintas na superfície mica ou o reflexo ponta estão em foco. Alternar entre a superfície e aviões ponta reflexão focal usando a &quot;concentrar-se:&quot; ícone do software do aparelho. </li><li> Selecionar o ícone de sintonia do software do aparelho e ajustar o cantilever. A frequência de ressonância do SNL recomendado e sondas cantilever MSNL é kHz 20-60. Selecione um pico de 5% offset. Nota técnica: tuning cantilever adequada é essencial para a imagem de amostra adequado. </li></ol> 5. Imagens da superfície da amostra mica <ol><li> Envolver a sonda sobre a superfície mica. Defina o tamanho da verificação inicial a 10 mm e taxa de varredura de 1 Hz. Ganho integral e ganho proporcional pode ser inicialmente definido como 0,2 e 0,4, respectivamente. Ajustar os ganhos, se necessário, a fim de ter traço e scans refazer cerca de sobreposição. Diminuindo a amplitude setpoint irá aumentar a interação entre a sonda ea mica e garantir engajamento. </li><li> Capturar imagens varredura completa do campo M 10. Diminuir o tamanho de digitalização a 5, 1 e 0,5 micron e capturar imagens completas de cada campo. Ajustar os ganhos e velocidade de varredura, se necessário. Captura de imagens da superfície de mica fornece uma base para comparação com o DNA e proteínas contendo amostras. </li><li> Desengatar a sonda com um único clique no ícone desengatar no software do aparelho. </li></ol> 6. Biomoléculas de interesse de imagem <ol><li> Delicadamente misturar o DNA ou proteínas da amostra preparada na Etapa 1 e se preparar para carregá-lo sobre a superfície de mica trabalhada. Mistura de 5 mL de amostra preparada com 45 mL de tampão de adsorção fresco (concentração da amostra final = 0,5 mg / ml). </li><li> Cuidadosamente adicione 50 ul do 0,5 mg / solução biomolécula contendo ml diretamente na superfície mica. Fazer isso sem mover a cabeça da sonda ou AFM, e assegurar a solução da amostra (mas não ponta da pipeta) faz contato com a sonda. </li><li> Pausa de 5 minutos para permitir que as biomoléculas na amostra para aderir à superfície mica. </li><li> Na conclusão de 5 minutos, uma pipeta mL 50-100 adicionais de tampão de adsorção no suporte líquido celular sonda tendo o cuidado de não tocar na sonda, AFM cabeça, ou mica com a ponta da pipeta. Isto irá formar um menisco e permitir a AFM tocando imagem em modo de fluido. Figura 3 mostra o arranjo final da célula de fluidos, cantilever, amostra, titular da amostra, e menisco. </li><li> Reajustar a célula fotoeléctrica e realinhar a laser para o cantilever se necessário. Nota técnica: ver a ponta da sonda e alinhamento a laser é complicado devido ao padrão de difração causada pela adição de tampão de amostra para o suporte da sonda. Manualmente sintonizar o cantilever, se necessário. </li><li> Voltar a envolver a sonda usando o software do aparelho. Ajuste de deflexão vertical, ganho integral e ganho proporcional, conforme necessário. Isto irá iniciar o processo de re-imaging a seção de mica digitalizados imediatamente antes da adição da amostra e capturar imagens. </li><li> Aumentar o tamanho do scan (500 nm-10 mm) para identificar regiões de interesse. Zoom-in e reduzir a taxa de varredura de 0,5 Hz para melhorar a resolução da imagem </li><li> Uma vez que imagens é completa, desengatar a sonda selecionando retirar ícone no software do aparelho várias vezes. Garantir espaço suficiente entre a cabeça eo disco AFM espécime antes da desmontagem da célula de líquido ou disco espécime. </li><li> Enxaguar o titular sonda líquido celular e disco de amostra com água destilada para evitar a formação de cristais de sal se evapora como tampão residual de adsorção. Seco com ar comprimido. </li></ol> 7. Resultados representativos: Exemplos de imagens AFM são apresentados na Figura 4. Mica substrato (A) fornece uma superfície plana sobre a qual molecularmente DNA e proteínas podem absorver. Mica de imagem antes de amostras biomolécula fornece um controle negativo e avaliação do ruído de imagem. Ele também oferece um nível de garantia de que o cantilever está devidamente afinada e de imagem de amostra subseqüente será bem sucedido. Double-stranded DNA plasmídeo (B, D), presuntivamente superenrolado, é facilmente identificado por sua aparência assimétrica e uniforme depositar sobre o substrato de mica anteriormente normal. Complexos de proteínas de tamanhos de partículas discretas (C, E) também são distinguíveis exclusivamente a partir do substrato mica. Diferenças de tamanho de partículas indicam heterogeneidade da amostra, e pode ser útil para aproximar estequiometria proteínas complexas ou atividade bioquímica. A forma geral diagonal e orientação consistente do propartículas de proteína observado no painel C é um artefato de imagem, como as proteínas se expectedly ser orientado sobre o substrato de mica de uma forma aleatória. Possíveis causas do artefato observado é uma anormalidade ou física ponta AFM imagens em rápida demais de uma taxa de varredura. Enquanto convolução ponta (ilustrada na Figura 1B) impede que os cálculos de medição absoluta comprimento em eixos x e y, medida da altura (eixo z) e x relativa e medições y pode ser, no entanto útil para estimar propriedades biofísicas das biomoléculas com imagens. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1: Apresentação esquemática do modo de tocar microscopia de força atômica (AFM). A, o microscópio. No final do cantilever é uma ponta afiada que oscila para cima e para baixo, uma vez que faz a varredura sobre a superfície de um substrato de mica a que adsorvem complexos biomolecular. Como o scanner se move nas direções x e y, um feixe de laser é refletida na parte de trás do cantilever em uma posição sensível detector fotodiodo para mapear a distância vertical (z) a ponta se move quando ele passa sobre os complexos biomolecular sentado no mica. B. Distorção da imagem nas direções x e y causada pela convolução da ponta. O raio nominal de uma ponta convencional nitreto de silício é maior do que as partículas a ser trabalhada, ea borda dos contatos ponta da amostra, uma vez que atravessa a superfície. Dica resultados convolução nas partículas com imagens que aparecem maiores na direções x e y, mas não a direção z. Este efeito pode ser minimizado através da utilização de pontas com um raio menor ponta nominal. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2: Ilustração de proteína imunoadsorvido e preparação de amostras de DNA. A Release, de GR imunoadsorvido • complexo de proteínas hsp70 do anticorpo monoclonal (mAb)-proteína A-Sepharose (PAS) da pelota. Incubando a immunopellet com um peptídeo contendo o epítopo mAb vai facilitar a liberação do GR • complexo de proteínas hsp70 do pellet, permitindo que o complexo para ser coletado do sobrenadante e visualizados por AFM. B, Preparação de DNA para AFM imagens requer o uso de um cátion divalente adsorção buffer. O cátion divalente aumenta a afinidade do DNA para o substrato de mica. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3: Disposição Final da cabeça AFM e suporte para sonda líquido celular, amostra, porta-espécime, e menisco buffer. A Care, devem ser tomados no momento do depósito de amostra e tampão adicionais sobre o substrato de mica para evitar o contato físico entre a ponta da pipeta e cabeça AFM, ligue para líquido, e substrato mica. B, Ampliação de A. O menisco tampão se estende a partir do disco de amostra para o titular líquido celular sonda. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4: Micrografias de força atômica do substrato de mica (A), 2xGal4-2xGRE-luciferease DNA plasmídeo 8 (B, D) e GR • complexos de proteína hsp70 (C, E) em solução tampão. Mica serve como um controle de imagem para comparar com as visualizações de DNA e proteínas. GR • complexos de proteína hsp70 foram preparados por imunoadsorção de GR preparado com hsp70 e em seguida liberado a partir do pellet-anticorpo talão usando um anticorpo monoclonal concorrentes (ilustrada na Figura 2A). DNA foi preparado pela miniprep plasmídeo convencional. Painéis A, B e C são de uma ampliação equivalente (barra de escala = 200 nm), assim como os painéis D e E (barra de escala = 40 nm).

