Yazarlar, bu çalışmada kullanılan domuz serum sağlamak için görüntüleme titanyum bölümleri ve İkizler Bio-Ürünler değerli tavsiye için Leica Microsystems teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, RC1HL099863-01 &quot;Otolog EPC astar dolaşım, biyouyumluluk yardımcı cihazlar geliştirmek için&quot; Hibe yoluyla NIH verdikleri destek için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, Ulusal Bilim Vakfı Yüksek Lisans Araştırma Bursu Alexandra Jantzen destek için minnettarız. Ayrıca, cerrahi prosedür birçok açıdan yardımcı ve araştırma hayvanların işleme George Hızlı, Mike Lowe ve Ianthia Parker teşekkür etmek istiyorum. Steven Owen bizim tohumlama cihazın işleme pek çok yerinde çok değerli ve titanyum borular vardır.

1. Endotel progenitör hücre izolasyonu <ol><li> EPC numaralı seribaşı tüp implantasyonu otuz gün önce, 15 ml antikoagülan sitrat dekstroz çözeltisi ile, 60 ml şırınga hazırlamak ve EPC, periferik domuz kandan izolasyonu için 3-yollu vanasını ile güvenli. 24 saat önce kan beraberlik, Astar iki Tip 1 sıçan kolajen (50 mg / ml 0,02 N asetik asit çözeltisi içinde çözünmüş) 4 ile 12 kuyucuğu. </li><li> Ulusal Enstitüsü Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi doğrultusunda ve sadece nezaret Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayından sonra, tüm hayvan bakımı ve deney gerçekleştirin. </li><li> Bir kadın Yorkshire Acepromazine sakinleştirmek ile domuz (45 kg) (1.1 mg / kg) ve Ketamin (22 mg / kg), 19 G kelebek iğne ile intramüsküler. </li><li> Endotrakeal tüp (30 cm uzunluğunda, 8 mm ID) ile domuz entübe ve İsofluranın (maske ile gelgit hacmi% 4.5) ile domuz uyutmak. </li><li> Oksijen satürasyonu, kalp hızı ve sıcaklığı ölçerek işlem sırasında domuz izleyin. Otomatik bir ısıtılmış ameliyat masasında ve ısıtma battaniyesi kullanarak ve infüze edilen sıvı ısınmanın termoregülasyon koruyun. </li><li> Domuz ameliyat masasına yatar pozisyonda yerleştirin caudolaterally arka bacaklarda, güvenli ve DuraPrep sterilizasyon takip Klorheksidin ile temizleyin. Daha sonra pelvik bölgede draping devam edin. </li><li> Femoral ven içine palpabl femoral nabız (vastus medialis ve gracilis kası lateral medial) sadece medial 5 F mikro-introducer kiti, 21 G x 7 cm iğne takın ve Seldinger tekniği kullanılarak damar cannulate. Intravasküler kateter, hazırlanan 60 ml şırınga bağlayın ve 45 ml kan çekmek. </li><li> Hemostaz (5 dk) elde etmek için damar ponksiyonu sitesi üzerinde baskı tutun, anestezi durdurma ve domuz kurtarmak. Hayvan tam iyileşme kadar takip ve kendi kafesine döndü. </li><li> Kan çözüm Hank tamponlu tuz solüsyonu ile 1:1 (CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4 olmadan) ve eşit miktarda iyi tanımlanmış katmanlar oluşturmak için Histopaque katman sulandırınız. Santrifüj (30 dk, 740 g, düşük bir kırılma ayarı) ve toplamak mononükleer hücre (ÇUŞ) katmanı. Süspanse edin ve Dulbecco&#39;nun Fosfat yıkama ÇUŞ x 3 tam büyüme orta iki 12-iyi plakaları (EBM-2 orta% 2 Domuz Serum (PS) ve EGM-2 ile içine kaplama önce Tuzlu (DPBS) (10 dak, 515 gr) Tamponlu SingleQuots) 37 ° ° C,% 5 CO 2. </li><li> Yavaş yavaş daha sonra ilk 7 gün, her gün her 24 saatte bir, orta değiştirin. Ortalama bir süre sonra EPC koloniler tespit 7 gün (Şekil 2). </li><li> 12-iyi bir yüzey alanı ¼ kapağı bir kez kültür EPC genişletin. Flow sitometri ile CD14 CD31 ve yokluğu, CD45 yüzey belirteçlerinin varlığı için test EPC kimlik onaylayın. Diğer testleri yapılabilir 4. akışına maruz kaldıktan sonra, hücre morfolojisi ve nitrik oksit III aktivite içerir . </li></ol> 2. Titanyum boru montaj <ol><li> HHS dilme 72 dişlere sahip boyuna Bölüm 3 eşit 120 derecelik birimleri (4,5 cm uzunluğunda) içine bir Ti borusu dikey freze testere mili tarafından yerinde tutulur gördüm. 