Nós gostaríamos de agradecer a equipe e cientistas SBI para o seu apoio no desenvolvimento e testes destes protocolos.

1. Transfecção de células 293TN com plasmídeos de empacotamento e a construção de expressão <ol><li> Semente 7,0-8,0 x 10 6 293TN células por placa de cultura de 15 centímetros 2 em 20 ml de meio de cultura contendo meio DMEM suplementado com 4 mM L-glutamina, 4,5 g de glicose / l, e soro fetal de bovino (10%) sem antibióticos. Crescer durante 18-24 horas a 37 ° C com 5% de CO 2, de modo que a densidade celular alcança 60-80% de confluência no momento da transfecção. Em alguns casos, pode ser necessário para placas de semente várias das células para se obter um título suficientemente elevado para a transdução de células alvo. </li><li> Para cada placa de células, adicionar 1,6 ml de DMEM isento de soro para um tubo de 2 ml autoclavado Eppendorff. Adicionar 45 mg pPACKH1 ou pPACKF1 e 4,5 ul de seu lentivector construir o DMEM e misture pipetando para cima e para baixo. </li><li> Adicionar 55 ul de PureFection no mesmo tubo. Vortex durante 10 segundos. Incubar a DMEM-PureFection Plasmid-mistura em temperatura ambiente fou 15 min. </li><li> Adicione o DMEM-PureFection Plasmid-mistura para a placa de cultura de tecido, gota a gota e agite cuidadosamente para dispersar uniformemente em todo o prato. Retornar o prato para a incubadora e crescer a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Não há necessidade de alterar o suporte após a transfecção. Se a sua construção lentivector expressa um gene que codifica uma proteína fluorescente como GFP, verificar as suas células sob um microscópio de 12-24 horas após a transfecção. Deverá ser capaz de ver&gt; células 90% GFP-positiva, indicando que a transfecção foi bem sucedida. </li><li> Recolher o sobrenadante da cultura celular após 48 e 72 horas em um tubo de centrífuga de 50 ml estéril. Este sobrenadante da cultura celular agora contém partículas infecciosas pseudoviral. (Seguir as orientações recomendadas para trabalhar com NBS-2 classe de segurança.) Centrifugar a 1.500 xg durante 15 min à temperatura ambiente para sedimentar os detritos celulares. Transferir o sobrenadante viral para um novo tubo, assegurando para não perturbar o sedimento. </li><li> Células 293TN que têm sido utilizados para a embalagem viral devem ser eliminados de um recipiente de risco biológico e não são para ser utilizado para outras rondas de embalagem viral. </li></ol> 2. Concentração do sobrenadante viral <ol><li> Adicionar 1 volume de frio (4 ° C) de PEG-se da solução de precipitação de vírus a cada 4 volumes de sobrenadante de partícula contendo lentiviral. Precipitação de partículas lentivirais de grandes volumes pode ser conseguido com Corning 250 ml tubos de centrífuga de polipropileno. Misturar a solução por vezes invertendo os vários tubos, mas não vórtice da mistura. </li><li> A solução no frigorífico a 4 ° C durante pelo menos 12 horas (até 4 dias é aceitável). Não agitar ou girar os tubos durante a etapa de refrigeração. </li><li> Centrifugar a mistura / PEG-se o sobrenadante a 1.500 xg durante 30 minutos a 4 ° C. Após centrifugação, as partículas lentivirais aparecerá como um bege ou pelete branco no fundo do tubo. Despeje a supernatant. </li><li> Remova todos os vestígios de fluidos por aspiração, tomando cuidado para não perturbar as partículas precipitadas lentivirais no sedimento. Vestígios de residual de PEG-vai diluir o vírus (reduzindo assim a titulação), mas não vai afectar a integridade das células alvo desde PEG-é inerte e não tóxico. </li><li> Ressuspender e combinar as partículas lentivirais em 1/100 do volume original usando frio (4 ° C), fosfato estéril ou solução salina tamponada com DMEM contendo 25 mM de tampão HEPES. </li><li> Alíquota em frascos estéreis criogénicos e armazenar a -70 ° C até estar pronto para utilização. </li></ol> 3. A titulação viral e Transdução de células-alvo <ol><li> Sugerimos titulação das partículas de lentivirais antes transduzir células alvo de interesse e calculando a multiplicidade apropriado de infecção (MOI) para as células-alvo para a consistência entre experiências. Para titulação viral, recomendamos o uso de células HT1080 como uma linha de controle fácil de infectar positivo. Plfacilidade notar que o protocolo de titulação envolve transduzir células HT1080 com uma pequena alíquota das partículas lentivirais tiver embalados. Uma vez que o título é conhecido, as células-alvo de interesse também podem ser transduzidas com as partículas produzidas lentivirais. Um protocolo de titulação recomendo pode ser encontrado em: <a href="http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf</a> 7. </li><li> Placa de 50.000 células-alvo de interesse por poço numa placa de 24 poços em meios de cultura de células. Utilize os meios de comunicação que as células são normalmente cultivadas dentro crescer as células durante a noite em suas