Este trabalho foi financiado pela concessão Leverhulme Trust (RPG-2012-708) e uma subvenção BBSRC (BB / M00709X / 1) para GAW.

1. A captura das abelhas da colônia e do período de jejum Nota: Os experimentos aqui descritos foram realizados na Universidade de Newcastle, no Reino Unido com Bombus terrestris audax. Múltiplos (2-3) adquirida comercialmente colônias foram usadas por tratamento. As colônias foram mantidas em um banco em condições de laboratório (25 ± 2 ° C e 28 ± 2% RH) na escuridão constante e foram alimentados com mel de abelha recolhido pólen e soluções de açúcar ad libitum. <ol><li> Recolha trabalhador individual abelhas utilizando um frasco de plástico (7 cm de comprimento, 2,8 cm de diâmetro interno) com uma rolha de plástico perfurado, depois de ter aberto o portão para a colônia apenas o tempo suficiente para uma abelha para sair e ser preso. </li><li> Antes do experimento, fome individualmente todas as abelhas para 2-4 hr nos frascos de plástico e manter a temperatura ambiente na escuridão completa. </li></ol> 2. Transferência de abelhas dentro dos tubos de exploração ea HFase abituation <ol><li> Após o período de fome, transferir uma abelha diretamente do frasco de plástico em um tubo de retenção. O tubo de retenção é de 15 ml tubo de centrífuga modificado (comprimento: 119 milímetros; diâmetro de 17 milímetros), com um orifício de 4 milímetros perfurados na ponta e uma parte de malha de aço (base: 8 mm; altura 30 mm) fixada no interior por fusão o plástico do tubo com uma agulha de dissecação de aço aquecido. </li><li> Fixar o tubo de retenção contendo a abelha em um suporte de poliestireno com cera dental. Fixar duas peças de cartão em ambos os lados do tubo de retenção. Isto é para proteger a abelha a partir de estímulos visuais que possam interferir com a experiência. </li><li> Posicionar uma câmera microscópica digital de 5 cm acima da ponta do tubo de retenção e conectar a câmera a um computador portátil compatível. </li><li> Ajustar o tubo de espera de modo a que pelo menos os primeiros 18 mm de comprimento da ponta de tubo de retenção está dentro do quadro de vídeo. Antes do experimento, iniciar o período de habituação de 3 min. </li></ol> 3.Fase pré-teste: Apresentando uma gota de Sacarose <ol><li> Ligar uma seringa a um adaptador fêmea, contendo uma gota de solução de sacarose (~ 3,5 mL, sacarose 500 mM dissolvido em água desionizada). Apresentar a sacarose no interior da ponta tubo de retenção para motivar a extensão das tromba. </li><li> Dê a abelha até 5 min para consumir a gota de sacarose. Se a gota não é consumido, remover o abelha do experimento. </li><li> Iniciar a gravação de vídeo após o período de habituação. Neste estudo, a atividade tromba foi gravado em 26,7 frames / seg -1 com uma taxa de ampliação 25X. </li></ol> 4. Fase de Testes: Apresentar a solução de ensaio <ol><li> Encher um tubo microcapilar de 100 ul com a solução de teste. Conectá-lo a um pedaço de tubo de silicone (comprimento 6 cm, 1 mm de diâmetro interno) e corrigi-lo a um micro manipulador. <ol><li> Conecte o tubo através de um adaptador macho para outro tubo de silicone (6 cm de comprimento, 4 mm de diâmetro interno), whiCH actua como um bolbo de pipeta. </li><li> Posicione o microcapilar tubo de 5-10 mm de distância da ponta do tubo de retenção. Suavemente espremer o tubo para manter a solução de alimentação na ponta do tubo microcapilar. </li></ol></li><li> Depois da abelha consome a gota de sacarose, retire imediatamente a seringa contendo a solução de sacarose 500 mM. </li><li> Comece a fase de teste 2 min, quando do bumble contatos tromba a solução dentro do tubo microcapilar. <ol><li> Para controlar possíveis evaporação, encher dois tubos microcapilares adicionais com sacarose ou água e manipulá-lo exatamente como durante a fase de teste. </li></ol></li><li> Antes e após cada ensaio digitalizar os níveis de líquido no interior do tubo microcapilar usando um scanner a 600 dpi para medir a quantidade de alimentos consumidos (Figura 4A). </li></ol> 5. Análise de Imagem <ol><li> Determinar o volume de consumo de solução usando ImageJ (versão 1.48), um proc imagemessing software. <ol><li> Faça o upload do arquivo de imagem e zoom na imagem (~ 400%). Para definir a escala de referência, selecione a ferramenta linha reta e desenhar uma linha entre as duas extremidades do tubo microcapilar. Selecione &quot;Analisar&quot;, em seguida, &quot;Scale Definir &#39;. Introduza o comprimento total do tubo em &quot;distância conhecida &#39;ea unidade correspondente em&quot; Unidade de comprimento &quot;. </li><li> Selecione a ferramenta linha reta novamente e traçar uma linha entre as duas extremidades do nível do líquido. Selecione &quot;Analisar&quot;, em seguida, &#39;Medida&#39;. Na janela de resultados do comprimento do líquido é dado na coluna «comprimento». </li></ol></li><li> Calcular o volume de consumo de solução por meio da seguinte fórmula: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq1.jpg" /> Onde <img alt="equação 2" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq2.jpg" /> é o comprimento do tubo microcapilar e <img alt="equação 3" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq3.jpg" /> e <img alt= &quot;Equação 4&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54233 / 54233eq4.jpg&quot; /&gt; são os comprimentos medidos do líquido no interior do tubo microcapilar antes e após a fase de teste, respectivamente. </li></ol> 6. As análises de vídeo <ol><li> Marcar os comportamentos alimentares durante a fase de testes de 2 min de cada vídeo usando um software de registro de eventos (Ver Tabela de Materiais). <ol><li> No início, definir os comportamentos alimentares (ie. Os elementos) no menu aulas de comportamento do software de gravação. Os comportamentos de alimentação são como se segue: (1) proboscis out / contato: a tromba se estende e está em contacto com a solução dentro do tubo microcapilar (2) proboscis out / nenhum contato: a tromba se estende e não está em contacto com a solução dentro do tubo microcapilar, (3) tromba estivada: a tromba não for prorrogado, mas em vez arrumadas sob a cabeça e (4) fora de vista: a abelha está fora do quadro de vídeo. </li><li> Definir cada comportamentocomo um &#39;estado&#39; e &#39;mutuamente exclusivas &quot;no menu de propriedades e fazer gravações contínuas para um intervalo de 2 min. Reproduzir os vídeos no modo slow-motion (2 vezes mais lento) para obter mais precisão. </li></ol></li><li> Medir a velocidade de retracção tromba a partir da solução de ensaio após o primeiro contacto entre duas molduras consecutivas (separadas por 37,5 mseg nas gravações de vídeo mostrados aqui) utilizando um software de seguimento de movimento de vídeo (ver Materiais Tabela). <ol><li> Faça o upload do arquivo de vídeo e pular para o quadro onde a tromba primeiros contatos a solução. </li><li> Para definir a escala de referência, selecione a ferramenta de linha e desenhar uma linha na largura do tubo microcapilar no quadro do vídeo. Botão direito do mouse na linha e selecione &quot;Calibrar medida &#39;. A largura de entrada do tubo capilar e a unidade correspondente. </li><li> Selecione &#39;Imagem&#39; depois &#39;Coordenar origem do sistema&#39;. Na nova janela, clique na ponta da tromba e selecione9; Aplicar &#39;. </li><li> Selecione a ferramenta mover a mão, clique direito sobre a ponta da tromba no quadro de vídeo e selecione &#39;Path Track&#39;. Mover para o próximo quadro e reajustar o ponto de rastreamento para a ponta da tromba. </li></ol></li><li> Botão direito do mouse sobre o ponto de rastreamento e selecione &quot;Configuração&quot;. Selecione &#39;Caminho completo&#39; e selecione &#39;Speed&#39; sob medida. Selecione &quot;Aplicar&quot;. A velocidade é então exibido. </li></ol>

