Esta pesquisa foi financiada por não conceder. 0723341 (para KGL) da National Science Foundation. Também somos gratos pelas contribuições fornecidas pelo programa Fellowship Schapiro Graduação Pesquisa e do Departamento de Psicologia da Randolph-Macon College. Finalmente, agradecemos a colaboração de Craig Kinsley contribuições nesta pesquisa e ajuda Amanda Rzucidlo na preparação do laboratório R-MC para este artigo vídeo.

1. Identificação do Modelo Animal <ol><li> O rato de cervos Califórnia (Peromyscus californicus) é um modelo ideal para explorar respostas paternal. Como você vê, este rato noivos os filhotes assim como as mães fazem - eles até se agachar sobre eles de forma que parece que os filhotes são de enfermagem. O comportamento dos camundongos Califórnia é comparado a uma espécie do mesmo gênero, o mouse veado comum (Peromyscus maniculatus), que apresenta pouco interesse em crias, muitas vezes, tentando escapar ou mesmo atacá-los. (Veja a Figura 1 para fotos dessas espécies que interagem com filhotes). </li><li> Uma vez que o modelo de espécies tem sido identificado em seguida, os vários grupos precisam ser estabelecidos. Neste estudo, os pais biológicos, as virgens sem experiência parenting, e virgens com exposição limitada cachorro (filhote de cachorro-expostos ou pais adotivos) de ambas as espécies são usadas de modo que ambos predispostos e adquiriu características paternal pode ser avaliado. Neste estudo em particular também expostos todos os grupos para um rato de brinquedo cachorro para assegurar que as interações sociais eram específicas para um filhote de cachorro e não um representante de resposta a qualquer coisa colocada na gaiola (Figura 2). </li><li> Antes de investigar fatores neurobiológicos, é importante para confirmar que as espécies escolhidas apresentam diferenças claras no comportamento de interesse. Neste estudo, os machos são colocados em uma gaiola com um filhote de cachorro por cinco minutos e um etograma comportamento paterno (ver Tabela 1 para exemplo do etograma) é usado para comportamentos pontuação, tais como a latência para a abordagem do filhote e da quantidade de tempo gasto em contato com o filhote. Se as respostas agressivas são observados, o filhote é removido imediatamente. Estas sessões são muitas vezes filmadas para uma análise cuidadosa do comportamento pode ser posteriormente realizado. </li></ol> 2. Preparar Tecido Cerebral <ol><li> Após uma perfusão padrão de cada mouse (protocolo em anexo), os cérebros são removidos de modo que possam ser seccionado na área específica de interesse (cérebro show). </li><li> Um mouse padrão atlas do cérebro (show atlas) é usado para localizar o núcleo paraventricular do hipotálamo, uma área conhecida por ser rica em células que produzem o neuropeptídeo de interesse neste estudo - vasopressina (AVP). </li><li> O cérebro é bloqueada e montado sobre um mandril de congelamento para que o tecido vai congelar antes de ser seccionadas com o micrótomo. O cérebro é seccionado em um modo de cortar até marcos específicos são identificados, em seguida, a espessura específicas do cérebro, 30 microns, neste caso, está marcada para as seções do cérebro utilizada para a análise. </li><li> As seções do cérebro são cuidadosamente colocados em placas bem preenchido com tampão fosfato salina (PBS); (protocolo para PBS em anexo, por favor note que este é apenas um exemplo de um protocolo padrão imunocitoquímica). </li></ol> 3. Imunocitoquímica <ol><li> Ao longo das várias etapas desse processo (ver protocolo em anexo), é importante ter competências precisas de pipetagem para garantir medições precisas de produtos químicos e outros ingredientes importantes para esta técnica (pipetagem estudante show). </li><li> O primeiro passo neste processo é a lavagem do