O programa NSF-MRI (CHE: 1229103) é reconhecido para o financiamento da compra de novos produtos eletrônicos de controle, software, células líquidos e outros equipamentos necessários para montar uma dupla AFM / STM. Reconhecemos as instalações compartilhadas no The University of Chicago programa NSF-MRSEC (DMR-0820054) para obter assistência com a AFM instrumentação, treinamento e criação de imagens e de tempo de instrumentos disponibilizados pela Pesquisa de Materiais de Equipamentos (DMR-0820054). Agradecemos especialmente Dr. Qiti Guo, Dr. Justin Jureller, e Prof Ka Yee Lee para acolher os nossos alunos antes do financiamento da proposta NSF-MRI, que trouxe a instrumentação necessária para o nosso campus. Reconhecemos o financiamento de uma bolsa Título III STEM (ID: P031C110157) atribuído à Northeastern Illinois University, que ofereceu remuneração de pesquisa de verão para alunos e professores, bem como suporte para produtos de consumo. Finalmente, reconhecemos Bruker-Nano, Inc. para suporte instrumental continuou e permissão para reproduce um gráfico que mostra o mecanismo de PeakForce QNM e para utilizar a palavra ScanAsyst para descrever o software automatizado.

1 computador e microscópio Configurar <ol><li> Abrir a válvula de cilindro de N 2 e ajustar os botões para assegurar a tabela de ar é flutuante e nível. </li><li> Ligue o computador, controlador e luz de fibra óptica por esta ordem. </li><li> Configure o scanner para o modo / LFM AFM e centralizar a câmera sobre a cabeça AFM. </li><li> Software aberto. Selecionar categoria experimento &quot;Propriedades nanomecânicos&quot;, &quot;Quantitative nanomecânicos Mapping&quot; no grupo experimento, e &quot;PeakForce QNM em Fluid&quot; sob experimento. Clique em Carregar Experiment e depois Setup. </li><li> Foque a câmara usando o objetivo Z para ver a superfície do palco. Usando o grosseiro para cima / para baixo piezos mover a fase aproximadamente, 1 mm abaixo da superfície da abertura de cabeça AFM. </li></ol> 2: Preparação de Superfície Mica <ol><li> Pressione uma etiqueta adesiva para o rosto de um disco limpo suporte da amostra (15 mm de diâmetro, 0,8 mm de espessura). Empurre a mica V-4disco de grau (25 x 25 x 26 mm) sobre o adesivo até firmemente fixada. </li><li> Esfregue um pedaço de fita adesiva transparente sobre a mica assegurar que esteja totalmente aderida, sem bolhas de ar. Puxe a fita do mica de um lado para unir-lo uniformemente. Repita se necessário para garantir a mica é plana. </li><li> Segure o disco de suporte, com o lado mica limpeza, com um par de pinças circulares (Garras de disco), e coloque no scanner. A mica deve estar abaixo do nível da abertura da cabeça de AFM. </li></ol> Assembleia celular 3 Fluid and Imaging da Mica Superfície <ol><li> Lavar a célula de fluido, o O-ring, o adaptador de seringa, o adaptador de mangueira, e o tubo de ejecção, em etanol a 100%. Lavar a célula de fluido em água DI. Vamos todos peças de ar secar completamente. </li><li> Empurre o adaptador de mangueira na porta da célula de fluido limpo. Pressione suavemente o anel de vedação no orifício central da célula de fluido usando uma pinça plana cabeças. </li><li> Pressione a mola de leve sobre o grampo de retenção da sonda e transformá-lo longe do groove pela dica. </li><li> Segure a sonda na extremidade longa distância da ponta com uma pinça chefiadas planas. Colocar a sonda na ranhura com a ponta virada para o centro da célula. Empurre a mola para dentro e ajustar o clipe de retenção sobre a sonda para prendê-lo (Figura 1B). </li><li> Verifique se o grampo no AFM para garantir que está totalmente retraída (Figura 1C). </li><li> Colocar a célula de fluido, o O-ring e sondar virada para baixo, no topo da amostra de mica. Permitir que a célula de fluido para descansar sobre os pernos da AFM. Diminuir a braçadeira para estabilizar a célula na fase fluida. Pressione o interruptor para baixo sobre o microscópio até a inspecção visual mostra o anel de vedação firmemente comprimida entre o disco de suporte e a célula de fluido. </li><li> Enquanto observa o monitor, o foco do botão de ajuste macrométrico para visualizar a parte superior da célula de fluido na tela. </li><li> Mova o microscópio até que haja uma clara imagem da ponta usando os X / Y e botões de ajuste do objetivo