300 RPM çalıştırın ve kesim esnasında her zaman dokunun Magic Kesme Yağı (Şekil 3) ile doymuş kesim alanı tutmak. </li><li> Lehçe bir tezgah değirmeni ve bir Scotch-Brite metal işleme simidi ile iç yüzeyi. Sonra daha da pürüzsüz ve yüzey 3M zımpara bezle elle lehçe görünür bir çukurları kaldırmak için. </li><li> Aqua regia oldukça aşındırıcı ve su altında 5 dakika, birkaç litre su 10 ile durulama ardından aqua regia (01:03 konsantre hidroklorik asit ve konsantre nitrik asit), Egzersiz son derece dikkatli takip Ti adet, Alconox sabun solüsyonu ile temizleyin Potansiyel olarak patlayıcı! </li><li> Sonikasyon Ti bölümler x 16 dk Alconox sabun çözeltisi, deiyonize su x 30 yükselişi ve deiyonize su x 16 dk tekrar sonikasyon. Laminer akış kaput kurumasını bekleyin. </li><li> 4.5 cm uzunluğunda ve 2.4 ortalama temiz Kes PVC ısı küçültmek boru. </li><li> 3 temizlenir Ti bölümleri destekleyici bir mandrel (alüminyum, 8,5 mm OD işlendi) ve Ti bölümleri etrafında PVC ısı shrink boru (Şekil 4) kol üzerine yerleştirmek için cımbız kullanın. Eşit Ti bölümleri birbirine sıkıca sarın mandrel açarken bir ısı tabancası ile şirink tüplerde. </li></ol> 3. Seeding cihaz ve montaj <ol><li> Silikon tüp, 2,5 cm ve 3,5 cm uzunluğunda kesin. </li><li> Bölüm 5 cc plastik 0.8 ml şırınga ve döner sonu ile &#39;başlık&#39; tutmak. </li><li> 2 x silikon bölümleri, şırınga &#39;başlık&#39; ve 2.4 &#39;de açıklandığı gibi bir döner kap sonication iyice temizleyin. </li><li> Mikolojik monte Ti tüpün her iki ucunda, 2.5 silikon tüp ekle5 mm PVC boru üzerinde ding. </li><li> Abuts Ti borusu (Şekil 5), böylece, kısa bir silikon tüp içine şırınga &#39;başlık&#39; ucu yerleştirin. </li><li> Seal Tyvek çantası ve etilen oksit gazı (18 saat 55 ° C) ile sterilize bir döner kap Ti boru montaj bitirdi. </li><li> Senkron bir zamanlama motor (10 RPH) pleksiglas bir platform üzerine monte edin ve bir şırınga tutucu (alüminyumun işlenmiş, 5 cc şırınga uyan) (Şekil 6) aks bağlamak. </li></ol> 4. EPC-Ti tüp iç yüzeyi tohumlama <ol><li> 1 altında izole olarak EPC genişletin. T-75 şişeler 3 konfluent (veya en az 9 x 10 6 hücre). </li><li> Ameliyat günü, uzun vadeli boya (PKH26) 11 ile floresan etiket hücreleri. Iki kez serum serbest orta kültürlü EPC durulama başlayın. Dikkat etiketleme sırasında ve sonrasında hücreleri korumak için ışık maruz kalma sınırı. </li><li> 4 dakika boyunca oda sıcaklığında Dilüent C 4 mcM PKH26 (boya solüsyonu) ile hücreleri örtün. </li><li> Eşit miktarda boya çözüm domuz serumu ekleyerek reaksiyon etiketleme durdurun. Bir dakika sonra, tam büyüme ortamı ile birlikte çözüm 01:01 sulandırmak. </li><li> Sıvı aspire edin ve tam besi hücreleri x 3 durulayın. </li><li> (CaCl 2, MgCl 2 olmadan) iki kez DPBS EPC yıkayın. </li><li> 3 dakika 37 tripsin ve inkübe hücreleri ° C Kapak ve ışık mikroskobu altında dekolmanı onaylamak. Kullanılan tripsin çift ses tripsin Nötralizasyon Çözüm ekleyin. </li><li> Pipetleme tarafından tek bir tüp ve karışımı içine hücre çözümleri birleştirin. 10 ul hücre çözüm saymak için bir hemasitometre her tarafına ekleyin. </li><li> Santrifüj hücre çözümü (1500 RPH, 5 dk.) 2 hücreleri ve tekrar süspansiyon pelet sayısı 2.5 x 10 6 EPC / ml serum serbest ortamda. Boru montaj 4,5 ml doldurmak için minimum hacim unutmayın. </li><li> Steril alan için biyolojik kaput steril havlu yerleştirin. Açık gaz steril steril sahaya Ti boru montaj ve ilave 5 cc şırınga. </li><li> Steril eldiven, 5 cc şırınga pistonu kaldırmak ve daha sonra kullanmak üzere alan üzerinde tutmak. Bu şırınga sabitleyiniz döner kap. </li><li> Pipetleyin 4.5 - 4.9 altında açık şırınga varil içine 5 ml EPC süspansiyon. Piston geri şırınga açık ucunu güvenli bir şekilde yerleştirin. </li><li> Yukarı kap şırınga tutun ve kapağı çıkarın. Ti tüp içinde ilerleme yok; rahatça kadar ilk döner sonuna Ti boru montaj açık silikon tüp içine şırınga takın. </li><li> Avans şırınga pistonu yavaş yavaş hücre çözümü kabarcıklar sistemden kaldırma &#39;, baş parça kesme şırınga üst ulaşana kadar. Luer kapağı ile kapatın ve tüm montaj bandı ile sızdırmazlık, açık ucunu steril kılıf içine yerleştirin. </li><li> Tüm bu meclis 3.7 işlenmiş şırınga tutucunun içine yerleştirin. 37 inkübatörde Yeri ° C ve tohumlama odasının bu Ti tüp kısmı su seviye göstergesi (Şekil 6) kullanarak, böylece bir platform ayarlayın. </li><li> Ti boru montaj implantasyon 30 dakika önce döndürmek için izin verin. </li></ol> 5. Domuz vena kavaya Ti tüp implantasyonu <ol><li> Ameliyat öncesinde yirmi dört saat, Fentanil bir patch (yama yer x 72 saat 100 mg / saat transdermal) ile domuz premedicate (EPC izole edildiği). </li><li> Domuz NPO gecede tutun ve ameliyat günü (5 mg / kg, IM) ve 7 gün süreyle antibiyotik profilaksisi olarak her 24 saatte bir, aşağıdaki preoperatif Baytril (Enrofloxacin) yönetmek. </li><li> Sakinleştirmek, entübe ve 1.3 altında açıklandığı gibi domuz uyutmak (10 -15 ml / kg tidal volüm) ve ameliyathane masaya yatar pozisyonda domuz güvenli. Oksijen satürasyonu, kalp hızı ve sıcaklığı ölçerek işlem sırasında domuz izleyin. Otomatik bir ısıtılmış ameliyat masasında ve ısıtma battaniyesi kullanarak ve infüze edilen sıvı ısınmanın termoregülasyon koruyun. </li><li> , 18 G IV kateter domuz kulak damar içine yerleştirin ve Vetropolycin göz damlaları ile domuz gözleri korumak. </li><li> Temiz, hazırlık ve 1.6 olarak domuz karın asmak. Kaudal son meme bezlerinin cranially 2. 