cérebro que envolve a substituição da PBS nos pratos bem três a cinco vezes, entre cada lavagem as placas assim são colocados em uma rocker por 10 minutos (show estudante substituindo PBS e colocando placas bem em rockers) . </li><li> As fatias de cérebro são, então, expostos à solução de anticorpo primário e armazenados a 4 ° C durante a noite sobre o rocker (processo seriado). </li><li> Após outra lavagem, as fatias de cérebro são expostos a um anticorpo secundário durante uma hora sobre o roqueiro à temperatura ambiente, lavadas novamente. </li><li> Em seguida, os cérebros são expostos a uma solução Avitin-Biotina Complexo de se preparar para a visualização das células neuroquímicas positivo. </li><li> Para a etapa de visualização final, o cérebro é exposto a DAB. Este é um produto perigoso e deve ser sempre manuseados com cuidado. Como pode ser visto aqui, as fatias de cérebro começam a ficar mais escuro diante de seus olhos (show de processo). </li><li> Após a exposição DAB, o cérebro passar a última série de lavagens e depois são cuidadosamente colocados sobre lâminas de microscopia subbed e deixa-se secar durante a noite (show a colocação de uma fatia do cérebro em um slide, ver anexo para o protocolo slides subbed). </li><li> Os slides são então apuradas através de uma série de lavagens de água destilada e álcool, de finalmente ser submerso em Citrosolv antes de ser lamínulas e armazenados em um slidebox para se manter seguro (mostrar vários aspectos deste processo, ver anexo para o processo de compensação). </li></ol> 4. Neuroquantification <ol><li> Após as lâminas secaram, eles podem ser avaliados com software neuroquantification especializados. Aqui BIOQUANT software é utilizada para quantificar as células vasopressina-positivos e fibras no núcleo paraventricular do cérebro do rato (show software na tela ... e microscópio). </li><li> A área específica de interesse é identificado usando as opções de mediçãodo software para estabelecer o campo visual para neuroquantification. É importante que um tamanho do campo visual consistente é quantificado para cada animal (estudante mostrar fazendo isso). </li><li> Aqui, a coloração escura corpos vasopressina-imunorreativa de células e fibras são aparentes. Porque é difícil de contar ou rastrear esse tecido, uma característica especial deste software usa thresholding luz para determinar a quantidade total de tecido marcadas positivamente dentro da área especificada de interesse. Este thresholding nos diz como grande parte da área especificada contida vasopressina positivo tecido (mostrar o valor dos dados na tela do computador). </li></ol> 5. Análise comportamental <ol><li> Se mais de um observador será marcar as fitas de vídeo, é importante estabelecer inter-rater confiabilidade para assegurar que os observadores estão marcando o comportamento de uma forma consistente. Para a sessão de pontuação actual, uma folha de pontuação comportamento deve ser preparado para permitir a fácil pontuação de comportamento durante as sessões de observação (ver Tabela 2, por exemplo de planilha de pontuação). </li><li> Para comportamentos que não são rápidas respostas episódica, uma análise microsequencing pode revelar sutilezas sobre a evolução das respostas específicas. Por exemplo, grooming comportamento consiste de uma cadeia de respostas muito rápidas. Apesar de uma opção é simplesmente registrar a presença e duração de grooming, outra é documentar a cadeia de eventos que acompanham essa resposta. Usando este software microsequencing, observadores marcar a presença de um comportamento particular a cada segundo, conforme solicitado pelo software (software show e vídeo). </li><li> Após coleta de dados, os parâmetros de interesse são determinados e os escores comportamentais apropriadas são