condições de cultura especificadas. Células deve ser entre 50 a 70% confluentes no dia da transdução. </li><li> No dia da transdução, aspirar os meios de comunicação das células. Combinar meio de cultura com TransDux a uma concentração final de 1 x (por exemplo, 2,5 TransDux uL a 500 uL de meio de cultura). Em seguida, transferir o TransDux-cemistura médio ll cultura a cada poço. </li><li> Pipetar o volume apropriado de vírus que corresponde ao óptimo MOI para as células-alvo em cada poço. Se o MOI óptima é desconhecida, é recomendável tentar uma gama de MOIs diferentes (tal como um MOI de 1, 2 e 5, para fácil de infectar as células de cultura de tecidos, e uma MOI de 1, 10 e 20 para mais difícil -infectar as células primárias). Se a concentração das partículas lentivirais não é conhecido (tal como determinado através de um protocolo de titulação do vírus), diferentes volumes de vírus pode ser tentado, tal como 1, 2 e 5 ul de vírus. O vírus pode permanecer em contacto com as células-alvo por até 72 horas. </li><li> Outras experiências com a células transduzidas de interesse-alvo pode ser iniciado 72 horas após a transdução, uma vez que o construto viral tem integrado no genoma da célula hospedeira. Alterar a médio e passagem a células alvo de interesse de acordo com suas necessidades específicas. </li></ol> 4. Os resultados representativos <pclass = &quot;jove_step&quot; transfecção&gt; de células 293TN A densidade de partida das células 293TN é crítica para a embalagem viral bem sucedida. Células 293TN deve estar entre 60 -80% confluentes no dia da transfecção (Figura 2). Se as células 293TN são menos do que 60% confluentes, permitir-lhes a crescer durante mais algumas horas antes de se tentar a transfecção. Se as células são 293TN&gt; confluente a 80%, eles devem ser replated antes da transfecção. Se usando um GFP lentivector expressando, pelo menos 90% das células 293TN deve fluorescência verde 24 horas após a transfecção, indicando uma transfecção bem sucedida (Figura 3). Se menos de 90% das células são GFP-positiva, não se prosseguir para o passo seguinte, porque isso indica que a transfecção não foi bem sucedida, e os títulos virais será baixa. Em vez disso, placas novas células 293TN e começar de novo, certificando-se que as células 293TN estão na densidade celular adequada antes da transfecção. Células 293TN podem retirar as placas de cultura de tecidos de 48-72 horas após a transfecção. Isso não afeta negativamente a produção de partículas lentivirais. Titulação com células HT1080 Os títulos virais pode ser calculada usando o kit da SBI titulação global ultra-rápida de acordo com as instruções do fabricante. Este sistema utiliza qPCR para medir a integração virai da sequência WPRE a partir do vector lentiviral em células HT1080 e compara esta com uma curva padrão, com base numa sequência de referência genómico para medir com precisão unidades infecciosas por ml (Figura 4). Transdução de células alvo Se o uso de partículas lentivirais que expressam um marcador GFP constitutivamente activa, células GFP positivas devem começam a aparecer dentro de 12-24 horas de transdução, se a reacção de transdução está a funcionar. Expressão GFP deve continuar após a construção lentiviral estavelmente integra-se tele hospedar genoma da célula. Se transdução com MOIs diferentes, a fluorescência da GFP deve coincidir com a aproximadamente MOI, em que MOI baixas mostram fluorescência menos GFP e MOIs superiores mostram aumento GFP de fluorescência (Figura 5). <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. Visão geral do protocolo de produção viral. Os plasmídeos de empacotamento lentivector e PPACK são misturados e co-transfectados em células 293TN. Depois de 48 -72 horas, o sobrenadante viral é recolhido, e partículas virais são precipitadas com PEG-lo. Após titulação das partículas de lentivirais, eles podem ser usados ​​para transduzir células-alvo de interesse. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3171/3171fig1large.jpg" target="_blank">para ver figura maior</a> . <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. Imagem de contraste de fase das células 293TN. Densit celulary deverá estar entre 60-80% confluentes no dia da transfecção. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. Imagem fluorescente de células GFP positivas 293TN 24 horas após a transfecção com Purefection, pPACKH1, e uma codificação de GFP lentivector construto. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig4.jpg" alt="A Figura 4" /> Figura 4. Resultados qPCR WPRE e curva padrão obtida usando o kit da SBI titulação global ultra-rápida para calcular MOI e titulação correspondente de embalados partículas virais. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig5.jpg" alt="A Figura 5" /> Figura 5. Imagens fluorescentes das células HT1080 transduzidas com quantidades crescentes de lentivírus. As imagens são de 72 horas pós-transdução.