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	<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor&#149;hsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft.">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&#149;hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J Biol Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li><li>Harrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+glucocorticoid+receptor+transport+on+microtubules+by+dynein.">Evidence for glucocorticoid receptor transport on microtubules by dynein.</a> J Biol Chem. 279, 54647-54654 (2004).</li><li>Pastre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+mica+mediated+by+divalent+counterions:+a+theoretical+and+experimental+study.">Adsorption of DNA to mica mediated by divalent counterions: a theoretical and experimental study.</a> Biophys J. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>Guthold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+one-dimensional+diffusion+and+transcription+by+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">Direct observation of one-dimensional diffusion and transcription by Escherichia coli RNA polymerase.</a> Biophys J. 77, 2284-2294 (1999).</li><li>Petrucco, S., Volpi, G., Bolchi, A., Rivetti, C., Ottonello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nick-sensing+DNA+3'-repair+enzyme+from+Arabidopsis.">A nick-sensing DNA 3'-repair enzyme from Arabidopsis.</a> J Biol Chem. 277, 23675-23683 (2002).</li><li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation/deacetylation+of+the+chaperone.">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J Biol Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li><li>Ruan, B., Fisher, K. E., Alexander, P. A., Doroshko, V., Bryan, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+subtilisin+into+a+fluoride-triggered+processing+protease+useful+for+one-step+protein+purification.">Engineering subtilisin into a fluoride-triggered processing protease useful for one-step protein purification.</a> Biochemistry. 43, 14539-14546 (2004).</li><li>Meijsing, S. H., Elbi, C., Luecke, H. F., Hager, G. L., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ligand+binding+domain+controls+glucocorticoid+receptor+dynamics+independent+of+ligand+release.">The ligand binding domain controls glucocorticoid receptor dynamics independent of ligand release.</a> Mol Cell Biol. 27, 2442-2451 (2007).</li><li>Shen, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+sample+preparation+method+for+atomic+force+microscopy+visualization+of+individual+DNA+molecules+in+situ.">A simple and effective sample preparation method for atomic force microscopy visualization of individual DNA molecules in situ.</a> Mol Biol Rep. 38, 965-969 (2010).</li><li>Paulite, M., Fakhraai, Z., Akhremitchev, B. B., Mueller, K., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+tuning+and+use+of+an+apertureless+near+field+infrared+microscope+for+protein+imaging.">Assembly, tuning and use of an apertureless near field infrared microscope for protein imaging.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+effects+of+matrix+stiffness+on+cellular+function+using+acrylamide-based+hydrogels.">Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Brunger, A. T., Weninger, K., Bowen, M., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+of+the+neuronal+SNARE+fusion+machinery.">Single-molecule studies of the neuronal SNARE fusion machinery.</a> Annu Rev Biochem. 78, 903-928 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