analisados. Exemplos podem ser duração total de tempo gasto em contato com o filhote, ou o número de interrupções na seqüência da preparação (show computador com planilha com os dados inseridos para cada animal). </li><li> Uma vez que o comportamento é marcado, é importante para confirmar que as duas espécies apresentaram diferentes estratégias de resposta para o comportamento de interesse no estudo. Neste caso, a ratos de cervos Califórnia deve exibir um comportamento mais paternal do que os ratos de cervos comuns. Além disso, várias medidas comportamentais podem ser correlacionados com medidas cérebro para obter uma visão mais informada das influências relevantes. </li></ol> 6. Resultados representativos: <ol><li> Para validar o modelo, os dados devem indicar claramente que as duas espécies realizada de forma diferente com relação ao comportamento de interesse. Aqui você vê que o P. californicus machos passaram mais tempo grooming e agachado sobre os filhotes, duas marcas de respostas paterna (ver Figura 4). </li><li> A fim de determinar se a variável neurobiologial de interesse é importante nas respostas paternal, a quantidade de vasopressina (AVP)-positivo tecidos foi quantificada de várias áreas cerebrais relevantes, como pode ser visto, o P. paternal animais californicus tinha mais tecido imuno-positivos em várias destas áreas do cérebro. (Ver Figura 5). </li><li> Em um estudo relacionado com a análise microsequencing, se a hipótese de que os ratos paternal Califórnia apresentaria menos ansiedade do que suas contrapartes virgem e, consequentemente, quando expostos a um odor predador, os pais apresentaram menos interrupções na seqüência da preparação do que os animais virgem (ver Figura 6). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig1.jpg" /> Figura 1: (A) ratos Masculino Califórnia exibiam respostas paternal para com conspecific filhote alien. (B) do mouse veados Masculino exibindo uma abordagem cautelosa (estiramento participar) e resposta de esquiva na presença de um estrangeiro conspecific filhote. Nota: Nestas avaliações interação social, se um homem apresenta respostas agressivas em direção ao cachorro, os pesquisadores logo atingiu o topo da gaiola para distrair os homens. Neste momento a sessão é encerrada e que o filhote é removido, inspecionado para todas as feridas e voltou para a mãe. Em nosso laboratório, isso raramente é observado com P. machos californicus, mas ocasionalmente é observado com P. maniculatus; observação e intervenção imediata, no entanto, evitar que haja danos aos animais. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig2.jpg" /> Figura 2: Um rato Califórnia interagindo com um rato de brinquedo, a maioria tentou mastigar esses estímulos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig3.jpg" /> Figura 3: O delineamento experimental do estudo, havia cerca de seis animais de cada grupo para cada espécie. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig4.jpg" /> Figura 4: Gráfico do processo de imunocitoquímica. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig5.jpg" /> Figoure 5 respostas paterna na Califórnia e ratos de cervos;. respostas mais paternal (noivo, crouch, abordagem mais rápida) foram observados nos ratos Califórnia. Mais trecho atende (resposta ao estresse) foram observados nos ratos de cervos. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig6.jpg" /> Figura 6. Imunorreatividade vasopressina em áreas do cérebro diferentes das duas espécies. Os ratos Califórnia tinha mais coloração nas células PVN e fibras. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig7.jpg" /> Figura 7: ratos Paternal Califórnia exibiram menos interrupções em suas seqüências de preparação na presença de um predador que o odor das crias grupos expostos e virgem.