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	<li>Cann, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA Viruses. A Practical Approach. , (2000).</li><li>Gould, D. J., Favorov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+for+the+treatment+of+autoimmune+diseases.">Vectors for the treatment of autoimmune diseases.</a> Gene Therapy. 10, 912-927 (2003).</li><li>Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfer,+integration,+and+sustained+long-term+expression+of+the+transgene+in+adult+rat+brains+injected+with+a+lentiviral+vector.">Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).</li><li>Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Dull, T., Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li><li>Federico, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lentivirus Gene Engineering Protocols. , (2003).</li><li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors.">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol. Ther. 1, 31-38 (2000).</li><li>Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells.">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343-1348 (2010).</li><li>Kim, A., Pyykko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters:+versatile+use+of+PiggyBac+transposons+as+a+genetic+manipulation+tool.">Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool.</a> Mol. Cell Biochem. , (2011).</li></ol>

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Esta embalagem viral e transdução de protocolo de células-alvo foi otimizado para uso com reagentes virais SBI da embalagem. A substituição de outros reagentes podem afectar o resultado do protocolo. Este protocolo só foi optimizado para a produção de lentiviral e pode não ser adequado para produzir outros tipos de vírus ou pseudoviruses. Embalagem viral de sucesso é dependente de vários passos-chave. As células 293TN expressar o antigénio T de SV40 grande, o que é absolutamente necessário para a secreção das partículas lentivirais para o sobrenadante da cultura celular. A densidade a qual as células são 293TN no momento da transfecção é especialmente importante para que o reagente PureFection para transferir o suficientemente lentivector e plasmídeos de embalagem para as células. Adicionando-se a mistura PureFection à placa de cultura de tecido de uma maneira gota a gota, seguido por agitação completamente a placa é importante para a dispersão dos plasmídeos de empacotamentoe lentivector construir longo de todas as células. A falta de apropriadamente distribuir os vectores podem resultar em partículas insuficientes lentivirais sendo produzidos. A reacção de embalagem viral pode ser dimensionada para cima para a produção de vírus de título elevado, com base na área de superfície das placas de cultura de tecidos. Pode-se escolher a placa pratos de tecido de cultura de várias células 293TN por construção que tem de ser embalado. Concentração dos sobrenadantes virais é especialmente útil na criação de alta título de vírus. Sobrenadante viral a partir de placas múltiplas de células podem ser combinadas e concentradas para utilização em experiências in vivo, ou para as células que são difíceis de transduzir. Titulação das partículas produzidas lentivirais é importante para o cálculo preciso uma MOI para usar para a transdução de células alvo. Conhecendo o MOI que foi usado na transdução de uma dada permite solução de problemas no caso em que a transdução não é bem sucedido. Por exemplo, usando uma MOI que édemasiado baixa pode resultar em células alvo que expressam muito poucos o constructo de interesse. Usando uma MOI que é demasiado elevado, no entanto, pode resultar em células alvo que mostram sinais de stress. O objectivo é usar uma MOI que maximiza a expressão do construto de interesse, preservando a saúde das células. Embora recomendamos um protocolo de titulação qPCR baseado que mede cópias integradas do construto lentiviral em células HT1080, as abordagens titulação outros podem também ser utilizados, tais como ELISA p24 ou estimativa da percentagem de células positivas para GFP. Transdução de sucesso das células-alvo também depende vários