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Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Com este romance ensaio comportamental, quinino é mostrado para impedir a alimentação da abelha rabo-de-buff. O tempo de contato tromba reduzida e frequência de ataque de alimentação com água ou a solução de sacarose atado com quinino é interpretada aqui como uma recusa de iniciar ainda alimentando-se de soluções não nutritivos ou potencialmente tóxicos. Quando quinina é adicionado à solução de 1 M de sacarose, as abelhas não só reduzir o volume de solução que consomem, eles também retrair a tromba mais rápido, reduzindo assim o tempo de contacto entre as mandíbulas e a solução contendo uma toxina. Juntos, estes resultados sugerem que o quinino é percebida pelas células receptoras gustativas nas peças bucais da abelha, como já anteriormente identificados no mel de abelha 9. A quinina é uma toxina para insetos que induz comportamento mal-estar, como no mel de abelha 10 e knockdown no mosquito da malária (Anopheles gambiae) 23. Este ensaio pode muito bem levar ao identification de alguns compostos de dissuasão e potencialmente tóxicos que são percebidos pelas células receptoras gustativas nas peças bucais nas abelhas. É crucial para o tubo microcapilar para ser preenchida com um volume suficiente de solução de ensaio para durar durante toda a fase de teste. Recomenda-se que, pelo menos, cerca de três quartos do tubo microcapilar (por exemplo, 70-80 ul) é preenchido. No entanto, deve ser tomado cuidado para não encher completamente o tubo microcapilar para reduzir o risco de derrames durante o processo de digitalização e prender o tubo microcapilar para o aparelho experimental. Cuidados também devem ser tomados ao apresentar a gota de sacarose 500 mM à abelha, de modo que o experimentador evita vazamento a gota dentro do tubo de exploração. O buraco 4 mm na ponta do tubo de retenção é grande o suficiente para um adulto trabalhador bumble abelha para estender naturalmente sua tromba na direção da solução de teste. No entanto, é possível quebumble abelhas pode saborear a solução com suas antenas antes de estender as suas trombas. Isso pode afetar a probabilidade de extensão probóscide como PER poderia ser atingida em abelhas, estimulando suas antenas com uma solução de açúcar 15. Na verdade, a antenas de Hymenoptera como a vespa parasita (Trissolcus brochymenae) 24 ou a abelha 13 estão equipados com sensilla gosto, o que lhes permite saborear açúcares e toxinas como o quinino. Consequentemente, contatos antenais iniciais com soluções contendo compostos altamente dissuasão, como o quinino também poderia reduzir a motivação de uma abelha para estender sua tromba e, portanto, afetar a taxa de sucesso experimental. Embora o contato antenal com a solução de teste não pode ser controlada, no presente estudo, não encontramos qualquer efeito significativo de contato antenal na extensão probóscide para a solução de teste. Neste ensaio, imediatamente a configuração do tubo microcapilar após a fase de pré-teste when antenas das abelhas bumble ainda estão dentro do tubo de retenção pode reduzir a oportunidade para as abelhas para saborear a solução de teste com suas antenas. A principal limitação deste ensaio surge quando acompanhando a retração tromba longe da solução de teste após o primeiro contato tromba usando o software de rastreamento de movimento de vídeo. O vídeo mostra apenas o movimento 2D dos probóscide, então a saída dada da medição da velocidade pode ser sob ou sobre estimado. No entanto, com algumas modificações, este aspecto do ensaio pode ser melhorada. Este ensaio pode ser usado para observar as respostas de alimentação natural para soluções contendo diferentes compostos, incluindo metabólitos secundários de plantas naturais que ocorrem. Observando as respostas de alimentação imediatos com este ensaio dá informações detalhadas sobre como as abelhas detectar estes compostos. Isto é vantajoso em relação existente &#39;go-no ir &quot;métodos como PER 18,19 </sup&gt; E mais ensaios de duas escolha 7 porque este método produz várias medidas de resposta comportamental, incluindo o consumo de alimentos durante um ataque de alimentação discreta. Medição de vários parâmetros simultaneamente permite uma melhor avaliação da palatabilidade de um composto. Por exemplo, em nosso ensaio, as abelhas evitar consumir água ou a solução de sacarose atado com quinino. Retracção da tromba poderia ser causada por uma alteração nas respostas das células receptoras açúcar 12,13. Nosso ensaio mostra que as abelhas retrair a tromba mais rápida depois de entrar em contato com a solução de sacarose mais quinino do que a água só; isso poderia sugerir que o quinino afeta um conjunto distinto de neurônios, além de inibir neurônios de detecção de açúcar 9,12,13,25. O nosso ensaio permite a análise do padrão temporal de respostas comportamentais durante a alimentação. Um protocolo semelhante onde o consumo de tempo e o número de acessos é medida tem aipronto foram implementadas para avaliar a resposta de alimentação de Drosophila aos açúcares nutritivos e não nutritivos 26. Prevemos que as abelhas irá apresentar uma resposta mais fiável para alimentar estimulantes no nosso ensaio do que em outros métodos, tais como por porque as abelhas são livres para se moverem no tubo de retenção 21. Esta técnica irá permitir uma análise exaustiva dos limiares de sabor para os nutrientes e toxinas para iluminar os mecanismos de alimentação em abelhas e potencialmente outras espécies de abelhas.