AFM fornece uma técnica única microscópicas capazes de imagem individuais revestidos biomoléculas em solução aquosa e quase fisiológica soluções tamponadas em tempo real. Isto permite a visualização de proteínas e moléculas de DNA, bem como complexos multiprotein e proteína DNA-complexos. Partículas macromolecular de imagem com AFM pode ser útil para avaliar a homogeneidade da amostra e identificar o arranjo físico dos componentes constituintes das partículas observadas. Esta abordagem de observar partículas macromolecular indivíduo pode ser um complemento útil ao convencional técnicas bioquímicas, tais como ensaios de imunoprecipitação, eletroforese em gel de poliacrilamida e cromatografia tamanho da coluna de exclusão, que fornecem dados significativos sumativa representando o 10 3 -10 11 complexos biomolecular individuais de interesse presentes em uma amostra. Investigação em estequiometria multiprotein complexos, interações biomoleculares e requisitos cofactor podem ser investigadas utilizando AFM. O método aqui apresentado pode ser adaptado para acomodar questões específicas de interesse biofísico. Por exemplo, utilizando um suporte da sonda líquido celular capazes de trocar de buffer, é possível aos requisitos do ensaio cofator para a formação de proteínas complexas. DNA-proteína assembléias podem ser formadas e dissociado quase em tempo real e até mesmo ao ser fotografada. DNA podem ser gerados com seqüências específicas de interesse (por exemplo, elementos de resposta presuntivo ou seqüência romance binding protein), misturado com a proteína a hipótese de ligação, e fotografada para fornecer evidências diretas de interações intermoleculares. Tocando modo AFM é substancialmente menos complicado se as amostras secas são utilizadas em vez de amostras em soluções aquosas, e está DNA linear e plasmídeos fechado círculo de DNA têm sido fotografados tanto desta forma 3,9. O método aqui apresentado utiliza amostras em soluções tamponadas, a fim de proporcionar um ambiente de imagem mais fisiológica. Outros métodos de imagem notável de proteínas também devem ser considerados, incluindo perto de microscopia de campo infravermelho 10. A utilização complementar de imunoadsorção em consórcio com AFM fornece uma oportunidade para preparar uma miríade de complexos de proteínas, utilizando técnicas bem estabelecidas bioquímicos e, em seguida, visualizá-los após a libertação do immunoadsorbing anticorpos talão pellet. Por exemplo, GR imunoadsorvido foi ensaiada por sua associação com a proteína chaperone molecular hsp70 1, bem como a proteína dineína motor 2 usando essa abordagem, a fim de estimar o tamanho complexo e estequiometrias. Tamanho das partículas e características biofísicas (rigidez, por exemplo) têm sido úteis em determinar a identidade do biomoléculas observada em amostras de AFM imaged 11,12. Também é possível confirmar a identidade biomolécula pela adição de uma biomolécula interação (por exemplo, um ligante ou um anticorpo monoclonal), que se ligam ao seu alvo e causar um aumento de tamanho de partícula, se a biomolécula alvo está presente.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Dimension 3100 </td><td> Bruker </td><td> Dimension 3100 </td></tr><tr><td> Celular Fluid dimensão </td><td> Bruker </td><td> DTFML-DD-HE </td></tr><tr><td> Alavanca de nitreto de Sharp (SNL) de nitreto de silício AFM sonda </td><td> Bruker </td><td> SNL-10 </td></tr><tr><td> Microlever afiada nitreto de alavanca (MSNL) de nitreto de silício AFM sonda </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td></tr><tr><td> Nanoscope software instrumento AFM </td><td> Bruker </td><td> 004-132-000 </td></tr><tr><td> Espécime de metal discos AFM </td><td> Ted Pella </td><td> 16208 </td></tr><tr><td> Grade V1 Discos Mica, 12 mm </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td></tr></tbody></table>