fatores importantes. TransDux é um reagente de infecção único que permite eficiências de transdução elevados, mas que não é tóxico para as células. TransDux pode ser usado em vez de polibreno, que é frequentemente tóxicos para as células-alvo. A inclusão de TransDux na transdução das células alvo ajuda a neutralizar cargas sobre as partículas virais e permite que o vírus na células. Uma vez que TransDux não é tóxico para as células, pode-se permitir que as partículas lentivirais a permanecer em contacto com as células durante até 72 horas (o tempo em que as construções virais foram integrados no genoma da célula hospedeira), aumentando assim a probabilidade de o partículas virais de entrar na célula. Para algumas células de difícil transduzir, transduções pode ser repetido em dias sucessivos para aumentar a eficiência de transdução. Por exemplo, transduzir as células no dia 1, permitir que as células para descansar no dia 2 e, em seguida transduzir as células novamente no dia 3. É importante que esperar 72 horas após a transdução última antes da selecção início, experiências adicionais ou caracterização das células alvo. Embalagem viral eficiente é também dependente do tamanho do construto lentiviral, entre a 5 &#39;e as regiões LTR 3&#39;. Esta secção do construto lentiviral deve ser de aproximadamente 9 kb ou menos, o que corresponde ao tamanho do genoma do HIV nativo. Superior a 9 de maio de kbtítulo vinque o das partículas produzidas pseudoviral. A nova tecnologia, tais como vectores piggyBac transposão, permitir a integração, fiável estável de transgenes até 100 kb, através de uma transfecção único. Esta abordagem pode ser utilizada para construções que excedem o limite de tamanho para lentivirais, nos casos em que é possível transfectar células alvo, e proporciona a vantagem adicional de não necessitar de um passo de embalagem viral 9,10. As partículas pseudoviral produzidos utilizando este protocolo são infecciosas em que eles podem infectar os tipos de células mais de mamíferos. Os produtos utilizados neste protocolo, no entanto, são de terceira geração Biosafe em que eles produzem não-replicativa e auto-inativadoras pseudoviruses. Portanto, uma vez em células alvo transduzidas ou animais, as células alvo ou animais não são infecciosas ou contagiosas. A substituição de outros plasmídeos lentivector que não são de terceira geração Biosafe é possível, embora não recomendado a partir de um biossegurançaperspectiva. O protocolo de produção viral e subseqüente de transdução de células alvo deve ser realizada sob o Nível de Biossegurança 2, de acordo com as diretrizes do NIH 11, e os pesquisadores devem sempre usar um jaleco e luvas ao manusear as partículas virais. Utilizadas células produtoras 293TN, tubos de partículas virais, e pipetas descartáveis ​​devem ser eliminados em um recipiente adequado de risco biológico. Pipetas de vidro reutilizáveis ​​e devem ser descontaminados com água sanitária e autoclave para diminuir a exposição do pessoal.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Meio DMEM glucose elevada </td><td> Gibco </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> Células 293TN </td><td> SBI </td><td> LV900A-1 </td><td></td></tr><tr><td> pPACKH1 </td><td> SBI </td><td> LV500A-1 </td><td> Para o HIV baseados lentivectors </td></tr><tr><td> pPACKF1 </td><td> SBI </td><td> LV100A-1 </td><td> Para FIV baseados lentivectors </td></tr><tr><td> Qualquer vetor shRNA </td><td> SBI </td><td> Vário </td><td> cDNA, Plasmideo, microRNA, repórteres de transcrição </td></tr><tr><td> PureFection </td><td> SBI </td><td> LV750A-1 LV750A-5 </td><td></td></tr><tr><td> PEG-lo </td><td> SBI </td><td> LV810A-1 LV825A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Kit titulação global ultra-rápido </td><td> SBI </td><td> LV961A-1 </td><td> Não descrito neste protocolo, mas necessário para título as partículas virais </td></tr><tr><td> TransDux </td><td> SBI </td><td> LV850A-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

packaging hiv- or fiv-based lentivector expression constructs &amp; transduction of vsv-g pseudotyped viral particles