interações planta-polinizador são complexas. Polinizadores visitam flores para a obtenção de néctar e pólen como alimento; por sua vez, polinizadores facilitar a reprodução sexual em plantas. Enquanto esta relação é principalmente mutualista, o néctar floral e pólen, por vezes contêm toxinas ou outra planta compostos 1-5 o que pode prejudicar polinizadores. A lógica ecológica para a presença desses compostos no néctar e pólen não é claro em todas as configurações. Uma questão pendente neste campo é como polinizadores, como as abelhas podem detectar e evitar as flores com néctar contendo toxinas. As espécies de abelhas bumble, Bombus terrestris (Linnaeus, 1758), é um polinizador generalista que visita as flores de muitas espécies de plantas, incluindo os néctar produzir toxinas contendo 6. As abelhas foram mostrados para evitar soluções consumindo contendo altas concentrações de toxinas num ensaio de 24 h duas-7 escolha. este ensaiodo consumo de alimentos descrito por Tiedeken et al. 7 revelou que as abelhas podem detectar compostos amargos em soluções. No entanto, este ensaio foi incapaz de distinguir o gosto dos processos pós-ingestivo, tais como mal-estar que podem afetar o comportamento alimentar durante este intervalo de tempo 8-10. As abelhas possuem sensilla gustativa em suas antenas, peças bucais e tarsos para detectar compostos 11-13. O reflexo de extensão probóscide (PER) experimentos envolvem restringindo abelhas individuais em um chicote de fios e, em seguida, estimulando sensilas antenais da abelha para produzir a alimentação reflexo 14-17. As abelhas pode ser contido em arneses individuais e, em seguida, estimulada para produzir o reflexo de alimentação como um ensaio da sua capacidade de provar compostos 18,19. Outros têm modificada do ensaio PER para estudar a sensibilidade do aparelho bucal ou antenas de toxinas 9,20. No entanto, as abelhas são submetidos ao estresse durante aproveitamento. Isso pode afetar a forma comoeles respondem a compostos 21. Aqui, um novo ensaio é descrito para avaliar a resposta ao gosto comportamental de livremente mover as abelhas para sacarose e quinino, um alcalóide que foi previamente relatado para ser dissuasivo 9 e tóxica 10 para as abelhas (Apis mellifera) e abelhas (Bombus terrestris) 7, 22. Embora quinina não foi encontrado no néctar planta, este alcalóide é frequentemente utilizado como um estímulo aversivo em estudos comportamentais e fisiológicas em abelhas 7,9,12,13,22. O método envolve a gravação de peças bucais das abelhas bumble vídeo em ótima resolução durante o contato tromba inicial com as soluções de ensaio. Especificamente, a estrutura fina da resposta de alimentação é examinado por conseguir continuamente o comportamento ao longo de um intervalo de 2 min. O volume de solução consumida é medida durante o período de alimentação e assim a quantidade de comida ingerida pode ser correlacionada com a microestrutura deo comportamento de alimentação. Também a velocidade de retracção da tromba é medida, como um indicador de uma evitação activa, e, por conseguinte, a detecção pré-ingestivos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1383">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Bumblebee colonies</td>
			<td style="width:211px;">Koppert Biological Systems</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:411px;">NATUPOL Beehive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Digital microscopic camera&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Dino-lite Europe</td>
			<td style="width:255px;">AM4815ZT</td>
			<td>Dino-Lite Edge&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">100 &#956;l microcapillary tube&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Blaubrand IntraEND</td>
			<td style="width:255px;">709144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">15 ml polypropylene centifuge tube&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">11849650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">1 ml disposable plastic luer slip syringe</td>
			<td style="width:211px;">BD</td>
			<td style="width:255px;">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Dell Latitude 3550 laptop</td>
			<td style="width:211px;">Dell</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td>Check for compatibility with video software&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Canon CanoScan LiDE 120</td>
			<td style="width:211px;">Canon</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td>Check for compatibility with the computer/laptop</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Observer software version 5.0.25</td>
			<td style="width:211px;">Noldus</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Kinovea software version 0.8.15</td>
			<td style="width:211px;">Kinovea&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">silicone tubing</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td>6&#160;cm length, 1&#160;mm inside &#216; &#38; 6&#160;cm length, 4&#160;mm inside &#216;</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:507px;">Male luer x 1/16&#34; standard hose barbed polypropylene adapter</td>
			<td style="width:211px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:255px;">TW-45518-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:507px;">Female luer x 1/16&#34; standard hose barbed polypropylene adapter</td>
			<td style="width:211px;">Cole-Palmer</td>
			<td style="width:255px;">TW-45508-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Steel mesh&#160;</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td>0.5 mm mesh size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Sucrose (grade II)&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Quinine hydrochloride dihydrate</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Q1125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">ImageJ software version 1.48</td>
			<td style="width:211px;">ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel behavioral assay to investigate gustatory responses of individual, freely-moving bumble bees (bombus terrestris)

