Os autores gostariam de agradecer a Leica Microsystems para os seus conselhos valiosos sobre seções de imagens de titânio e Gemini Bio Produtos para fornecer o soro de suínos utilizados neste estudo. Temos também de agradecer aos NIH para o seu apoio através de Grant &quot;forro autólogo EPC para melhorar a biocompatibilidade de dispositivos de assistência circulatória&quot;, RC1HL099863-01. Além disso, estamos gratos pelo apoio da National Science Foundation Graduate Research Fellowship de Alexandra Jantzen. Também gostaria de agradecer George rápida, Mike Lowe e Ianthia Parker para ajudar com muitos aspectos do procedimento cirúrgico e manipulação dos animais de nossa pesquisa. Steven Owen tem sido inestimável para usinagem de peças muitas das nossas dispositivo semeadura e corte de tubos de titânio.

<ol>
	<li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+bleeding+and+clotting+in+the+cardiac+surgery+patient:+from+vascular+endothelium+to+circulatory+assist+device+surface.">Pathophysiology of bleeding and clotting in the cardiac surgery patient: from vascular endothelium to circulatory assist device surface.</a> Circulation. 122, 2068-2077 (2010).</li><li>Achneck, H. E., Sileshi, B., Lawson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+biology+of+bleeding+and+clotting+in+the+surgical+patient.">Review of the biology of bleeding and clotting in the surgical patient.</a> Vascular. 16, 6-13 (2008).</li><li>Arvidsson, S., Askendal, A., Tengvall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+plasma+contact+activation+on+silicon,+titanium+and+aluminium.">Blood plasma contact activation on silicon, titanium and aluminium.</a> Biomaterials. 28, 1346-1354 (2007).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biocompatibility+of+titanium+cardiovascular+devices+seeded+with+autologous+blood-derived+endothelial+progenitor+cells:+EPC-seeded+antithrombotic+Ti+Implants.">The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants.</a> Biomaterials. 32, 10-18 (2011).</li><li>Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+pig+models+of+venous+thrombosis+mimicking+human+disease.">In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease.</a> Thromb Haemost. 89, 256-263 (2003).</li><li>Ueberrueck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+ovine+and+porcine+animal+models+for+biocompatibility+testing+of+vascular+prostheses.">Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses.</a> J Surg Res. 124, 305-311 (2005).</li><li>Velik-Salchner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+values+for+thrombelastography+(ROTEM)+and+selected+coagulation+parameters+in+porcine+blood.">Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood.</a> Thromb Res. 117, 597-602 (2006).</li><li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem/progenitor+cell+principals.">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. , (2010).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+titanium+ventricular+assist+device+surfaces+after+gold/palladium+coating+for+scanning+electron+microscopy.">Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy.</a> Microsc Res Tech. 73, 71-76 (2010).</li><li>Ford, J. W., Welling, T. H., Stanley, J. C., Messina, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKH26+and+125I-PKH95:+characterization+and+efficacy+as+labels+for+in+vitro+and+in+vivo+endothelial+cell+localization+and+tracking.">PKH26 and 125I-PKH95: characterization and efficacy as labels for in vitro and in vivo endothelial cell localization and tracking.</a> J Surg Res. 62, 23-28 (1996).