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	<li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol.">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li><li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa.">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing.">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li><li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa:+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks,+mutagenesis+screens,+and+mouse+backcrosses.">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm.">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li><li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL/6+mice.">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li><li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization.">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li><li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates.">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li><li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing.">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li><li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity.">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li><li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserving,+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation.">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este artigo discute três componentes essenciais pensado para ser crítico para a execução bem sucedida de investigações neurociência comportamental: (1) um modelo animal representativo e válido; (2) um protocolo de imunocitoquímica precisas e sensíveis, e (3) a análise a mais (de observação e estatística ) de ambos os dados comportamentais e cérebro. Erros em uma única categoria certamente vai comprometer os resultados de todo o estudo. Assim, após seleção cuidadosa do modelo animal apropriado, um considerável esforço deve ser dirigido para piloto de testes a procedimentos comportamentais e histológicas para assegurar que o comportamento será confiável observadas no estudo, seguido pelo tratamento bem sucedido do cérebro. Como mencionado anteriormente, o uso de espécies comparativa para identificar mecanismos neurobiológicos de uma resposta particular é uma abordagem metodológica valiosa porque esta técnica não requer a engenharia genética ou dolorosa manipulações cirúrgicas. Assim, esta abordagem metodológica utiliza menos ameaçados, animais intactos. O uso de variações naturais de animais, no entanto, é reforçada pela incorporação de ambientes naturais-como ainda se os animais estão alojados em laboratório. Além disso, se estudos de laboratório pode ser estendido para o campo para continuar a validar a autenticidade das diferenças no comportamento de espécies de interesse, o próximo passo é recomendado. Embora a abordagem comparativa oferece muitas vantagens, uma limitação é a natureza correlativa dos dados e, conseqüentemente, técnicas adicionais, tais como as manipulações farmacológicas devem ser usados ​​para validar ainda mais o papel de alvo sistemas neurobiológicos no comportamento de interesse. Uma vez que os experimentadores se sentir confiante sobre os procedimentos comportamentais, histológicos e estatística, os cuidados devem ser tomados para que as condições de vida dos animais permanecem constantes para todos os grupos, exceto, é claro, para a manipulação experimental. Mudanças em variáveis ​​tais como horários de luz, níveis de ruído, cuidadores, níveis de umidade e odores em laboratório poderia ter efeitos significativos sobre as respostas dos animais neurobiológicos. Neste artigo o anticorpo primário foi utilizado para a detecção de vasopressina, mas outros anticorpos primários podem ser usados ​​para uma infinidade de substâncias neuroquímicas de interesse diferentes. Se o pesquisador está trabalhando com um novo anticorpo, é importante a realização de estudos de titulação para determinar a diluição ideal do anticorpo novo. Muitas vezes anticorpo é muito usado (como sugerido pelo fabricante), resultando em tecido que é escuro demais para diferenciar o sinal; ainda mais, o uso excessivo do anticorpo é muito caro. Finalmente, se mais de uma única análise estatística pode ser usada para fornecer visões alternativas e interpretações dos dados, eles devem ser utilizados. Neste estudo particular, modelos lineares, correlacional, e análises de escalonamento multidimensional foram usados ​​para fornecer os pontos de vista mais informativo dos dados.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Microscópio composto binocular </td><td> Motic </td><td> BA400 </td><td></td></tr><tr><td> Software Ciência BIOQUANT Vida </td><td> Analysis Corporation BIOQUANT Imagem </td><td> Versão 8.40.20 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Microm </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflex Console Easy Drive-Load L / S (bomba de perfusão) </td><td> Cole-Parmer Instrument Company </td><td> 7518-00 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Cluster Cultura Bem Cell (cultura de tecidos tratados; apirogénico poliestireno; estéril) </td><td> Corning Costar </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> 25x75x1mm Lâminas de microscopia </td><td> Globe Scientific, Inc. </td><td> 1324W </td><td></td></tr><tr><td> Lamínula 22x50mm No.1 </td><td> Globe Scientific, Inc. </td><td> 1414-1410 </td><td></td></tr><tr><td> Não estéreis 3mL Pipetas graduadas Transferência Grande Bulb </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 70962-9 </td><td> &amp;nbps; </td></tr><tr><td> Alconox detergente em pó </td><td> Alconox </td><td> 1104 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9888-1kg </td><td> CAS 7647-14-5 </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio monobásico </td><td> Espectro </td><td> SO130 </td><td> CAS 10049-21-5 </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio dibásico di-hidratado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 30412 </td><td> CAS 10028-24-7 </td></tr><tr><td> Triton X </td><td> Espectro </td><td> TR135 </td><td> CAS 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Permount </td><td> Pescador </td><td> SP15-500 </td><td> CAS 108-88-3 </td></tr><tr><td> Cromo sulfato de potássio </td><td> Sigma </td><td> C-5926 </td><td> CAS 7788-99-0 </td></tr><tr><td> CitriSolv </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-143975 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol, alta Garrafas Den.Poly, 200 provas, 24 x 1 litro </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200CSPP </td><td></td></tr><tr><td> Soro normal de cabra </td><td> Vetor </td><td> S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Coelho anti reagente específico analito vasopressina </td><td> Immunostar, Inc. </td><td> 20069 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinilado anti-IgG de coelho (H + L) purificadas por afinidade, </td><td> Vetor </td><td> BA-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Elite Padrão Vectastain ABC Kit </td><td> Vetor </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> Kit DAB substrato da peroxidase </td><td> Vetor </td><td> SK-4100 </td><td></td></tr><tr><td> Original gelatina sem sabor (4 contagem de envelopes) 1-oz caixa </td><td> Knox </td><td></td><td> Compra na mercearia local </td></tr><tr><td> Peróxido de hidrogênio 3% </td><td> CareOne </td><td></td><td> Compra na farmácia local </td></tr><tr><td> Alvejante </td><td> Clorox </td><td></td><td> Compra na mercearia local </td></tr></tbody></table>