Z. A dica vai appouvido como, um triângulo dourado metálico. Mover a ponta mais perto da superfície da amostra, utilizando a alavanca de piezo-se no microscópio. Concentre-se na reflexão da ponta. Acompanhe o cantilever real em relação à sua reflexão. Nesta fase, devem ser estreitamente alinhados, mas não completamente sobrepostos. </li><li> Conecte o adaptador de seringa a uma estéril seringa de 1 ml. Anexar uma extremidade do tubo de ejecção para o adaptador de seringa e colocar a outra extremidade do tubo no recipiente de solução tampão. Estenda completamente o êmbolo da seringa. </li><li> Prenda a mangueira no adaptador de mangueira na célula de fluido. Pressione suavemente o êmbolo até que o fluido preenche plenamente a câmara central. Verifique o celular para garantir que não haja bolhas de ar. Verifique para ver que não há fluido derramando-se a partir da célula de fluido para o microscópio. Colocar a seringa sobre um suporte sólido levantada. </li><li> Utilize a alimentação da câmera e os X / Y botões de tradução para localizar o laser na tela (um ponto vermelho difuso). Utilizando o laser de movbotões de controle ent, mova o laser na ponta. </li><li> Ajustar finamente os controlos de laser e de espelho, até o sinal soma mostrado na microscópio é maximizada (valor = 4-6). </li><li> Ajustar o ângulo do díodo quadrante usando os botões do lado esquerdo traseiro e o lado superior esquerdo da cabeça de leitura para reduzir os desvios verticais e horizontais mostradas no microscópio tão próximo de zero quanto possível (± 0,1). </li><li> No software, selecione opções de aquisição. No mínimo, selecione altura (traço e retraço), erro força máxima e deformação. As outras opções são dependentes do usuário e pode ser adaptado com base na informação específica desejada pelo experimentalista. </li><li> Selecione &quot;linha&quot; para RT Plane Fit em cada janela de aquisição. Selecione &quot;none&quot; para o OT Plane Fit nas janelas de altura. Defina o X e Y offset e ângulo de leitura para zero, se não tiver feito. </li><li> Definir a taxa de varredura de 1 Hz, a amostra por linha 256, o controle automático ScanAsystpara indivíduo, eo limite de auto Z ScanAsyst para fora. Alterar o limite de Z a 500 nm. Defina o tamanho da digitalização para 1 mícron. </li><li> Clique envolver. Neste ponto, a ponta se aproxima da superfície. Enquanto a ponta se aproxima, observar Z variação de tensão piezo no canto inferior esquerdo da tela. Se a dica vai para fora da faixa, retirar a ponta e re-aproximação. Se isso não for bem sucedida, a ponta pode precisar ser alterado, a fim de ter uma abordagem bem-sucedida. Uma vez que a ponta está envolvida, as linhas vão começar a aparecer em cada uma das janelas de aquisição que irão compor uma imagem. </li><li> Tire fotos de mica em 1 x 1 mícron e zoom lentamente para garantir que a superfície de mica é limpo e liso. Clique captura contínua para salvar as imagens em que aparecem. Zoom e movimentar-se na superfície como desejado. </li></ol> 4. deposição de proteína e Preparação de Amostra for Imaging <ol><li> Obter amostra de proteína purificada 38 e manter em gelo. Se armazenado em um freezer, descongelar amostra emgelo durante 5 min. </li><li> Dilui-se a proteína a 0,0010 mg / ml de solução tampão de imagiologia utilizando refrigerado. O tampão de imagiologia usado aqui é 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), NaCl 150 mM, e MgCl2 15 mM. </li><li> Encha uma câmara 4 (100 x 15 mm) Placa de Petri com solução tampão de imagem refrigerado. Encher cada câmara, com pelo menos 5 ml de solução. Misturar suavemente a solução de proteína diluída com a ponta ligada a micropipeta. </li><li> Aplicar 200 l da solução de proteína diluída até a superfície de mica já preparado. Depois de 30 segundos, pegar superfície da proteína / mica com a pinça circulares (Garras de disco). Manter a amostra paralela à bancada do laboratório. </li><li> Enquanto mantém a amostra, mergulhar imediatamente a amostra na solução tampão continha no primeiro quadrante da placa de Petri (passo 4.2), assegurando que a amostra é paralela à bacia da placa de Petri. Depois de 1 seg, retire a amostra. </li><li> Continuando a manter a amostra paralela à baciada placa de Petri, repita o passo 4.5 para os outros três quadrantes. </li><li> Coloque