Polinizadores generalistas como a abelha-atado lustre, Bombus terrestris, encontrar ambos os nutrientes e toxinas no néctar floral que coletamos de plantas com flores. Apenas alguns estudos têm descrito as respostas gustativos de abelhas em direção toxinas nos alimentos, e estes experimentos utilizaram principalmente a resposta de extensão probóscide em abelhas produtoras de mel contido. Aqui, um novo ensaio comportamental é apresentado para medir as respostas de alimentação de liberdade de movimento, cada trabalhador abelhas para nutrientes e toxinas. Este ensaio mede a quantidade de solução ingerida por cada abelha e identifica como saborizantes nos alimentos influenciar a microestrutura do comportamento alimentar. As soluções são apresentadas em um tubo microcapilar para as abelhas individuais que tenham sido previamente carente de 2-4 hr. O comportamento é capturado em vídeo digital. A estrutura fina do comportamento alimentar é analisado continuamente por atingir a posição do Proboscis (bucais) de gravações de vídeo usando o software de log de eventos. A posição da tromba é definido por três diferentes categorias comportamentais: (1) tromba é estendido e em contacto com a solução, (2) tromba é estendido, mas não em contacto com a solução e (3) tromba é guardado debaixo da cabeça. Além disso, a velocidade de retracção da tromba de distância a partir da solução também é estimado. No presente ensaio o volume da solução consumida, o número de ataques de alimentação, a duração dos episódios de alimentação e a velocidade de retracção da tromba após o primeiro contacto é utilizado para avaliar a actividade phagostimulatory ou o impedimento dos compostos testados. Este ensaio gosto nova permitirá que pesquisadores para medir como compostos encontrados no néctar influenciar o comportamento alimentar de abelhas e também será útil para os biólogos polinização, toxicologistas e neuroethologists estudando sistema gosto do bumble.