2. # 15 neşter bıçak ile orta hat İnsizyon. </li><li> Elektrokoter ile karın fasya diseksiyonu aşağı taşıyın. </li><li> Sivrisinek forseps ile periton kaldırın ve Metzenbaum makası ile dikkatlice girin. </li><li> Mesane Externalize ve 3-O Vicryl çanta-string sütür mesane duvar içine yerleştirin. Onun ortasında bir bıçak kesi yerleştirin ve 16 F Foley kateter yerleştirin. Idrar çıkışı titre intravenöz sıvılar (Laktat Ringers) Yönetici&gt; / = 1 ml / kg / saat ameliyat sırasında. </li><li> Sonra, ince ve kalın bağırsak ve yeri iki Balfour cerrahi retraktörlere peritoneal kavitenin posterior yönünü ortaya çıkarmak ve inferior vena kava (IVC) tanımlamak için dışa. </li><li> Dikkatli, keskin ve künt diseksiyon<html> IVC dokusu çevresindeki ücretsiz ve IVC distal bifurkasyon proksimal sağ renal arter damar deri bir kemik. IVC bile çok küçük bir kusur hayvan hızlı kanama ve exsanguination neden olabileceğinden IVC diseksiyonu sırasında son derece dikkatli olun. </li><li> Implante Ti tüp etrafında kanama olacağı sağlamak için IVC segmentinde tüm yan dalları Arter. Çok dikkatli diseksiyon ve ligasyon gerektiren genellikle büyük iki posterior lomber venler unutmayın. Ayrıca, IVC bifurkasyosunda hemen proksimal, büyük bir lumbar ven genellikle posteromedial tarafında karşılaştı ve ücretsiz ve kelepçe yerleştirme için hazırlık gemi döngüler ile kontrol disseke olmalıdır unutmayın. </li><li> Ti tüp aynı anda 4 altında belirtildiği gibi tohumlama ile devam edin. </li><li> 100 USP / kg heparin hemen önce IVC sıkma yönetin. IVC ve lumbar ven distalde 45 derecelik açı cerrahi kelepçeler yerleştirin ve sonra proksimale. </li><li> Potts makas ile uzantısı takip # 11 neşter bıçak kullanarak proksimal ve distal kelepçeler arasında uzunlamasına veinotomy (4 cm) oluşturun. </li><li> IVC herhangi bir kan boşaltın ve iç lümen steril DPBS ile yıkayın. </li><li> Şimdi IVC içine yerleştirin ve EPC numaralı seribaşı Ti borusu (veya çıplak metal kontrolü), kurumasını hücreler önlemek ve hava tahliye DPBS (CaCl 2, MgCl 2) ile doldurun . </li><li> Veinotomy 4-0 Prolen çalışan sütür ile kapatın ve arka kanama küçük bir miktar ile de hava IVC bir proksimal klemp kaldırmak. Zamanla implant göçü önlemek için PVC boru içine damar duvarına bir &#39;stay-dikiş&#39; koyun. </li><li> 2-O Vicryl (sütürlerinin) ile BT iğne ve subkutan alan O-PDS ile fasya kapatın. Zımba ile cilt kapatın. </li><li> 20 ml kadar kesi boyunca subkutan% 0.25 Marcaine (Bupivakain) Yönetici ve gazlı bez ve Tegaderm yara kapsayacak. Subkutan olarak ağrı için gerekli Flunixin (2.2 mg / kg S 24 saat) ve Oxymorphone (4 saat 0.15 mg / kg &#39;Q 3) vermek. </li><li> Anestezi durdurun, uyanık kadar domuz izlemek ve kafes dönmek. Sıkıntı / ağrı, ayakta durma ve ambulasyon, dışkı ve idrar çıkışına ve ten rengi normal perfüzyon gösteren işaretleri için günde iki kez domuz izleyin. </li></ol> 6. Ti tüp, kaçırmanın <ol><li> 3 hafta sonra, oturaklı, entübe ve 1.3 &#39;de açıklandığı gibi domuz uyutmak - 1.4. </li><li> 5.8 - 5.5 &#39;de açıklandığı gibi bir laparotomi ile devam edin. </li><li> Ancak in situ sert Ti tüp palpe skarlasma implant yeri gizlemek unutmayın. </li><li> 5.9 de açıklandığı gibi IVC teşrih - 5.11 ve Ti tüp ağır makas ile çevredeki IVC ile en-blok eksplant. </li><li> Euthasol ötenazi çözüm (390 mg / ml pentobarbital Sodyum ve 50 mg / ml Fenitoin Sodyum 1 ml / 10 lbs) ile hayvan Euthanize. </li></ol> 7. Fiksasyon ve görüntüleme Ti iç yüzey <ol><li> DPBS çözüm Ti tüp ile ven segmenti eksize durulayın ve yüksek çözünürlüklü bir dijital kamera (Şekil 7) ile lümen (patent veya tıkalı) fotoğraf. </li><li> Ardından, 15 dakika en az% 3.7 paraformaldehid dalma örnek düzeltmek. DPBS çözümü numune durulayın. </li><li> Çok