Tal como com vectores plasmídicos padrão, é possível para transfectar lentivectors em forma de plasmídeo em células com baixo a médio eficiência para obter a expressão transiente de efectores. Construções de embalagem lentivirais expressão em partículas pseudoviral, contudo, permite-se a transdução de 100%, mesmo com difícil de transfectar células, tais como caule, primário, e as células diferenciadas. Além disso, a entrega lentiviral não produz as respostas celulares específicas tipicamente associados com transfecções químicos, tais como a morte celular resultante da toxicidade do reagente de transfecção 1, 2. Quando transduzida em células alvo, o construto lentiviral integra no DNA genómico e fornece a expressão estável do pequeno hairpin RNA (shRNA), microRNA, ADNc ou gene repórter 3, 4. As células alvo de forma estável que expressam a molécula efectora pode ser isolado usando um marcador seleccionável contido no vector de expressão, tais como construir puromicina ou GFP. Depois pspartículas eudoviral infectar as células-alvo, eles não podem replicar dentro das células alvo, porque os genes virais estruturais estão ausentes e as repetições terminais longas (LTR) são concebidos para ser auto-inactivação após transdução 5, 6. Existem três componentes principais que são necessárias para a embalagem lentiviral eficiente 1, 5, 6, 7. <ol><li> O vector de expressão que contém lentiviral alguns dos elementos genéticos necessários para a embalagem, a integração estável do expressão viral construir no ADN genómico, e expressão do efectora ou repórter. </li><li> Os plasmídeos de empacotamento lentivirais que fornecem as proteínas essenciais para a transcrição e embalagem de uma cópia de RNA da construção de expressão em partículas recombinantes pseudoviral. Este protocolo utiliza a plasmídeos PPACK (SBI) que codificam para gag, pol e rev a partir do genoma do HIV ou FIV e Virus da Estomatite Vesicular g de proteína (VSV-G) para a proteína de revestimento virai. </li><li> 293TN produzir<html> células r (derivado de células HEK293) que expressam o antigénio T de SV40 grande, o que é necessário para a produção de título elevado lentiviral e um gene de resistência à neomicina, útil para reselecting as células para a manutenção. </li></ol> Uma visão geral do protocolo de produção virai pode ser visto na Figura 1. Produção virai começa por co-transfecção de células produtoras 293TN com o vector de expressão lentiviral e os plasmídeos de empacotamento. As partículas virais são secretados na mídia. Depois de 48-72 horas os meios de cultura de células é colhida. Detritos celulares é removido dos meios de cultura de células, e as partículas virais são precipitadas por centrifugação com PEG-lo para a concentração. Produzidos partículas lentivirais são então titulado e pode ser usado para transduzir células alvo. Detalhes da titulação viral não estão incluídos neste protocolo, mas pode ser encontrado em: ank &quot;&gt; http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8. Este protocolo foi optimizado usando os produtos específicos indicados. Outros reagentes podem ser substituídos, mas os mesmos resultados não pode ser garantida.

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Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Vectores de expressão lentivirais são os veículos mais eficazes para expressando estavelmente diferentes moléculas efectoras ou construções repórter em divisão e não se dividem as células de mamíferos e organismos inteiros. Aqui nós fornecemos um protocolo sobre como empacotar construções de expressão lentivector em partículas pseudoviral e transdução de células alvo, utilizando as partículas pseudoviral.

Embalagem HIV-FIV ou à base de construções de expressão e Lentivector Transdução de Partículas Pseudotyped VSV-G virais

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

packaging-hiv-or-fiv-based-lentivector-expression-constructs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.9K visualizações.  System Biosciences. Vectores de expressão lentivirais são os veículos mais eficazes para expressando estavelmente diferentes moléculas efectoras ou construções repórter em divisão e não se dividem as células de mamíferos e organismos inteiros. Aqui nós fornecemos um protocolo sobre como empacotar construções de expressão lentivector em partículas pseudoviral e transdução de células alvo, utilizando as partículas pseudoviral.