O ensaio de novo é usado para testar as respostas de alimentação a 1 M de sacarose, 1 M de solução de sacarose mais quinina 1 mM e água desionizada sozinho. As respostas de alimentação imediatos para cada tratamento são determinados pela quantificação da duração dos contactos tromba com a solução de ensaio, a frequência dos ataques de alimentação e a velocidade da tromba de retracção de distância a partir da solução de ensaio após o primeiro contacto, durante a fase de teste de 2 minutos. O volume de solução consumida é também medido depois da fase de teste. Neste estudo, nós escolhemos um intervalo critério de ataque de 5 segundos (Figura 1, consulte Arquivo Suplementar) com base em trabalhos anteriores por French et al. 25, que usou um limiar de 5 segundos para caracterizar o comportamento tromba retração de Drosophila em resposta a dissuasivo compostos 25. Assim, definimos um ataque de alimentação como um contato entre a tromba estendida e a solução nãot interrompido por uma ausência de contactos de 5 segundos ou mais. Em comparação com sacarose e água desionizada sozinha, a adição de solução de sacarose a quinina, evidentemente, impede a alimentação de abelhas como eles vão afastar rapidamente se detectar uma substância aversivo (Vídeo Figura 1). Nesta experiência, os tratamentos têm um efeito significativo sobre a duração total de contactos tromba durante a fase de teste (ANOVA nos dados transformados em logaritmos, F 2,31 = 41, p &lt;0,001). O período de tempo de contacto com sacarose contendo quinina é significativamente reduzida em comparação com sacarose sozinha (p &lt;0,001), mas não à água desionizada sozinho (P = 0,219) (Figura 2). Da mesma forma, os tratamentos têm um efeito significativo sobre a duração total de surtos de alimentação (ANOVA nos dados transformados de log-F, <sUB&gt; 2,31 = 27,95, p &lt;0,001, Figura 3A). O período de alimentação ataques com sacarose contendo quinina é significativamente reduzida em comparação com sacarose sozinha (p &lt;0,001) mas não em relação à água desionizada sozinha (p = 0,41). Os tratamentos também têm um efeito significativo sobre a frequência de ataques de alimentação (Poisson GLM com uma função de ligação de registo, mudança de desvio em relação à distribuição c 2: p &lt;0,050), em que o número de ataques com sacarose contendo quinina é significativamente mais elevada em comparação com sacarose (p &lt;0,01), mas marginalmente significativamente diferente ao tratamento de água deionizada (p = 0,055, devido a um zangão exibindo sete lutas que alimentam na água, Figura 3B). Da mesma forma, a velocidade de retracção tromba difere significativamente entre os tratamentos (ANOVA nos dados transformados em logaritmos, F 2,31 = 5,12, P &lt;0,050). bumble abelhas retrair o proboscis distância a partir da solução de teste significativamente mais rápida após o primeiro contacto com sacarose contendo quinina que com sacarose ou água desionizada sozinho (p &lt;0,050, Figura 3C). Estes resultados sugerem que o quinino desencadeia um comportamento de evitação ativa em abelhas. Os tratamentos também têm um efeito significativo sobre o volume total da solução consumida (ANOVA nos dados transformados em logaritmos, F 2,32 = 62,5, p &lt;0,001), pelo que o consumo de sacarose contendo quinina é reduzida em comparação com sacarose (p &lt;0,001), mas não a água desionizada (p = 0,457) (Figura 4B). O volume da solução evaporou-se a partir do capilar durante o período de teste é negligenciável. Em condições de laboratório (25 ± 2 ° C e 28 ± 2% de humidade relativa), a evaporação varia entre 0,033 a 0,883 l com uma média de 0,276 mL e 0,171 mL de água desionizada e 1 M de sacarose, respectivamente. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Neste contatos ensaio entre a antena e a solução de teste não pode ser evitada. No entanto, a percentagem de abelhas usando suas antenas para saborear a solução de alimentação durante a fase de teste (sacarose: 46,1%, sacarose mais quinino: 60,0% e água deionizada: 33,3%) não é significativamente diferente entre os tratamentos (binomial GLM, mudança em desvio em relação à distribuição c 2: p = 0,450). Nenhum efeito dos tratamentos é encontrada na latência entre os primeiros contatos antenais e da solução de teste e os primeiros contactos da tromba (mediana: 2,67 seg para a sacarose; 1,10 seg para sacarose mais quinino; 0,80 seg para água deionizada, ANOVA na dados log-transformados, F 2,13 = 0,620, p = 0,550). Além disso, a percentagem de abelhas que se estendem a tromba para saborear a solução de teste permanece constante entre os tratamentos (sacarose: 66,7%; sacarose mais quinino: 50,0%; água deionizada: 52,2%; binomial GLM, mudança de desvio em relação à distribuição c 2: p = 0,840). Em conjunto, estes resultados sugerem que as antenas desempenhar um papel menor na detecção das toxinas no ensaio. Uma experiência separada examina se é necessário testar abelhas por um período de tempo superior a 2 minutos. A quantidade de alimento consumida por abelhas é testada com a sacarose 1 M ou quinino 1 mM em soluções de 1 M de sacarose em duas condições: um período de teste de 2 minutos e um período de teste de 10 min. Para ambos os tratamentos, o consumo total de alimentos não difere para os períodos de ensaio e não há interacções significativas ocorrer entre o período de teste e o tratamento (n = 6 - 13, de ANOVA nos dados de log transformado; efeito dos tratamentos: F = 1,31 54,8, p &lt;0,001; efeito do período de ensaio: F 1,31 = 0, p = 0,979; efeito da interacção: F = 0,1, P = 0,457). Em resumo, uma2 min período de teste é suficiente para avaliar o efeito da solução sobre a quantidade total de alimentos consumidos por abelhas e os efeitos inibidores de substâncias tóxicas ou repelentes neste ensaio. Assim, através da medição do consumo de alimentos e ensaiar o comportamento alimentar, é possível correlacionar consumo total de alimentos para a estrutura fina da alimentação durante o ensaio. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig1.jpg" /> Figura 1: períodos de latência entre a tromba Contatos durante os primeiros 2 min do ensaio de alimentação parcelas densidade dos períodos de latência tempo que separa cada contato tromba com a solução de sacarose 1 M, a solução quinino 1 M de sacarose + 1 mM e água.. Os dados cumulativos de 13, 10 e 11 abelhas estão representados, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> &lt;/ P&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig2.jpg" /> Figura 2: Tromba contato durações durante a Primeira 2 Min do ensaio de alimentação parcelas densidade das durações de contacto tromba de abelhas que se alimentam de 1 M de sacarose, 1 M de sacarose quinino mM + 1 ou água.. O tamanho da amostra como na Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig3.jpg" /> Figura 3: Proboscis Atividade dos zangões de alimentação em 1 M de sacarose, 1 M de sacarose + Quinine 1 mM ou água (A) O período de crises de alimentação durante a fase de teste (B) a frequência de alimentação lutas e (C) a velocidade. da tromba retração após o primeiro contato. Lettering indica uma diferença significativa: tratamentos com letras diferentes indicam P &lt;0,05. Os diagramas de caixa representam a mediana (barras pretas), o menor eo maior número de pontos de dados ainda dentro 1.5 do intervalo interquartil (bigodes) e outliers (círculos). O tamanho da amostra como na Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig4.jpg" /> Figura 4:. Suprime quinina alimentação por abelhas (A) imagens digitalizadas dos tubos microcapilares mostrando o nível de sacarose 1 M ou solução de quinino 1 M de sacarose, mais de 1 mm (indicado por uma linha preta) antes e depois da fase de teste respectivamente. (B) O consumo de 1 M de sacarose, 1 M de sacarose, mais quinina 1 mM ou água desionizada<html> sozinho por abelhas após a fase de teste. Lettering indica uma diferença significativa: tratamentos com letras diferentes indicam P &lt;0,001. Os diagramas de caixa representam a mediana (barras pretas), o menor eo maior número de pontos de dados ainda dentro 1.5 do intervalo interquartil (bigodes) e outliers (círculos). O tamanho da amostra como na Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Vídeo Figura 1: As gravações de vídeo a Actividade tromba direccionada no sentido (A) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/Video_figure_1A_1M_Sucrose.m4v" target="_blank">1 M de sacarose</a> , (B) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/Video_figure_1B_Quinine.m4v" target="_blank">1 H sacarose mais quinina 1 mM</a> e (C)d / 54233 / Video_figure_1C_Water.m4v &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Água deionizada durante a fase de teste.