dikkatli bir şekilde çevredeki ven ve Ti borusu açmak için PVC boru insizyon. Floresan kırmızı / turuncu renk (Şekil 8A) PKH26-etiketli EPC görselleştirmek için 550 nm dalgaboyu / ışık kaynağı ve görüntü altında objektif bakan iç yüzeyleri ile mikroskop altında 3 bölümden yerleştirin. İsterseniz, hücreler (örneğin, Platelet Endotel Hücre Adezyon Marker (PECAM hücre kenarlıkları (Şekil 8B), çekirdekleri görselleştirmek için DAPI leke vb görselleştirmek için)-leke) daha da lekeli olabilir. </li></ol> 8. Temsilcisi sonuçları: Bu protokolün uygulanması sonrasında, doktorlar ve bilim adamları, büyük bir hayvan modeli otolog kan endotel progenitör hücreler ile katı tüp yapıları endothelialize mümkün. Şekil 2 yöntemi ile izole EPC arnavut kaldırımlı morfolojisi ile yaklaşık 7 gün sonra koloniler olarak görünür kültürü. Şekil 5 ve 6 gösterildiği tohumlama cihazı, steril koşullar 9 altında tüp iç yüzeyi düzgün kapsama EPC süspansiyon ve sonuçları ile dolu Ti tüpler yavaş dönüşü sağlar . Bizim implantasyon cerrahisinde büyük bir hayvan modelinde tromboz, Ti gibi Biyomalzemelerin eğilimi, test etmek için izin verir. Biz domuz bu yordamı iyi tolere olduğunu ve bu implantasyon sadece az kan kaybı ve EPC katman kesinti olmadan elde edilebilir bulundu. Ayrıca, bizim EPC çizgili tüp inferior vena kava protrombotik düşük kesme ortamda bile patent kalır ise çıplak bir Ti tüp tamamen tıkar ki t &quot;&gt; Şekil 7 göstermektedir. floresan etiketli konfluent tabakası hücrelerinin varlığını teyit Bu yöntemin başarı olarak Şekil 8&#39;de gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3197/3197fig1.jpg" /> Şekil 1 otolog endotelyal progenitör hücre (EPC) tohumlama deneyi şematik. İlk olarak, periferik kan domuz çizilir. Sonra, EPC kandan izole ve kültür genişledi. EPC sonra cerrahi hücreler izole edildiği aynı domuz inferior vena kava içine implante bir titanyum (Ti) tüp cihaz, sonra satır için kullanılır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3197/3197fig2.jpg" /> Şekil 2 kültür EPC, izolasyon prosedürü izleyerek yaklaşık 7 gün (Görüntüleme kamera ve QCapture yazılım ters bir Leica DMIL mikroskobu ile görüntülenmiş) Temsilcisi koloni. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3197/3197fig3.jpg" /> Montajdan önce Şekil 3 Ti tüp bölümlerini. Ti boru boyuna 3 eşit bölüme kesme ve daha sonra 4,5 cm uzunlukta kesilir. Ti bölümlerde iç yüzeyleri görünür çukurları kaldırmak için bir tezgah taşlama ve zımpara bezi kullanarak parlatılır. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3197/3197fig4.jpg" /> Şekil 4 PVC ısıyla daralan boru (mavi) ve ısı tabancası ile Ti tüp bölümlerini Meclisi. Ti bölümleri, Ti bölümleri uzanır ve Ti tüp iç çapı boyutları ile eşleşen bir işlenmiş alüminyum mandrel desteklenmektedir. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3197/3197fig5.jpg" /> Şekil 5, tüm bileşenleri gösteren Titanyum tüp tertibatı, döner kapağı, şırınga &#39;başlık&#39; silikon tüp, ve Ti borusu, PVC wrap (mavi ). Meclis cerrahi kullanım için sterilizasyon için önce birlikte alınır. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3197/3197fig6.jpg" /> Şekil 6, motor, platformu gösteren kuvöz içinde Ti tüp tohumlama kurulum, işlenmiş alüminyum şırınga tutucu, Ti boru montaj ve 5 cc şırınga . Not: Montaj görselleştirme amaçlı steril koruyucu kılıf olarak gösterilir. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/3197/3197fig7.jpg" /> Şekil 7 implantasyon cerrahisi Temsilcisi brüt domuz inferior vena kava (IVC) implantasyon sonrası (A) kontrolü çıplak metal Ti tüp End görünümü. Tüp lümen sağlam bir pıhtı ile tamamen tıkalı (B) EPC numaralı seribaşı Ti tüp sonu görünümü, implantasyon sonrası . Tüp lümen tamamen patent ve net. Kontrolü (C) Dissected görünümü (çıplak) Ti tüp, 3 gün implantasyon sonra, tromboz ölçüde (deneyler aynı sonuçları ile süresi 3 hafta kadar yapılmıştır) . <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/3197/3197fig8.jpg" /> 3 gün implantasyon sonrası Ti tüp yüzey Şekil 8 EPC (QImaging QICAM dik bir Leica DMRB mikroskobu ile görüntülenmiş, dijital kamera ve Image Pro Plus yazılımı tek renkli) . (A) yüzeye Konfluent hücrelerin PKH26 ameliyat öncesi etiketleme gösteriyor. (B) EPC konfluent katmanı. Kırmızı: PKH26 ameliyat öncesi etiketleme. Yeşil: EPC PECAM-leke.