using a comparative species approach to investigate the neurobiology of paternal responses

A meta de neurociência comportamental é identificar fatores neurobiológicos subjacentes que regulam comportamentos específicos. Utilizando modelos animais para alcançar esse objetivo, muitas estratégias metodológicas requerem técnicas invasivas para manipular a intensidade do comportamento de interesse (por exemplo, os métodos de lesão, manipulações farmacológicas, técnicas de microdiálise, modelos de engenharia genética animal). A utilização de uma abordagem comparativa de espécies permite aos pesquisadores para aproveitar diferenças que ocorrem naturalmente em estratégias de resposta existentes em espécies estreitamente relacionadas. Em nosso laboratório, usamos duas espécies do gênero Peromyscus que diferem nas respostas paternal. O rato veado macho Califórnia (Peromyscus californicus) apresenta as mesmas respostas dos pais quanto a fêmea enquanto seu primo, o mouse veado comum (Peromyscus maniculatus) exibe praticamente nenhuma resposta nurturing / parental, na presença de filhotes. De interesse específico neste artigo é uma exploração dos fatores neurobiológicos associados com as respostas sociais afiliativo exibido pelo mouse paternal veados Califórnia. Porque a abordagem da neurociência comportamental é multifacetada, os seguintes componentes-chave do estudo serão brevemente abordadas: a identificação de espécies adequadas para este tipo de pesquisa; recolha de dados para análise comportamental; preparação e corte do cérebro; passos básicos envolvidos na imunocitoquímica para a quantificação da imunorreatividade vasopressina; o uso de neuroimagem software para quantificar o tecido cerebral, o uso de uma análise de vídeo para marcar microsequencing comportamento e, finalmente, a análise estatística apropriada para fornecer as interpretações mais informado dos resultados da investigação.

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Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

A abordagem comparativa permite que os neurocientistas espécies de comportamento para explorar vários fatores neurobiológicos associados com comportamentos específicos vistos como característica de um modelo animal específico. Aproveitando naturalmente diferenças de comportamento entre espécies estreitamente relacionadas, esta técnica não requer técnicas invasivas para manipular a expressão do comportamento.

Usando uma abordagem comparativa de espécies para investigar o Neurobiology of Responses Paternal

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

using-comparative-species-approach-to-investigate-neurobiology

Research

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Neuroscience

12.5K visualizações.  Randolph-Macon College. A abordagem comparativa permite que os neurocientistas espécies de comportamento para explorar vários fatores neurobiológicos associados com comportamentos específicos vistos como característica de um modelo animal específico. Aproveitando naturalmente diferenças de comportamento entre espécies estreitamente relacionadas, esta técnica não requer técnicas invasivas para manipular a expressão do comportamento.