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de tubos das células de semeadura de Ti aqui apresentada permite que médicos e cientistas de forma rápida e uniformemente endothelialize sangue entrar em contato com as superfícies dos dispositivos implantáveis. Desde que isolar e expandir EPCs a partir de amostras de sangue periférico, nenhum procedimento invasivo principais é necessária para a colheita destas células. Além disso, o CPE são autólogos e, portanto, o risco de qualquer reação imunológica ao implante de células-semeada é eliminado. Os princípios demonstrados em seu protocolo pode ser utilizado não só para os tubos de Ti, mas para muitos outros biomateriais, que são utilizados na medicina cardiovascular. Passos críticos neste protocolo são a limpeza meticulosa dos tubos de Ti, como descobrimos que qualquer filme aderente de adesão de contaminantes compromissos celular. Além disso, uma velocidade de rotação lenta (inversamente proporcional ao diâmetro do tubo) é essencial durante o processo de semeadura, de modo que EPCs pode lentamente se estabelecer e aderir à superfície como o tubo de Ti está se movendo. Nosso método de semeadura imediatamente antes da implantação evita impraticável ex tempos de cultivo in vivo, as células aderem individualmente e, posteriormente, formar uma folha confluentes in vivo, evitando a possibilidade de embolização como uma folha imediatamente após o restabelecimento do fluxo. Nossos estudos anteriores mostram que uma vez que o CPE tem crescido a uma camada confluente, eles fazem uma matriz extra-celular para o qual eles aderem firmemente, adicionalmente, minimizando qualquer sloughing possível de uma folha endoteliais. Embora a possibilidade de descolamento embólicos não pode ser inteiramente descartada, parece ser de risco multifold inferior trombose da superfície dispositivo inteiro, o problema que esta terapia é projetado para impedir. Nossa abordagem de implantação na corte baixo, o ambiente pró-trombótico da veia cava inferior utiliza um dos mais confiáveis ​​modelos animais de grande porte para a pesquisa de compatibilidade de sangue e trombose de dispositivos de 5,6. Note-se que todos os cuidados com animais de experimentação e foi conduzido de acordo com o Instituto Nacional de Saúde Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e somente após a aprovação do Animal Care Duke University Institucional e Comitê de uso. A fim de conseguir utilizar este método para testar o implante de biomateriais e dispositivos, é importante pacientemente esqueletizar o segmento da VCI e ligar todos os vasos venosos filial em preparação para a inserção do dispositivo, tal que nenhum sangramento em torno do dispositivo tem origem em uma &quot;falsa luz&quot;. Outro passo fundamental é a adição de DPBS no lúmen dispositivo de tal forma que as células na superfície do tubo dentro de permanecer úmida durante o fechamento do veinotomy e antes da reperfusão é iniciada. Se o dispositivo não pode ser encontrado no local onde foi implantado, ele pode ter migrado &#39;upstream&#39; na VCI. Isto pode ser evitado colocando uma sutura (Prolene 4-O), através da parede da veia e através de um 2-3 mm de seção da tubulação de PVC de modo que o tubo está firmemente ancorada em sua posição atual. O pesquisador deve ter dificuldade em encontrar as células fluorescente pré-rotulados mostrado na Figura 8, após explante em um tubo de outra forma patente, é provável que as células têm descascada como uma folha coerente. Isto pode ser evitado por meio de dissecção muito gentil da veia circundante e dis-montagem das três secções tubulares Ti, depois da fixação da veia juntamente com o tubo. Nossa tecnologia fornece a prova de conceito para prevenção de trombose dispositivo cardiovascular através de EPC-semeadura. Esta tecnologia pode ser usada no desenvolvimento de &quot;biogênicos&quot; implantes alinhados com os próprios pacientes, as células progenitoras endoteliais. O estudo de viabilidade em nosso modelo animal porcino prevê os primeiros passos em direção a tradução deste &quot;medicina personalizada&quot; na prática clínica.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Nome da Empresa </td><td> Número Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Acepromazina </td><td> Boehringer-Ingelheim </td><td> BIC670025 </td><td> NAC # 10280002 </td></tr><tr><td> Alconox Cleaner Precision Produzido </td><td> Alconox </td><td> 1104 </td><td></td></tr><tr><td> Balfour Retractor Cirúrgica </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Baytril </td><td> Bayer </td><td> APVMA 46028/0705 </td><td></td></tr><tr><td> Borboleta Needle (19G) </td><td> Terumo </td><td> SV19CLK </td><td></td></tr><tr><td> Clorexidina </td><td> 3M </td><td> 9200 </td><td></td></tr><tr><td> Grampos (45 