o disco em um pano de pó seco para absorver o excesso de umidade e transferir o disco para o palco do microscópio. Não toque na superfície real com o pano. Não permitir que a secagem da amostra. </li><li> Repita os passos de 3,6-3,16. </li></ol> 5. de imagem Proteínas sobre mica <ol><li> Clique na caixa de seleção de parâmetros no lado esquerdo da tela. Tamanho da Primavera e raio da ponta deve ser definido com base na ponta que está sendo usado. </li><li> Clique envolver. Da mesma forma que o processo de imagem mica (passo 3.17), observe a janela z-piezo como as abordagens de ponta. </li><li> Permite que o scanner a imagem da mesma área há pelo menos dois passes consecutivos. Clique captura contínua para salvar cada imagem coletada. </li><li> Mova o scanner para uma nova região e / ou alterar o tamanho da imagem conforme desejado. </li><li> Depois que o software automatizado terminar de ajustar oparâmetros de digitalização para um determinado tamanho, rode o software fora. </li><li> Ajustar manualmente velocidade de varrimento, z limite, o número de linhas, e tensão, a fim de afinar a focagem da imagem. Se a imagem fica muito fora de foco, gire software de volta para retornar a posição inicial. Para aumentar a resolução de uma imagem enquanto o zoom em uma proteína, diminua a velocidade de varredura e aumentar o número de linhas proporcionalmente. </li><li> Após a experiência, limpar a célula-líquido com etanol a 100% e lavar com H 2 O. DI Permitir que o líquido celular para secar completamente. </li><li> Abra o software de dados para processar imagens de dados brutos. Primeiro, achatar a imagem, clicando no ícone achatar. Selecione Zero ª ordem e clique em executar. Dependendo da imagem, de um plano de ajuste pode ser necessário para obter uma imagem de plano. Neste caso, selecione o ícone em forma de avião e desenhar um plano de uma área plana da imagem, usando o cursor. Clique executar. Repita conforme necessário </li><li> Select o separador de secção transversal para medir as dimensões da proteína. Desenhar uma linha com o cursor mover-se-o ao longo da molécula ou à área a ser analisada. Repita o procedimento para várias áreas eo software irá gerar uma sobreposição. Exportar a imagem ou os dados utilizados para gerar imagem em um formato compatível com outros programas de software e de desenho. </li></ol>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+engineering+enhances+a+phytochrome-based+infrared+fluorescent+protein.">Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein.</a> J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).</li><li>Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-transfer+and+hydrogen-bond+interactions+determine+fluorescence+quantum+yield+and+photochemical+efficiency+of+bacteriophytochrome.">Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pymol+Molecular+Graphic+System+v.1.5.0.1.">The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1.</a> , .</li><li>Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=structure+of+the+chromophore+binding+domain+of+an+unusual+bacteriophytochrome,+RpBphP3,+reveals+residues+that+modulate+photoconversion.">structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).</li><li>Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+Pseudomonas+aeruginosa+bacteriophytochrome:+photoconversion+and+signal+transduction.">Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).</li><li>Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+X-ray+Crystallographic+and+Structural+Analyses+of+a+Bacteriophytochrome+from+Stigmatella+aurantiaca.">Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca.</a> The FASEB Journal. 25, 928 (2011).</li><li>Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+structure+of+Deinococcus+bacteriophytochrome+yields+new+insights+into+phytochrome+architecture+and+evolution.">High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution.</a> J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).</li><li>Wagner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+Deinococcus+radiodurans+bacteriophytochrome+reveals+key+amino+acids+necessary+for+the+photochromicity+and+proton+exchange+cycle+of+phytochromes.">Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes.</a> J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).</li></ol>