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Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Multieletrodo Recordings Matriz do Epitélio Vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Neurociência

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems. One important issue concerns the relative roles of each sensory modality in guiding behavior. The role of visual inputs has been examined by isolating visual stimuli from mechanical and chemosensory stimuli. In some studies (Bruski &amp; Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) visual inputs have been removed with blindfolds or low light intensity, and effects of remaining sensory modalities have been elucidated. An alternative approach is to study the effects of visual inputs in the absence of any appropriate mechanical and chemosensory cues. This approach aims to identify the exclusive role of visual inputs. 
We have used two methods to provide visual stimuli to crayfish without providing chemical and mechanical cues. In one method, crayfish are videotaped in an aquarium where half of the walls are covered in mirrors to provide a reflective environment, and the other half are covered in a non-reflective (matte finish) plastic. This gives the crayfish a choice between reflective and non-reflective environments. The reflective environment provides visual cues in the form of reflected images of the crayfish as it moves throughout half of the tank; these visual cues are missing from the non-reflective half of the tank. An alternative method is to videotape the behavior of crayfish in an aquarium separated by a smaller chamber at each end, with a crayfish in one small chamber providing visual cues and an inert object in the opposite small chamber providing visual input from a non-moving, non-crayfish source. 
Our published results indicate that responses of crayfish to the reflective environment depend on socialization and dominance rank. Socialized crayfish spent more time in the reflective environment and exhibited certain behaviors more frequently there than in the non-reflective environment; isolated crayfish showed no such differences. Crayfish that were housed in same-sex pairs developed a social rank of either dominant or subordinate. Responses to reflection differed between dominant and subordinate crayfish (May &amp; Mercier, 2006; May &amp; Mercier, 2007). Dominant crayfish spent more time on the reflective side, entered reflective corners more frequently and spent more time in reflective corners compared to the non-reflective side. Subordinate crayfish walked in reverse more often on the reflective side than on the non-reflective side. Preliminary data suggest similar effects from visual cues provided by a crayfish in a small adjoining chamber (May et al., 2008).

We have developed two methods for studying effects of visual cues on behavior in the absence of tactile and chemical cues. One method involves videotaping responses of crayfish to reflective walls in an aquarium; the other examines effects of visual inputs provided by a live crayfish behind a transparent partition.

Gravação de respostas comportamentais à Reflexão em Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imagem crônica de rato Visual Cortex usando uma preparação diluída crânio-

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Measuring the Subjective Value of Risky and Ambiguous Options using Experimental Economics and Functional MRI Methods

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition termed "risky". In other cases when probabilities cannot be estimated, this is a condition described as "ambiguous". While most people are averse to both risk and ambiguity1,2, the degree of those aversions vary substantially across individuals, such that the subjective value of the same risky or ambiguous option can be very different for different individuals. We combine functional MRI (fMRI) with an experimental economics-based method3 to assess the neural representation of the subjective values of risky and ambiguous options4. This technique can be now used to study these neural representations in different populations, such as different age groups and different patient populations.
In our experiment, subjects make consequential choices between two alternatives while their neural activation is tracked using fMRI. On each trial subjects choose between lotteries that vary in their monetary amount and in either the probability of winning that amount or the ambiguity level associated with winning. Our parametric design allows us to use each individual's choice behavior to estimate their attitudes towards risk and ambiguity, and thus to estimate the subjective values that each option held for them. Another important feature of the design is that the outcome of the chosen lottery is not revealed during the experiment, so that no learning can take place, and thus the ambiguous options remain ambiguous and risk attitudes are stable. Instead, at the end of the scanning session one or few trials are randomly selected and played for real money. Since subjects do not know beforehand which trials will be selected, they must treat each and every trial as if it and it alone was the one trial on which they will be paid. This design ensures that we can estimate the true subjective value of each option to each subject. We then look for areas in the brain whose activation is correlated with the subjective value of risky options and for areas whose activation is correlated with the subjective value of ambiguous options.