visualization of recombinant dna and protein complexes using atomic force microscopy

Microscopia de força atômica (AFM) permite a visualização de proteínas individuais, as moléculas de DNA, complexos proteína-proteína e DNA-proteína complexos. No final do cantilever do microscópio é uma sonda escala nanométrica, que atravessa áreas de imagem que variam de nanômetros a micrômetros, medir a elevação de macromoléculas descansando na superfície do substrato, em qualquer ponto. Forças eletrostáticas causa proteínas, lipídios e ácidos nucléicos para frouxamente anexar ao substrato em orientações aleatórias e permitir imagem. Os dados gerados se assemelham a um mapa topográfico, onde as macromoléculas como resolver tridimensional partículas de tamanhos distintos (Figura 1) 1,2. Tocando modo AFM envolve a oscilação repetida do cantilever, que permite imagens de biomateriais relativamente macio, tais como DNA e proteínas. Um dos benefícios notáveis ​​da AFM em relação a outras técnicas de microscopia em nanoescala é a sua adaptabilidade em relação ao visualizar proteínas individuais e complexos macromoleculares em buffers aquosa, incluindo o quase fisiológica tamponada condições, em tempo real, e sem coloração ou revestimento da amostra a ser trabalhada. O método aqui apresentado descreve a imagem de DNA e um fator de transcrição imunoadsorvido (isto é o receptor glicocorticóide, GR) em solução tampão (Figura 2). Imunoadsorvido proteínas e complexos de proteína pode ser separada da immunoadsorbing anticorpos talão de pelotas pela competição com o anticorpo epítopo e depois fotografada (Figura 2A). Isso permite a manipulação bioquímica do biomoléculas de interesse antes da imagem. Uma vez purificado, DNA e proteínas podem ser misturados e do complexo interagindo resultante pode ser trabalhada também. Ligação do DNA a mica requer um cátion divalente 3, tais como Ni 2 + ou Mg 2 +, que pode ser adicionado à amostra buffers ainda manter a atividade da proteína. Utilizando uma abordagem similar, AFM tem sido utilizado para visualizar diferentes enzimas, incluindo RNA polimerase 4 e uma enzima de reparo 5, ligado a cadeias de DNA individual. Esses experimentos fornecem uma visão significativa para a proteína-proteína e interações DNA-proteína biofísicos que ocorrem no nível molecular. Partículas macromolecular imagens individuais com AFM pode ser útil para determinar a homogeneidade de partículas e para a identificação do arranjo físico dos componentes constituintes das partículas com imagens. Enquanto o método foi desenvolvido para visualização dos complexos GR-chaperone da proteína 1,2 e DNA vertentes a que o GR pode ligar, ele pode ser aplicado de forma ampla para DNA de imagens e amostras de proteínas a partir de uma variedade de fontes.