There are no competing financial interests or conflicts of interest.

AFM é um método de microscopia de sonda de varrimento totalmente capazes de fornecer imagens de proteínas e outras macromoléculas biológicas em condições fisiologicamente relevantes. Em comparação com a cristalografia de raios-X e RMN, uma limitação da AFM é a sua incapacidade para alcançar a mesma resolução, particularmente resolução lateral. Quando utilizando AFM para analisar uma molécula em qualquer superfície, o impacto da superfície e da sonda na imagem da molécula também tem de ser considera...

Microscopia de força atómica (AFM), tornou-se uma ferramenta importante para investigar as propriedades estruturais e mecânicas, de superfícies de filmes finos, e as moléculas individuais desde sua invenção em 1986 (Figura 1). 1-3 Usando uma célula de líquido, o método possui tornam-se particularmente útil em estudos de macromoléculas biológicas e células, mesmo vivendo em um ambiente fisiologicamente relevante. 4-10 Tocar de modo AFM tem sido tradicionalmente usada para imprimir materiais macios ou moléculas frouxamente ligados à superfície, pois o contato de modo AFM é tipicamente inadequada devido para os danos causados ​​pelas forças laterais exercidas sobre a amostra pelo cantilever 11. de modo Tapping AFM reduz substancialmente estas forças por ter a ponta intermitentemente toque na superfície, em vez de estar em contacto constante. Neste modo, o braço de suporte é oscilado na ou perto da sua frequência de ressonância normal à superfície. Da mesma forma para entrar em contato de modo AFM, a topografia é analyzed locando o movimento do piezo-z, como uma função de xy (distância). A dinâmica cantilever pode ser bastante instável em ou próximo da ressonância; portanto, eles são muito difíceis de automatizar fora de uma situação de &quot;estado estacionário&quot;. Especificamente, estas dinâmicas dependem as propriedades da amostra e ambiente de digitalização. Para uma molécula macio adsorvido a um (er) superfície dura, um ciclo de feedback bem afinado para a molécula pode levar a oscilação feedback para a superfície. Operação no líquido complica ainda mais a sintonia do cantilever. Alterações nos níveis de temperatura ou de fluidos exigem reajuste constante de ponto de ajuste, ganhos, e outros parâmetros de imagem. Esses ajustes tendem a ser muito demorado e desafiador para os usuários. Pico de força quantitativa nanomecânicos mapeamento da propriedade (PF-QNM), como tocar modo AFM, evita interações laterais por forma intermitente contactar a amostra (Figura 2). 12-15 &lt;/ Sup&gt; No entanto, PF-QNM opera em modo não-ressonante e freqüências muito mais baixas do que pressionar de modo AFM. Isto elimina os desafios de ajuste de modo tapping-AFM, particularmente aqueles exacerbado pela presença de fluido. Com PF-QNM, as imagens são coletadas, tendo uma curva de resposta de força em todos os pontos de contato. Com a adição do software ScanAsyst, 15 de ajuste dos parâmetros de digitalização pode ser automatizado e uma imagem de alta resolução obtidas em questão de minutos, mesmo por usuários inexperientes. Uma vez que o utilizador se torna mais familiarizados com a AFM, qualquer ou todos os parâmetros automatizadas podem ser desactivado em qualquer altura que permita o experimentalista para aperfeiçoar a qualidade de imagem manualmente. Desde a sua criação, PF-QNM foi aplicada para mapear bacteriorhodopsin, uma proteína de membrana e outras proteínas nativas no nível submolecular 16-18 Para bacteriorhodopsin., Há uma correlação direta entre a flexibilidade da proteína e de raios-X estruturas cristalográficas. 12 PF -qnM tem sido utilizada para investigar as células vivas com alta resolução. 