<ol>
	<li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+bleeding+and+clotting+in+the+cardiac+surgery+patient:+from+vascular+endothelium+to+circulatory+assist+device+surface.">Pathophysiology of bleeding and clotting in the cardiac surgery patient: from vascular endothelium to circulatory assist device surface.</a> Circulation. 122, 2068-2077 (2010).</li><li>Achneck, H. E., Sileshi, B., Lawson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+biology+of+bleeding+and+clotting+in+the+surgical+patient.">Review of the biology of bleeding and clotting in the surgical patient.</a> Vascular. 16, 6-13 (2008).</li><li>Arvidsson, S., Askendal, A., Tengvall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+plasma+contact+activation+on+silicon,+titanium+and+aluminium.">Blood plasma contact activation on silicon, titanium and aluminium.</a> Biomaterials. 28, 1346-1354 (2007).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biocompatibility+of+titanium+cardiovascular+devices+seeded+with+autologous+blood-derived+endothelial+progenitor+cells:+EPC-seeded+antithrombotic+Ti+Implants.">The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants.</a> Biomaterials. 32, 10-18 (2011).</li><li>Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+pig+models+of+venous+thrombosis+mimicking+human+disease.">In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease.</a> Thromb Haemost. 89, 256-263 (2003).</li><li>Ueberrueck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+ovine+and+porcine+animal+models+for+biocompatibility+testing+of+vascular+prostheses.">Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses.</a> J Surg Res. 124, 305-311 (2005).</li><li>Velik-Salchner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+values+for+thrombelastography+(ROTEM)+and+selected+coagulation+parameters+in+porcine+blood.">Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood.</a> Thromb Res. 117, 597-602 (2006).</li><li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem/progenitor+cell+principals.">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. , (2010).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+titanium+ventricular+assist+device+surfaces+after+gold/palladium+coating+for+scanning+electron+microscopy.">Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy.</a> Microsc Res Tech. 73, 71-76 (2010).</li><li>Ford, J. W., Welling, T. H., Stanley, J. C., Messina, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKH26+and+125I-PKH95:+characterization+and+efficacy+as+labels+for+in+vitro+and+in+vivo+endothelial+cell+localization+and+tracking.">PKH26 and 125I-PKH95: characterization and efficacy as labels for in vitro and in vivo endothelial cell localization and tracking.</a> J Surg Res. 62, 23-28 (1996).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan hücre-ekim Ti tüpler yöntem hızlı ve düzgün endothelialize doktorlar ve bilim adamları kan ile temas eden yüzeyleri implante edilebilir cihazlar. Izole etmek ve periferik kan örnekleri EPC genişletmek yılından bu yana, önemli bir invaziv prosedür bu hücrelerin hasat için gereklidir. Ayrıca, EPC otolog, bu nedenle hücre numaralı seribaşı implant için herhangi bir immün reaksiyon riskini ortadan kaldırır. Onun protokolde gösterilen ilkeler Ti tüpler için değil sadece, ama birçok diğer biyomateryaller, kardiyovasküler tıp alanında kullanılmaktadır kullanılabilir. Bu protokol Kritik adımlar bulduğumuz gibi, Ti tüpler titiz bir temizlik olduğunu kirletici tavizler hücre bağlılığın herhangi bir yandaşı bir film. Ayrıca, yavaş bir dönüş hızı (boru çapı ile ters orantılıdır) tohumlama işlemi sırasında önemlidir, öyle ki EPC, yavaş yavaş yerleşmeye ve Ti borusu hareket olarak yüzeye yapışır. Implantasyon öncesi hemen ekim yöntemi pratik ex vivo kültür kez önler, hücreleri tek tek yapışır ve daha sonra, hemen akışının yeniden kurulması ardından bir yaprak gibi embolizasyon imkanı kaçınarak, in vivo olarak konfluent sayfalık formu. Bizim önceki çalışmalar, EPC konfluent bir katmana büyüdü sonra, ek olarak endotel bir levha olası dökülmesi en aza indirmek, onlar sıkıca yapışır ekstra bir matriks yaptığınız göstermektedir. Embolik dekolmanı olasılığı tamamen göz ardı rağmen, tüm aygıt yüzeyinin trombozu daha multifold düşük risk, bu tedavinin önlemek için tasarlanmış olduğunu sorun gibi görünüyor. Düşük kesme içine implantasyonu Bizim yaklaşımımız, inferior vena kava protrombotik ortam kan uyumluluk ve cihazlar 5,6 trombozu araştırmak için en güvenilir büyük hayvan modellerinde kullanmaktadır. Tüm hayvan bakımı ve deney Ulusal Enstitüsü Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Kuralları ve sadece Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayından sonra uygun yapılmıştır unutmayın. Biyomalzemeler ve cihazları test etmek için bu implantasyonu yöntemi başarıyla yararlanmak için, sabırla IVC segmentinde iskeletini, cihazın etrafında kanama bir &#39;yalancı lümenin&#39; çıktığını cihazın yerleştirilmesi için hazırlık tüm venöz şube gemileri, Arter önemlidir. Diğer önemli adım, iç tüp yüzey hücreleri veinotomy kapatılması sırasında nemli kalır ve reperfüzyon başlamadan önce olduğu gibi cihaz lümenine ek DPBS. Cihaz implante yerini tespit edilemezse, IVC &#39;upstream&#39; göç etmiş olabilir. - Bu 3 mm PVC boru bölümünde tüp bugünkü konumu iyice demirlemiş böylece damar duvarının üzerinden 2 ile dikiş (4-O Prolen) koyarak