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A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

A Novel Behavioral Ensaio investigar as gustativas de um indivíduo, livre-se deslocam Bumble abelhas (<em&gt; Terrestris do Bombus</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

8.6K visualizações.  Newcastle University. A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution. 

Vídeo: A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems. One important issue concerns the relative roles of each sensory modality in guiding behavior. The role of visual inputs has been examined by isolating visual stimuli from mechanical and chemosensory stimuli. In some studies (Bruski &amp; Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) visual inputs have been removed with blindfolds or low light intensity, and effects of remaining sensory modalities have been elucidated. An alternative approach is to study the effects of visual inputs in the absence of any appropriate mechanical and chemosensory cues. This approach aims to identify the exclusive role of visual inputs. 
We have used two methods to provide visual stimuli to crayfish without providing chemical and mechanical cues. In one method, crayfish are videotaped in an aquarium where half of the walls are covered in mirrors to provide a reflective environment, and the other half are covered in a non-reflective (matte finish) plastic. This gives the crayfish a choice between reflective and non-reflective environments. The reflective environment provides visual cues in the form of reflected images of the crayfish as it moves throughout half of the tank; these visual cues are missing from the non-reflective half of the tank. An alternative method is to videotape the behavior of crayfish in an aquarium separated by a smaller chamber at each end, with a crayfish in one small chamber providing visual cues and an inert object in the opposite small chamber providing visual input from a non-moving, non-crayfish source. 
Our published results indicate that responses of crayfish to the reflective environment depend on socialization and dominance rank. Socialized crayfish spent more time in the reflective environment and exhibited certain behaviors more frequently there than in the non-reflective environment; isolated crayfish showed no such differences. Crayfish that were housed in same-sex pairs developed a social rank of either dominant or subordinate. Responses to reflection differed between dominant and subordinate crayfish (May &amp; Mercier, 2006; May &amp; Mercier, 2007). Dominant crayfish spent more time on the reflective side, entered reflective corners more frequently and spent more time in reflective corners compared to the non-reflective side. Subordinate crayfish walked in reverse more often on the reflective side than on the non-reflective side. Preliminary data suggest similar effects from visual cues provided by a crayfish in a small adjoining chamber (May et al., 2008).