19,20 importantes ligações Além disso, os dados de FP-QNM elucidou entre estrutura e mecânica dentro da membrana dos eritrócitos que são essenciais para a integridade e a função da célula 21. Nós empregamos microscopia de varredura por sonda (SPM) métodos, incluindo 22 AFM, 23 para estudar a estrutura de fotorreceptores de luz vermelha chamada bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 Eles consistem de um módulo de detecção de luz covalentemente ligados a um módulo de sinalização efetuador tais como histidina quinase (HK) 26. O módulo de luz de detecção normalmente contém um cromóforo bilin que passa por uma transformação estrutural mediante a absorção de um fóton, com uma série de mudanças estruturais que atingem o módulo de sinalização efetuador e levando a uma transformação global de toda a proteína . 24,27-29 Com base nesta transformação, existem duas cadeias leves distintas de absorção sstados de BphPs, uma luz absorvendo estado vermelho e vermelho-extremo, denominado Pr e Pfr. Pr é termicamente estável, o estado de adaptação ao escuro para a maioria dos BphPs. 28 A base molecular da Pr / Pfr fotoconversão não é totalmente compreendido, devido ao conhecimento limitado estrutural dessas proteínas. Com a exceção de uma estrutura de D. radiodurans, 30 todas as estruturas cristalográficas de raio-X publicados destas proteínas são no estado de adaptação ao escuro e carecem de domínio efector. Os BphPs intactos são demasiado grandes para serem eficazmente estudada por Ressonância Magnética Nuclear (RMN), e são difíceis de cristalizar na sua forma intacta (em particular no estado de luz adaptado) para a cristalografia de raios-X. BphPs foram recentemente projetado como marcadores de proteínas fluorescentes infravermelho (IFP). 31 Caracterização estrutural dessas proteínas pode ajudar ainda mais no design IFP eficaz. 32-36 O foco deste artigo é apresentar um procedimento paraimagiologia de BphPs utilizando AFM-célula através do líquido PF-QNM. O método é demonstrado pelos estudos de estado de luz adaptado do RpBphP3 bacteriophytochrome (P3) a partir da bactéria fotossintética R. palustris. O procedimento aqui apresentado é AFM abordagem conveniente e simples para a imagiologia de proteínas, bem como de outras macromoléculas biológicas. Com este método, os detalhes estruturais de moléculas individuais podem ser recolhidas num curto período de tempo, semelhante a um curso de ciência sessão de laboratório de nível superior. Através de medição secções transversais e completando mais análises dimensionais, os dados experimentais pode ser comparado a modelos computacionais úteis 37-42.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog #</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O4997-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode 8 AFM</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>492-008-011</td>
			<td>equipped with Nanoscope V controller and J scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>SNL-10, ScanAsyst-Fluid+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapping Mode Fluid Cell</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>MTFML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica V-4 Grade</td>
			<td>SPI supplies</td>
			<td>1150503</td>
			<td>25 x 25 x .26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample support disk</td>
			<td>nanoSurf</td>
			<td>BT02236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Plasta-Medic, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>100 mm x 15 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipettors</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>XL 3000i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RpBphP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared according to cited references</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoscope software</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light</td>
			<td>Digital Instruments Inc.</td>
			<td>F0-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco AFM Disc Gripper</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>1668</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>102-ST1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>C2171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1</td>
			<td>Schrodinger, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy of red-light photoreceptors using peakforce quantitative nanomechanical property mapping