engelledi olabilir. Araştırmacı, bir başka patent tüp eksplantasyonu sonra Şekil 8&#39;de gösterilen floresan önceden etiketli hücreleri bulmakta zorluk olması halinde, bu hücrelerin tutarlı bir sayfa olarak soyulmuş olması muhtemeldir . Bu tüp ile birlikte ven sabitleme sonra, 3 Ti tüp bölümlerini çevreleyen damar ve dis-montaj çok nazik diseksiyon ile önlenebilir. Teknolojimiz, EPC-tohumlama yoluyla kardiyovasküler cihaz trombozu önlemek için proof-of-concept sağlar. Bu teknoloji, hastanın kendi endotel progenitör hücreleri ile kaplı &#39;biyojenik&#39; implantların geliştirilmesinde kullanılıyor olabilir. Bizim domuz hayvan modelinde klinik pratikte bu &#39;kişiye özel tıp&#39; Çeviri doğru ilk adımları için fizibilite çalışması sağlar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Firma Adı </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Boehringer-Ingelheim </td><td> BIC670025 </td><td> NAC # 10280002 </td></tr><tr><td> Alconox Powered Hassas Temizleyici </td><td> Alconox </td><td> 1104 </td><td></td></tr><tr><td> Balfour Cerrahi Retraktör </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Baytril </td><td> Bayer </td><td> APVMA 46028/0705 </td><td></td></tr><tr><td> Kelebek İğne (19G) </td><td> Terumo </td><td> SV19CLK </td><td></td></tr><tr><td> Klorheksidin </td><td> 3M </td><td> 9200 </td><td></td></tr><tr><td> Kelepçeleri (45 derece) </td><td> Aesculap </td><td> FC339T </td><td></td></tr><tr><td> DPBS (-/-) </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS (+/+) </td><td> Gibco </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> DuraPrep </td><td> 3M </td><td> 8635 </td><td></td></tr><tr><td> EBM-2 Orta </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td><td> Hem serum serbest ve tam büyüme orta taban </td></tr><tr><td> EGM-2 SingleQuots </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td><td> EBM-2 ile hem de serum serbest ve tam büyüme orta kullanılır </td></tr><tr><td> Elektrokoter Aracı </td><td> Valleylab </td><td> SurgII-20 </td><td></td></tr><tr><td> Zımpara bezi </td><td> 3M </td><td> 60-0700-0425-8 </td><td> 240 grit </td></tr><tr><td> Euthasol Ötenazi Çözümü </td><td> Virback Hayvan Sağlık </td><td></td><td> ANADA #: 200-071 </td></tr><tr><td> Fentanil Patch </td><td> Actavis </td><td></td><td> NDC # 67767-120-18 </td></tr><tr><td> Flunixin </td><td> Schering-Plough </td><td></td><td> NAC #: 10470183 </td></tr><tr><td> Foley Kateter (16F) </td><td> Ozan </td><td> 730116 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Isı tabancası </td><td> Milwaukee </td><td> 8988-20 </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td><td></td><td></td><td> NDC #: 25021 </td></tr><tr><td> Histopaque-1077 </td><td> Sigma </td><td> H8889-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Entübasyon Tüpü </td><td> Mallinckrodt </td><td> 86113 </td><td></td></tr><tr><td> İsofluranın </td><td> MWI, Meridian </td><td></td><td> NDC # 13985-030 </td></tr><tr><td> IV Kateter (18G) </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 381547 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Fort Dodge </td><td></td><td> NDC # 0856-2013 </td></tr><tr><td> Seviye </td><td> Swanson </td><td> LLA001 </td><td></td></tr><tr><td> Luer-Lock ucu kapağı </td><td> KML Kaynağı </td><td> 909-001 </td><td></td></tr><tr><td> Marcaine </td><td> Hospira </td><td></td><td> NDC #: 0409-1560-10 </td></tr><tr><td> Metzenbaum Makas </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Micro-introducer (5F) </td><td> Galt </td><td> KIT 002-01 </td><td></td></tr><tr><td> Sivrisinek Forseps </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Motor </td><td> Herbach ve Rademan </td><td> H1-08 </td><td></td></tr><tr><td> Oxymorphone </td><td> Endo Labs </td><td></td><td> NDC: 63481-624-10 </td></tr><tr><td> PKH26 Boya Seti </td><td> Sigma </td><td> PKH26GL-1KT </td><td></td></tr><tr><td> Domuz Serum </td><td> İkizler Bio-Ürünler </td><td> 100-115 </td><td> % 2 konsantrasyonu tam besi </td></tr><tr><td> Potts Makas </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Hassas Vista Cilt Zımba </td><td> 3M </td><td> 3998 </td><td></td></tr><tr><td> PVC Boru </td><td> McMaster-Carr/Insultab </td><td> 7132K117 </td><td> ID 15,88 mm genişletilmiş ID 7.95 mm kurtarıldı </td></tr><tr><td> Sağ Açı Orta Ölçekli </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Neşter Blade (# 10-15) </td><td> Ozan </td><td> 373910 </td><td></td></tr><tr><td> Silikon Boru </td><td> McMaster-Carr </td><td> 51735K26 </td><td> OD 16,64 mm, 9,52 mm ID </td></tr><tr><td> Şırınga (5 cc) </td><td> Becton-Dickinson (BD) </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td> Tegaderm </td><td> 3M </td><td> 90001 </td><td></td></tr><tr><td> Üç şekilde Musluk </td><td> Kendall </td><td> 170060 </td><td></td></tr><tr><td> Ti Tube </td><td> Tico Titanyum </td><td> N / A </td><td> Olarak ½ &quot;OD, 0,065&quot; duvar, 0,370 &quot;Kimlik, .1737 lbs / ft belirtilir </td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin Nötralleştirme Çözüm (TNS) </td><td> Lonza </td><td> CC-5002 </td><td> % 0.03 </td></tr><tr><td> Vetropolycin </td><td> Pharmaderm Hayvan Sağlık </td><td></td><td> NAC #: 12920110 </td></tr><tr><td> Vicryl Dikiş (3-0) </td><td> Ethicon </td><td> J808T </td><td></td></tr><tr><td> Su Banyo sonikatör </td><td> Branson </td><td> B200 </td><td></td></tr></tbody></table>