graus) </td><td> Aesculap </td><td> FC339T </td><td></td></tr><tr><td> DPBS (-/-) </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS (+/+) </td><td> Gibco </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> DuraPrep </td><td> 3M </td><td> 8635 </td><td></td></tr><tr><td> EBM-2 Medium </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td><td> Base para as médias de crescimento sérico livre e pleno </td></tr><tr><td> EGM-2 SingleQuots </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td><td> Usado com EBM-2 para ambos meio de crescimento sérico livre e pleno </td></tr><tr><td> Ferramenta de eletrocautério </td><td> Valleylab </td><td> SurgII-20 </td><td></td></tr><tr><td> Lixa de esmeril </td><td> 3M </td><td> 60-0700-0425-8 </td><td> 240 grit </td></tr><tr><td> Euthasol Solução Eutanásia </td><td> Virback Saúde Animal </td><td></td><td> Anada #: 200-071 </td></tr><tr><td> Fentanilo </td><td> Actavis </td><td></td><td> NDC # 67767-120-18 </td></tr><tr><td> Flunixin </td><td> Schering-Plough </td><td></td><td> NAC #: 10470183 </td></tr><tr><td> Foley Cateter (16F) </td><td> Bardo </td><td> 730116 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Heat Gun </td><td> Milwaukee </td><td> 8988-20 </td><td></td></tr><tr><td> Heparina </td><td></td><td></td><td> NDC #: 25021 </td></tr><tr><td> Histopaque-1077 </td><td> Sigma </td><td> H8889-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Tubo de intubação </td><td> Mallinckrodt </td><td> 86113 </td><td></td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> MWI, Meridian </td><td></td><td> NDC # 13985-030 </td></tr><tr><td> IV cateter (18G) </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 381547 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamina </td><td> Fort Dodge </td><td></td><td> NDC # 0856-2013 </td></tr><tr><td> Nível </td><td> Swanson </td><td> LLA001 </td><td></td></tr><tr><td> Luer-Lock ponta cap </td><td> CML Abastecimento </td><td> 909-001 </td><td></td></tr><tr><td> Marcaine </td><td> Hospira </td><td></td><td> NDC #: 0409-1560-10 </td></tr><tr><td> Tesoura Metzenbaum </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Micro-introdutor (5F) </td><td> Galt </td><td> KIT 002-01 </td><td></td></tr><tr><td> Pinça Mosquito </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Motor </td><td> Herbach e Rademan </td><td> H1-08 </td><td></td></tr><tr><td> Oximorfona </td><td> Endo Labs </td><td></td><td> NDC: 63481-624-10 </td></tr><tr><td> PKH26 Dye Kit </td><td> Sigma </td><td> PKH26GL-1KT </td><td></td></tr><tr><td> Serum suína </td><td> Gémeos Bio-Products </td><td> 100-115 </td><td> Concentração de 2% em meio de crescimento total </td></tr><tr><td> Tesoura Potts </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Pele precisa Vista grampeador </td><td> 3M </td><td> 3998 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de PVC </td><td> McMaster-Carr/Insultab </td><td> 7132K117 </td><td> expandiu 15,88 mm de diâmetro, ID recuperado 7,95 milímetros </td></tr><tr><td> Tamanho Médio direito Angle </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Bisturi Blade (# 10-15) </td><td> Bardo </td><td> 373910 </td><td></td></tr><tr><td> Tubulação de silicone </td><td> McMaster-Carr </td><td> 51735K26 </td><td> 16,64 milímetros OD, 9,52 mm de diâmetro </td></tr><tr><td> Seringa (5 ml) </td><td> Becton-Dickinson (BD) </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td> Tegaderm </td><td> 3M </td><td> 90001 </td><td></td></tr><tr><td> Torneira de três vias </td><td> Kendall </td><td> 170060 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo de Ti </td><td> Tico Titanium </td><td> N / A </td><td> Especificado como ½ &quot;OD, 0,065&quot; de parede, 0,370 ID &quot;, £ 0,1737 / ft </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina solução neutralizante (TNS) </td><td> Lonza </td><td> CC-5002 </td><td> 0,03% </td></tr><tr><td> Vetropolycin </td><td> Pharmaderm Saúde Animal </td><td></td><td> NAC #: 12920110 </td></tr><tr><td> Vicryl sutura (3-0) </td><td> Ethicon </td><td> J808T </td><td></td></tr><tr><td> Aparelho de ultrasons de água </td><td> Branson </td><td> B200 </td><td></td></tr></tbody></table>