Microscopia de força atômica (AFM) usa uma ponta piramidal anexado a um cantilever para sondar a resposta força de uma superfície. Os desvios de ponta pode ser medido para ~ 10 pN por um detector de laser e dividida em sectores, que pode ser convertido em imagem topografia. Modulação de amplitude ou AFM &quot;modo de tocar&quot; envolve a sonda fazer contato intermitente com a superfície, enquanto oscilando em sua freqüência de ressonância para produzir uma imagem. Usado em conjunto com uma célula de fluido, tocando-AFM modo permite a imagiologia de macromoléculas biológicas, tais como proteínas em condições fisiologicamente relevantes. Tocar de modo AFM requer sintonia manual da sonda e ajustes frequentes de uma infinidade de parâmetros de verificação que pode ser um desafio para usuários inexperientes. Para obter imagens de alta qualidade, esses ajustes são mais demoradas. PeakForce Quantitative nanomecânicos mapeamento da propriedade (PF-QNM) produz uma imagem medindo a respon vigorcurva se para cada ponto de contato com a amostra. Com o software ScanAsyst, PF-QNM pode ser automatizado. Este software ajusta o set-point, a frequência da unidade, taxa de varredura, os ganhos, e outros parâmetros de digitalização importantes automaticamente para uma determinada amostra. Não só este processo de proteger ambas as sondas frágeis e amostras, que reduz significativamente o tempo necessário para obter imagens de alta resolução. PF-QNM é compatível para imagens AFM de fluido; portanto, ele tem uma vasta aplicação para geração de imagens materiais biologicamente relevantes. O método apresentado neste artigo descreve a aplicação de PF-QNM para obter imagens de uma bacteriana fotorreceptor da luz vermelha, RpBphP3 (P3), a partir da fotossíntese R. palustris no seu estado adaptado luz. Usando este método, os dímeros de proteínas individuais de P3 e agregados de dímeros foram observados sobre uma superfície de mica na presença de um tampão de imagens. Com os ajustes apropriados para a superfície e / ou concentração da solução, este métodopode ser geralmente aplicada a outras macromoléculas biologicamente relevantes e materiais macios.

Imagens AFM representativos de uma proteína de fotorreceptores, P3, no seu estado adaptado-luz são apresentados nas Figuras 3 e 4. Um substrato de mica clivada de fresco, (Figura 3A) é uma superfície adequada, plana para a adsorção de proteínas. Recolha de uma imagem de mica limpo como um controlo negativo é importante por várias razões. Em primeiro lugar, ele garante a célula líquido é limpo e sem materiais residuais de experimentos anteriores irá contami...

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Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

Microscopia de Força Atômica da Red-Light fotorreceptores Usando Mapeamento PeakForce Quantitative nanomecânicos Propriedade

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

atomic-force-microscopy-red-light-photoreceptors-using-peakforce

Research

JoVE Journal

Engineering

11.6K visualizações.  Northeastern Illinois University. A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface. 

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Preparation and Friction Force Microscopy Measurements of Immiscible, Opposing Polymer Brushes

Solvated polymer brushes are well known to lubricate high-pressure contacts, because they can sustain a positive normal load while maintaining low friction at the interface. Nevertheless, these systems can be sensitive to wear due to interdigitation of the opposing brushes. In a recent publication, we have shown via molecular dynamics simulations and atomic force microscopy experiments, that using an immiscible polymer brush system terminating the substrate and the slider surfaces, respectively, can eliminate such interdigitation. As a consequence, wear in the contacts is reduced. Moreover, the friction force is two orders of magnitude lower compared to traditional miscible polymer brush systems. This newly proposed system therefore holds great potential for application in industry. Here, the methodology to construct an immiscible polymer brush system of two different brushes each solvated by their own preferred solvent is presented. The procedure how to graft poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) from a flat surface and poly(methyl methacrylate) (PMMA) from an atomic force microscopy (AFM) colloidal probe is described. PNIPAM is solvated in water and PMMA in acetophenone. Via friction force AFM measurements, it is shown that the friction for this system is indeed reduced by two orders of magnitude compared to the miscible system of PMMA on PMMA solvated in acetophenone.

The methodology to perform friction force microscopy experiments for contacting brushes is presented: Two polymer brushes that are grafted from (a) substrates and (b) colloidal probes are slid to show that, by using two contacting immiscible brush systems, friction in sliding contacts is reduced compared to miscible brush systems.

Preparação e Friction Microscopia de Força Medidas do Insolúvel, opondo-Polymer Brushes

Solvated polymer brushes are well known to lubricate high-pressure contacts, because they can sustain a positive normal load while maintaining low ...