Using functional MRI and behavioral methods to determine the neural representation of the subjective value of risky and ambiguous options in the human brain.

Medir o valor subjetivo de Opções de risco e ambígua usando Economia Experimental e funcional métodos de ressonância magnética

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the "Loser" Effect in Drosophila melanogaster

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This complex behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. As in many organisms, previous fighting experience influences the fighting strategy of flies and the outcome of later contests: losing a fight increases the probability of losing later contests, revealing &#34;loser&#34; effects that likely involve learning and memory 2-4. The learning and memory that accompanies expression of complex social behaviors like aggression, is sensitive to pre-test handling of animals 5,6. Many experimental procedures are used in different laboratories to study aggression 7-9, however, no routinely used protocol that excludes handling of flies is currently available. Here, we report a new behavioral apparatus that eliminates handling of flies, using instead their innate negative geotactic responses to move animals into or out of fighting chambers. In this protocol, small circular fight arenas containing a food cup are divided into two equal halves by a removable plastic slider prior to introduction of flies. Flies enter chambers from their home isolation vials via sliding chamber doors and geotaxis. Upon removal of plastic sliders, flies are free to interact. After specified time periods, flies are separated again by sliders for subsequent experimentation. All of this is done easily without handling of individual flies. This apparatus offers a novel approach to study aggression and the associated learning and memory, including the formation of &#34;loser&#34; effects in fly fights. In addition, this new general-purpose behavioral apparatus can be employed to study other social behaviors of flies and should, in general, be of interest for investigating experience-related changes in fundamental behavioral processes.

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the &quot;Loser&quot; Effect in Drosophila melanogaster

During fruit fly fights, the behavioral patterns observed, fight dynamics, and associated learning and memory are influenced by experimental conditions. The protocol presented here describes a novel procedure that entirely eliminates handling of flies during experiments. This improves fight dynamics and allows formation of strong &#34;loser&#34; effects.

Uma nova abordagem que elimina a manipulação de Estudos de Agressão e Efeito &quot;perdedor&quot; em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Controlo óptico de uma proteína neuronal utilizando um ácido Unnatural Amino geneticamente codificados em neurónios

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.

Stripe Ensaio para estudar a atividade atração ou repulsão de um substrato de proteína utilizando dissociado neurônios do hipocampo

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from flowering plants. Only a few studies have described the gustatory responses of bees toward toxins in food, and these experiments have mainly used the proboscis extension response on restrained honey bees. Here, a new behavioral assay is presented for measuring the feeding responses of freely-moving, individual worker bumble bees to nutrients and toxins. This assay measures the amount of solution ingested by each bumble bee and identifies how tastants in food influence the microstructure of the feeding behavior.
The solutions are presented in a microcapillary tube to individual bumble bees that have been previously starved for 2-4 hr. The behavior is captured on digital video. The fine structure of the feeding behavior is analyzed by continuously scoring the position of the proboscis (mouthparts) from video recordings using event logging software. The position of the proboscis is defined by three different behavioral categories: (1) proboscis is extended and in contact with the solution, (2) proboscis is extended but not in contact with the solution and (3) proboscis is stowed under the head. Furthermore the speed of the proboscis retracting away from the solution is also estimated.
In the present assay the volume of solution consumed, the number of feeding bouts, the duration of the feeding bouts and the speed of the proboscis retraction after the first contact is used to evaluate the phagostimulatory or the deterrent activity of the compounds tested.
This new taste assay will allow researchers to measure how compounds found in nectar influence the feeding behavior of bees and will also be useful to pollination biologists, toxicologists and neuroethologists studying the bumble bee&#39;s taste system.

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

A Novel Behavioral Ensaio investigar as gustativas de um indivíduo, livre-se deslocam Bumble abelhas (<em&gt; Terrestris do Bombus</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...