autologous endothelial progenitor cell-seeding technology and biocompatibility testing for cardiovascular devices in large animal model

Vücuda Yerleştirilebilir tromboemboli oluşumu 1,2,3 risk teşkil yapay malzeme (örneğin titanyum (Ti), genişletilmiş politetrafloroetilen), kardiyovasküler cihazlar üretilmektedir. Biz otolog kan kaynaklı insan veya domuz endotel progenitör hücrelerin (EPC) 4 Ti tüplerin iç yüzeyi hattı için bir yöntem geliştirdiler. Ti tüpler implante domuzların inferior vena kava (IVC), domuz EPC konfluent katmanı içeren, büyük bir hayvan modeli protrombotik ortamda hücre numaralı seribaşı yüzeyi gelişmiş biyouyumluluk test edilmiş ve değiştirilmemiş çıplak metal yüzeyleri karşılaştırdık 5,6,7 (Şekil 1). Bu yöntem, implantasyon dakika içinde cihazların endothelialize ve in vivo olarak antitrombotik fonksiyon testi için kullanılabilir . Periferik kan, 50 kg Yorkshire domuz ve EPC 4,8 izole etmek için kültürü mononükleer hücre fraksiyonu elde edildi . Ti tüpleri (9.4 mm ID), üç 4.5 cm boykesit içine önceden kesilmiş ve ısıyla daralan boru ile yeniden birleştirilen. Ti tüpler yavaş dönüş için olanak sağlayan bir tohumlama cihazının inşa edildi. Biz domuz bir laparotomi ve bağırsak ve mesane dışsallaştırdığı. Keskin ve künt diseksiyon proksimal sağ renal arter distalinde, çatallanma IVC iskeletini kullanılmıştır. Ti tüpler sonra, tek tip hücre kaplama 9 elde etmek için 10 RPH x 30 dakika EPC süspansiyon ve yatık otolog floresan etiketli doluydu . 100 USP / kg heparin uygulamasından sonra, IVC ve lumbar ven her iki ucunda klempe edildi. A 4 cm veinotomy ve cihaz yerleştirilir ve fosfat tamponlu tuzlu su ile doluydu. Veinotomy 4-0 Prolen çalışan sütür ile kapatıldı, bir kelepçe de hava IVC kaldırıldı. Prosedürün sonunda, fasya 0-PDS (polidioksanon dikiş) ile yaklaşık 2-0 vicryl, subkutan alan kapalı ve cilt kapalı zımbalanmış. Sonra 3 - 21 gün, domuz ötenazi, en-blok eksplante ve sabit cihaz. Ti tüpler demonte ve iç yüzeyleri bir floresan mikroskobu ile görüntülenmiş. Biz EPC numaralı seribaşı tüpleri patent kaldı ise çıplak metal Ti tüpler tam tıkalı bulundu. Ayrıca, kan ile temas eden iç yüzeyi EPC bir konfluent katmanı göstermek mümkün. Sonuç olarak, bizim teknoloji cihaz trombozu önlemek için otolog EPC implantasyon dakika içinde Ti tüpler endothelialize kullanılabilir. Cerrahi yöntem, az kan kaybı ve EPC numaralı seribaşı yüzey bozulması ile bu değiştirilmiş cihazların gelişmiş biyouyumluluk test etmek için izin verir.