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Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Um modo de tocar microscópio de força atômica método (AFM) para a visualização de DNA plasmídeo, proteínas citoplasmáticas e proteína-DNA complexos é descrito. O método inclui abordagens alternativas para a preparação de amostras para AFM imagem após a manipulação bioquímica. DNA contendo regiões específicas interagindo proteínas são observados em condições quase fisiológica buffer.

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

visualization-recombinant-dna-protein-complexes-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.3K visualizações.  Seattle University. Um modo de tocar microscópio de força atômica método (AFM) para a visualização de DNA plasmídeo, proteínas citoplasmáticas e proteína-DNA complexos é descrito. O método inclui abordagens alternativas para a preparação de amostras para AFM imagem após a manipulação bioquímica. DNA contendo regiões específicas interagindo proteínas são observados em condições quase fisiológica buffer.

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Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Bioengenharia

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantificar as propriedades mecânicas do Glicocálix endotelial com Microscopia de Força Atômica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superfície de Medição de Potencial de Bactérias Usando Kelvin Probe Microscopia de Força

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in Parkinson&#8217;s disease and beta-amyloid and tau in Alzheimer&#8217;s disease, it is critically important to develop morphology specific reagents that can selectively target these disease-specific protein variants to study the role of these variants in disease pathology and for potential diagnostic and therapeutic applications. We have developed novel atomic force microscopy (AFM) based biopanning techniques that enable isolation of reagents that selectively recognize disease-specific protein variants. There are two key phases involved in the process, the negative and positive panning phases. During the negative panning phase, phages that are reactive to off-target antigens are eliminated through multiple rounds of subtractive panning utilizing a series of carefully selected off-target antigens. A key feature in the negative panning phase is utilizing AFM imaging to monitor the process and confirm that all undesired phage particles are removed. For the positive panning phase, the target antigen of interest is fixed on a mica surface and bound phages are eluted and screened to identify phages that selectively bind the target antigen. The target protein variant does not need to be purified providing the appropriate negative panning controls have been used. Even target protein variants that are only present at very low concentrations in complex biological material can be utilized in the positive panning step. Through application of this technology, we acquired antibodies to protein variants of TDP-43 that are selectively found in human ALS brain tissue. We expect that this protocol should be applicable to generating reagents that selectively bind protein variants present in a wide variety of different biological processes and diseases.

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Novel Microscopia de Força Atômica bioprospecção Based para Isolamento de Morfologia reagentes específicos contra TDP-43 variantes em Esclerose Lateral Amiotrófica

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Visualização do Germinosomes e a membrana interna em esporos de Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Aplicação de microscopia de força atômica para detectar osteoartrite precoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automação de Medições de Microscópio de Força Bio-Atômica em centenas de células de C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...