autologous endothelial progenitor cell-seeding technology and biocompatibility testing for cardiovascular devices in large animal model

Implantáveis ​​cardiovasculares são fabricados a partir de materiais artificiais (por exemplo, titânio (Ti), politetrafluoroetileno expandido), que representam o risco de formação tromboêmbolos 1,2,3. Nós desenvolvemos um método para a linha de superfície interna de tubos de Ti com autólogo derivados do sangue humano ou de suíno células progenitoras endoteliais (EPCs) 4. Através da implantação de tubos de Ti contendo uma camada confluente de EPCs suína na veia cava inferior (VCI) de porcos, testamos a biocompatibilidade melhorada da superfície da célula-semeado no ambiente pró-trombótico de um modelo animal de grande porte e comparou-a inalterada superfícies de metal nu 5,6,7 (Figura 1). Este método pode ser usado para endothelialize dispositivos dentro de poucos minutos de implantação e teste sua função antitrombótica in vivo. Sangue periférico foi obtido a partir de 50 kg Yorkshire suína e sua fração de células mononucleares de cultura para isolar EPCs 4,8. Ti tubos (9,4 mm de diâmetro) foram pré-cortados em três seções 4,5 centímetro longitudinal e remontado com calor-encolhem a tubulação. Um dispositivo de semeadura foi construído, que permite a rotação lenta dos tubos de Ti. Foi realizada uma laparotomia na porcos e exteriorizada do intestino e bexiga urinária. Dissecção cortante e contundente foi usado para esqueletizar da VCI de sua bifurcação distal à artéria renal direita proximal. Os tubos de Ti foram então enchidos com fluorescente marcado autólogo suspensão EPC e rodado em 10 RPH x 30 min para alcançar uniforme de células de revestimento-9. Após a administração de heparina 100 USP / kg, ambas as extremidades do IVC e uma veia lombar foram presos. A veinotomy 4 cm foi realizada eo dispositivo inserido e preenchido com tampão fosfato. Como o veinotomy foi fechada com uma sutura Prolene 4-0, um grampo foi removido para o IVC de-ar. No final do procedimento, a fáscia foi aproximado com 0-PDS (polidioxanona sutura), o espaço subcutâneo fechado com Vicryl 2-0 ea pele fechados com grampos. Após 3-21 dias, os porcos foram sacrificados, o dispositivo explantado en-bloco e fixa. Os tubos foram desmontados Ti e as superfícies internas fotografada com um microscópio de fluorescência. Descobrimos que os tubos de metal simples Ti totalmente ocluído enquanto os tubos EPC-semeado permaneceu patente. Além disso, fomos capazes de demonstrar uma camada confluente de EPCs na superfície de sangue entrar em contato com seu interior. Concluindo, a nossa tecnologia pode ser usada para endothelialize tubos de Ti em poucos minutos de implantação com EPCs autólogo para prevenir a trombose do dispositivo. Nosso método cirúrgico permite testar a biocompatibilidade melhorada de tais dispositivos modificados com a perda de sangue mínima e EPC-semeado interrupção superfície.

Watch this Scientific Journal Video about Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model at JoVE.com

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Um método para semeadura de titânio de sangue entrar em contato com biomateriais com células autólogas e biocompatibilidade teste é descrito. Este método utiliza células progenitoras endoteliais e tubos de titânio, semeadas em poucos minutos de implante cirúrgico em suínos as cavas. Esta técnica é adaptável a muitas outras implantáveis ​​dispositivos biomédicos.

Autólogas progenitoras endoteliais Cell Technology Semear e Teste de biocompatibilidade para dispositivos Cardiovascular em Modelo Animal Grande

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

autologous-endothelial-progenitor-cell-seeding-technology

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.3K visualizações.  Duke University. Um método para semeadura de titânio de sangue entrar em contato com biomateriais com células autólogas e biocompatibilidade teste é descrito. Este método utiliza células progenitoras endoteliais e tubos de titânio, semeadas em poucos minutos de implante cirúrgico em suínos as cavas. Esta técnica é adaptável a muitas outras implantáveis ​​dispositivos biomédicos.