Engenharia

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Investigando única molécula de adesão de Força Atômica Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

Sub-nanômetros de imagem resolução com Amplitude modulação Microscopia de Força Atômica no líquido

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

An Efficient Method for Selective Desalination of Radioactive Iodine Anions by Using Gold Nanoparticles-Embedded Membrane Filter

Here, we demonstrate a detail protocol for the preparation of nanomaterials-embedded composite membranes and its application to the efficient and ion-selective removal of radioactive iodines. By using citrate-stabilized gold nanoparticles (mean diameter: 13 nm) and cellulose acetate membranes, gold nanoparticle-embedded cellulose acetate membranes (Au-CAM) have easily been fabricated. The nano-adsorbents on Au-CAM were highly stable in the presence of high concentration of inorganic salts and organic molecules. The iodide ions in aqueous solutions could rapidly be captured by this engineered membrane. Through a filtration process using an Au-CAM containing filter unit, excellent removal efficiency (&gt;99%) as well as ion-selective desalination result was achieved in a short time. Moreover, Au-CAM provided good reusability without significant decrease of its performances. These results suggested that the present technology using the engineered hybrid membrane will be a promising process for the large-scale decontamination of radioactive iodine from liquid wastes.

An efficient method for the rapid and ion-selective desalination of radioactive iodine in several aqueous solutions is described by using gold nanoparticles-immobilized cellulose acetate membrane filters.

Um método eficiente para dessalinização seletiva de iodo radioativo ânions usando filtro de membrana incorporado de nanopartículas de ouro

Here, we demonstrate a detail protocol for the preparation of nanomaterials-embedded composite membranes and its application to the efficient and ...

Surface Mapping of Earth-like Exoplanets using Single Point Light Curves

Spatially resolving exoplanet features from single-point observations is essential for evaluating the potential habitability of exoplanets. The ultimate goal of this protocol is to determine whether these planetary worlds harbor geological features and/or climate systems. We present a method of extracting information from multi-wavelength single-point light curves and retrieving surface maps. It uses singular value decomposition (SVD) to separate sources that contribute to light curve variations and infer the existence of partially cloudy climate systems. Through analysis of the time series obtained from SVD, physical attributions of principal components (PCs) could be inferred without assumptions of any spectral properties. Combining with viewing geometry, it is feasible to reconstruct surface maps if one of the PCs are found to contain surface information. Degeneracy originated from convolution of the pixel geometry and spectrum information determines the quality of reconstructed surface maps, which requires the introduction of regularization. For the purpose of demonstrating the protocol, multi-wavelength light curves of Earth, which serves as a proxy exoplanet, are analyzed. Comparison between the results and the ground truth is presented to show the performance and limitation of the protocol. This work provides a benchmark for future generalization of exoplanet applications.

The protocol extracts information from light curves of exoplanets and constructs their surface maps. It uses light curves of Earth, which serves as a proxy exoplanet, to demonstrate the approach.

Mapeamento de superfície de exoplanetas semelhantes à Terra usando curvas de luz de ponto único

Spatially resolving exoplanet features from single-point observations is essential for evaluating the potential habitability of exoplanets. The ultimate ...

Optimizing Magnetic Force Microscopy Resolution and Sensitivity to Visualize Nanoscale Magnetic Domains