We have developed two methods for studying effects of visual cues on behavior in the absence of tactile and chemical cues. One method involves videotaping responses of crayfish to reflective walls in an aquarium; the other examines effects of visual inputs provided by a live crayfish behind a transparent partition.

Gravação de respostas comportamentais à Reflexão em Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Neurociência

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a noninvasive brain monitoring tool in cognitive neuroscience as well as a diagnostic tool for epilepsy and sleep disorders in neurology. However, the underlying mechanism of EEG rhythm generation is still under the veil. Recently introduced polyimide-based microelectrode (PBM-array) for high resolution mouse EEG1 is one of the trials to answer the neurophysiological questions on EEG signals based on a rich genetic resource that the mouse model contains for the analysis of complex EEG generation process. This application of nanofabricated PBM-array to mouse skull is an efficient tool for collecting large-scale brain activity of transgenic mice and accommodates to identify the neural correlates to certain EEG rhythms in conjunction with behavior. However its ultra-thin thickness and bifurcated structure cause a trouble in handling and implantation of PBM-array. In the presented video, the preparation and surgery steps for the implantation of PBM-array on a mouse skull are described step by step. Handling and surgery tips to help researchers succeed in implantation are also provided.

In this article, we described the surgery procedure and handling tips for implantation of ultra-thin polyimide-based microelectrode array (PBM-array) on the mouse skull for acquisition of high-density encephalography (EEG) in a mouse model.

Gravações de alta densidade EEG dos Ratos movimentando-se livremente usando Polyimide baseado microeletrodos

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors. Using animal models to accomplish this goal, many methodological strategies require invasive techniques to manipulate the intensity of the behavior of interest (e.g., lesion methods, pharmacological manipulations, microdialysis techniques, genetically-engineered animal models). The utilization of a comparative species approach allows researchers to take advantage of naturally occurring differences in response strategies existing in closely related species. In our lab, we use two species of the Peromyscus genus that differ in paternal responses. The male California deer mouse (Peromyscus californicus) exhibits the same parental responses as the female whereas its cousin, the common deer mouse (Peromyscus maniculatus) exhibits virtually no nurturing/parental responses in the presence of pups. Of specific interest in this article is an exploration of the neurobiological factors associated with the affiliative social responses exhibited by the paternal California deer mouse. Because the behavioral neuroscience approach is multifaceted, the following key components of the study will be briefly addressed: the identification of appropriate species for this type of research; data collection for behavioral analysis; preparation and sectioning of the brains; basic steps involved in immunocytochemistry for the quantification of vasopressin-immunoreactivity; the use of neuroimaging software to quantify the brain tissue; the use of a microsequencing video analysis to score behavior and, finally, the appropriate statistical analyses to provide the most informed interpretations of the research findings.

The comparative species approach allows behavioral neuroscientists to explore various neurobiological factors associated with specific behaviors viewed as characteristic of a specific animal model. Taking advantage of naturally occurring differences in behavior between closely related species, this technique doesn&#x2019;t require invasive techniques to manipulate the expression of the behavior.

Usando uma abordagem comparativa de espécies para investigar o Neurobiology of Responses Paternal

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

MPI CyberMotion Simulator: Implementation of a Novel Motion Simulator to Investigate Multisensory Path Integration in Three Dimensions

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. Humans can do path integration based exclusively on visual 2-3, auditory 4, or inertial cues 5. However, with multiple cues present, inertial cues - particularly kinaesthetic - seem to dominate 6-7. In the absence of vision, humans tend to overestimate short distances (&lt;5 m) and turning angles (&lt;30&deg;), but underestimate longer ones 5. Movement through physical space therefore does not seem to be accurately represented by the brain.
Extensive work has been done on evaluating path integration in the horizontal plane, but little is known about vertical movement (see 3 for virtual movement from vision alone). One reason for this is that traditional motion simulators have a small range of motion restricted mainly to the horizontal plane. Here we take advantage of a motion simulator 8-9 with a large range of motion to assess whether path integration is similar between horizontal and vertical planes. The relative contributions of inertial and visual cues for path navigation were also assessed.
16 observers sat upright in a seat mounted to the flange of a modified KUKA anthropomorphic robot arm. Sensory information was manipulated by providing visual (optic flow, limited lifetime star field), vestibular-kinaesthetic (passive self motion with eyes closed), or visual and vestibular-kinaesthetic motion cues. Movement trajectories in the horizontal, sagittal and frontal planes consisted of two segment lengths (1st: 0.4 m, 2nd: 1 m; &plusmn;0.24 m/s2 peak acceleration). The angle of the two segments was either 45&deg; or 90&deg;. Observers pointed back to their origin by moving an arrow that was superimposed on an avatar presented on the screen.
Observers were more likely to underestimate angle size for movement in the horizontal plane compared to the vertical planes. In the frontal plane observers were more likely to overestimate angle size while there was no such bias in the sagittal plane. Finally, observers responded slower when answering based on vestibular-kinaesthetic information alone. Human path integration based on vestibular-kinaesthetic information alone thus takes longer than when visual information is present. That pointing is consistent with underestimating and overestimating the angle one has moved through in the horizontal and vertical planes respectively, suggests that the neural representation of self-motion through space is non-symmetrical which may relate to the fact that humans experience movement mostly within the horizontal plane.