Vídeo: Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Imunologia e Infecção

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Amplificar e Quantificação do HIV-1 RNA no indivíduos infectados pelo HIV com carga viral abaixo do limite de detecção pela Standard Ensaios Clínicos

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Triagem rápida de HIV transcriptase reversa e integrase Inibidores

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

Repórter Vaccinia vírus para quantificar Função Viral em todas as fases da Expressão Gênica

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be difficult. To overcome this challenge, a methodology combining indexed flow cytometry and high-throughput multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was developed. The objective was to identify and characterize simian immunodeficiency virus (SIV)-infected cells present within rhesus macaques. Through quantitation of surface protein by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mRNA by qPCR, virus-infected cells are identified by viral gene expression, which is combined with host gene and protein measurements to create a multidimensional profile. We term the approach, targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation, or tSCEPTRE. To perform the method, viable cells are stained with fluorescent antibodies specific for surface markers used for FACS isolation of a cell subset and/or downstream phenotypic analysis. Single cells are sorted followed by immediate lysis, multiplex reverse transcription (RT), PCR pre-amplification, and high throughput qPCR of up to 96 transcripts. FACS measurements are recorded at the time of sorting and subsequently linked to the gene expression data by well position to create a combined protein and transcriptional profile. To study SIV-infected cells directly ex vivo, cells were identified by qPCR detection of multiple viral RNA species. The combination of viral transcripts and the quantity of each provide a framework for classifying cells into distinct stages of the viral life cycle (e.g., productive versus non-productive). Moreover, tSCEPTRE of SIV+ cells were compared to uninfected cells isolated from the same specimen to assess differentially expressed host genes and proteins. The analysis revealed previously unappreciated viral RNA expression heterogeneity among infected cells as well as in vivo SIV-mediated post-transcriptional gene regulation with single-cell resolution. The tSCEPTRE method is relevant for the analysis of any cell population amenable to identification by expression of surface protein marker(s), host or pathogen gene(s), or combinations thereof.

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Described is a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo, allowing for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells. We apply the approach to study SIV-infected CD4+ T cells isolated from rhesus macaques.

Célula única quantificação de mRNA e expressão de proteínas de superfície em CD4 infectados por vírus de imunodeficiência simiana+ T células isoladas de macacos Rhesus

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Um elevado-throughput Cre-Lox ativado ensaio de fusão da membrana Viral para identificar inibidores de fusão da membrana Viral do HIV-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Produção de partículas Pseudotyped para estudar a alta patogenicidade coronavírus em uma configuração de nível 2 de biossegurança

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Produção de partículas pseudodigitadas de gripe infecciosa de alto titer com glicoproteínas envelope de vírus H5N1 e H7N9 altamente patogênicos

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Avaliação da neutralização sérica contra SARS-CoV-2 com vírus pseudotipados

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in addition to their better-known use in gene therapy for the delivery of a gene of interest. PVs are replication defective because the viral genome is divided into different plasmids that are not incorporated into the PVs. This safe and versatile system allows the use of PVs in biosafety level 2 laboratories. Here, we present a general methodology to produce lentiviral PVs based on three plasmids as mentioned here: (1) the backbone plasmid carrying the reporter gene needed to monitor the infection; (2) the packaging plasmid carrying the genes for all the structural proteins needed to generate the PVs; (3) the envelope surface glycoprotein expression plasmid that determines virus tropism and mediates viral entry into the host cell. In this work, SARS-CoV-2 Spike is the envelope glycoprotein used for the production of non-replicative SARS-CoV-2 pseudotyped lentiviruses.
Briefly, packaging cells (HEK293T) were co-transfected with the three different plasmids using standard methods. After 48 h, the supernatant containing the PVs was harvested, filtered, and stored at -80 &#176;C. The infectivity of SARS-CoV-2 PVs was tested by studying the expression of the reporter gene (luciferase) in a target cell line 48 h after infection. The higher the value for relative luminescence units (RLUs), the higher the infection/transduction rate. Furthermore, the infectious PVs were added to the serially diluted serum samples to study the neutralization process of pseudoviruses' entry into target cells, measured as the reduction in RLU intensity: lower values corresponding to high neutralizing activity.

Autor em destaque: Estudando as interações hospedeiro-vírus com vírus pseudotipados 

Pseudotyped viruses (PVs) are replication-defective virions that are used to study host-virus interactions under safer conditions than handling authentic viruses. Presented here is a detailed protocol that shows how SARS-CoV-2 PVs can be used to test the neutralizing ability of patients' serum after COVID-19 vaccination.

Vírus pseudotipados como uma ferramenta molecular para monitorar respostas imunes humorais contra SARS-CoV-2 via ensaio de neutralização

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...