Magnetic force microscopy (MFM) enables mapping local magnetic fields across a sample surface with nanoscale resolution. To perform MFM, an atomic force microscopy (AFM) probe whose tip has been magnetized vertically (i.e., perpendicular to the probe cantilever) is oscillated at a fixed height above the sample surface. The resultant shifts in the oscillation phase or frequency, which are proportional to the magnitude and sign of the vertical magnetic force gradient at each pixel location, are then tracked and mapped. Although the spatial resolution and sensitivity of the technique increases with decreasing lift height above the surface, this seemingly straightforward path to improved MFM images is complicated by considerations such as minimizing topographical artifacts due to shorter range van der Waals forces, increasing the oscillation amplitude to further improve sensitivity, and the presence of surface contaminants (in particular water due to humidity under ambient conditions). In addition, due to the orientation of the probe's magnetic dipole moment, MFM is intrinsically more sensitive to samples with an out-of-plane magnetization vector. Here, high-resolution topographical and magnetic phase images of single and bicomponent nanomagnet artificial spin-ice (ASI) arrays obtained in an inert (argon) atmosphere glovebox with &lt;0.1 ppm O2 and H2O are reported. Optimization of lift height and drive amplitude for high resolution and sensitivity while simultaneously avoiding the introduction of topographical artifacts is discussed, and detection of the stray magnetic fields emanating from either end of the nanoscale bar magnets (~250 nm long and &lt;100 nm wide) aligned in the plane of the ASI sample surface is shown. Likewise, using the example of a Ni-Mn-Ga magnetic shape memory alloy (MSMA), MFM is demonstrated in an inert atmosphere with magnetic phase sensitivity capable of resolving a series of adjacent magnetic domains each ~200 nm wide.

Magnetic force microscopy (MFM) employs a vertically magnetized atomic force microscopy probe to measure sample topography and local magnetic field strength with nanoscale resolution. Optimizing MFM spatial resolution and sensitivity requires balancing decreasing lift height against increasing drive (oscillation) amplitude, and benefits from operating in an inert atmosphere glovebox.

Otimizando a resolução e a sensibilidade da microscopia de força magnética para visualizar domínios magnéticos em nanoescala

Magnetic force microscopy (MFM) enables mapping local magnetic fields across a sample surface with nanoscale resolution. To perform MFM, an atomic force ...

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

Nanoindentação baseada em cantilever por microscopia de força atômica: medidas de propriedades mecânicas em nanoescala no ar e fluido

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Matrizes cantilever ativas paralelas no AFMS para permitir inspeções de alto rendimento

Active Probe Atomic Force Microscopy with Quattro-Parallel Cantilever Arrays for High-Throughput Large-Scale Sample Inspection

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. However, due to their limited imaging throughput, AFMs have not been widely adopted for large-scale inspection purposes. Researchers have developed high-speed AFM systems to record dynamic process videos in chemical and biological reactions at tens of frames per second, at the cost of a small imaging area of up to several square micrometers. In contrast, inspecting large-scale nanofabricated structures, such as semiconductor wafers, requires nanoscale spatial resolution imaging of a static sample over hundreds of square centimeters with high productivity. Conventional AFMs use a single passive cantilever probe with an optical beam deflection system, which can only collect one pixel at a time during AFM imaging, resulting in low imaging throughput. This work utilizes an array of active cantilevers with embedded piezoresistive sensors and thermomechanical actuators, which allows simultaneous multi-cantilever operation in parallel operation for increased imaging throughput. When combined with large-range nano-positioners and proper control algorithms, each cantilever can be individually controlled to capture multiple AFM images. With data-driven post-processing algorithms, the images can be stitched together, and defect detection can be performed by comparing them to the desired geometry. This paper introduces principles of the custom AFM using the active cantilever arrays, followed by a discussion on practical experiment considerations for inspection applications. Selected example images of silicon calibration grating, highly-oriented pyrolytic graphite, and extreme ultraviolet lithography masks are captured using an array of four active cantilevers (&#34;Quattro&#34;) with a 125 &#181;m tip separation distance. With more engineering integration, this high-throughput, large-scale imaging tool can provide 3D metrological data for extreme ultraviolet (EUV) masks, chemical mechanical planarization (CMP) inspection, failure analysis, displays, thin-film step measurements, roughness measurement dies, and laser-engraved dry gas seal grooves.

Autor em destaque: Introdução à microscopia de força atômica de sonda ativa com matrizes de cantilever quattro-paralelos

Large-scale sample inspection with nanoscale resolution has a wide range of applications, especially for nanofabricated semiconductor wafers. Atomic force microscopes can be a great tool for this purpose, but are limited by their imaging speed. This work utilizes parallel active cantilever arrays in AFMs to enable high-throughput and large-scale inspections.

Microscopia de Força Atômica de Sonda Ativa com Matrizes Cantilever Paralelas Quattro para Inspeção de Amostras em Grande Escala de Alto Rendimento

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. ...