An efficient way to gain insight into how humans navigate themselves in three dimensions is described. The method takes advantage of a motion simulator capable of moving observers in ways unattainable by traditional simulators. Results confirm that movement in the horizontal plane is underestimated, while vertical movement is overestimated.

MPI Simulator CyberMotion: Implementação de um simulador de movimento Novela Caminho para Investigar Integração multisensorial em Três Dimensões

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Um Método para High Fidelity Optogenetic Controle de Individual Piramidal neurônios<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

RNAi mediado por Gene Knockdown duplo e Mensuração Percepção gustativa em abelhas do mel (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Recording Single Neurons' Action Potentials from Freely Moving Pigeons Across Three Stages of Learning

While the subject of learning has attracted immense interest from both behavioral and neural scientists, only relatively few investigators have observed single-neuron activity while animals are acquiring an operantly conditioned response, or when that response is extinguished. But even in these cases, observation periods usually encompass only a single stage of learning, i.e. acquisition or extinction, but not both (exceptions include protocols employing reversal learning; see Bingman&#160;et al.1 for an example). However, acquisition and extinction entail different learning mechanisms and are therefore expected to be accompanied by different types and/or loci of neural plasticity.
Accordingly, we developed a behavioral paradigm which institutes three stages of learning in a single behavioral session and which is well suited for the simultaneous recording of single neurons&#39; action potentials. Animals are trained on a single-interval forced choice task which requires mapping each of two possible choice responses to the presentation of different novel visual stimuli (acquisition). After having reached a predefined performance criterion, one of the two choice responses is no longer reinforced (extinction). Following a certain decrement in performance level, correct responses are reinforced again (reacquisition). By using a new set of stimuli in every session, animals can undergo the acquisition-extinction-reacquisition process repeatedly. Because all three stages of learning occur in a single behavioral session, the paradigm is ideal for the simultaneous observation of the spiking output of multiple single neurons. We use pigeons as model systems, but the task can easily be adapted to any other species capable of conditioned discrimination learning.

Learning new stimulus-response associations engages a wide range of neural processes which are ultimately reflected in changing spike output of individual neurons. Here we describe a behavioral protocol allowing for the continuous registration of single-neuron activity while animals acquire, extinguish, and reacquire a conditioned response within a single experimental session.

Registro do potencial de ação simples Neurônios &#39;de livremente mover Pombos em três estágios da aprendizagem

While the subject of learning has attracted immense interest from both behavioral and neural scientists, only relatively few investigators have observed ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such as epilepsy and neurodegenerative disorders. However, it is technically difficult to obtain EEG recordings in neonates as it requires specialized handling and great care. Here, we present a novel method to record EEG in neonatal rat pups (P8-P15). We designed a simple and reliable electrode using computer pin loci; it can be easily implanted into the skull of a rat pup to record high-quality EEG signals in the normal and epileptic brain. Pups were given an intraperitoneal (i.p.) injection of the neurotoxin kainic acid (KA) to induce epileptic seizures. The surgical implantation performed in this procedure is less expensive than other EEG procedures for neonates. This method allows one to record high-quality and stable EEG signals for more than 1 week. Furthermore, this procedure can also be applied to adult rats and mice to study epilepsy or other neurological disorders.

Here, we introduce a novel technique designed to record electroencephalography (EEG) in freely moving neonatal epileptic pups and describe its procedures, features, and applications. This method allows one to record EEG for more than 1 week.

Gravação de EEG em Ratos Neonatais de Movimentação Livre Usando um Novo Método

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

New Methods to Study Gustatory Coding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons (GRNs) detect tastant molecules, they encode information about the identity and concentration of the tastant as patterns of electrical activity that then propagate to follower neurons in the brain. These patterns constitute internal representations of the tastant, which then allow the animal to select actions and form memories. The use of relatively simple animal models has been a powerful tool to study basic principles in sensory coding. Here, we propose three new methods to study gustatory coding using the moth Manduca sexta. First, we present a dissection procedure for exposing the maxillary nerves and the subesophageal zone (SEZ), allowing recording of the activity of GRNs from their axons. Second, we describe the use of extracellular electrodes to record the activity of multiple GRNs by placing tetrode wires directly into the maxillary nerve. Third, we present a new system for delivering and monitoring, with high temporal precision, pulses of different tastants. These methods allow the characterization of neuronal responses in vivo directly from GRNs before, during and after tastants are delivered. We provide examples of voltage traces recorded from multiple GRNs, and present an example of how a spike sorting technique can be applied to the data to identify the responses of individual neurons. Finally, to validate our recording approach, we compare extracellular recordings obtained from GRNs with tetrodes to intracellular recordings obtained with sharp glass electrodes.

We present three new methods to study gustatory coding. Using a simple animal, the moth Manduca sexta (Manduca), we describe a dissection protocol, the use of extracellular tetrodes to record the activity of multiple gustatory receptor neurons, and a system for delivering and monitoring precisely timed pulses of tastants.

Novos métodos para estudar codificação gustativa

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Desenvolvimento de ensaio para quantificação de conteúdo elevado de Sod1 proteína mutante formação agregada em células vivas

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...