Watch this Scientific Journal Video about Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model at JoVE.com

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Kan ile temas eden otolog hücre ve test biyouyumluluk biyomalzemeler tohumlama titanyum için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, cerrahi implantasyon dakika içinde domuz venae kava numaralı seribaşı endotel progenitör hücrelerin ve titanyum tüpler, kullanır. Bu teknik, diğer birçok implante biyomedikal cihazlar için uyarlanabilir.

Otolog Endotelyal progenitör Hücre-Yayımlama Teknoloji ve Büyük Hayvan Modeli Kardiyovasküler Cihazlar için Biyouyumluluk Testleri

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

autologous-endothelial-progenitor-cell-seeding-technology

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.3K Görüntüleme.  Duke University. Kan ile temas eden otolog hücre ve test biyouyumluluk biyomalzemeler tohumlama titanyum için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, cerrahi implantasyon dakika içinde domuz venae kava numaralı seribaşı endotel progenitör hücrelerin ve titanyum tüpler, kullanır. Bu teknik, diğer birçok implante biyomedikal cihazlar için uyarlanabilir.

Video: Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

Elektrik Hücre-substrat Empedans endotel Yayılmasının, Bariyer Fonksiyonu Nicelik için Algılama ve Motilite

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Biyomühendislik

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Microtissue Sabitleme için mikroakışkan Cihazlar Katman-katman Kolajen Biriktirme

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. The feasibility of using magnetic forces to capture and retain endothelial outgrowth cells (EOC) labeled with super paramagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) has been shown previously. But this technique requires the development of a mechanically functional stent from a magnetic and biocompatible material followed by in-vitro and in-vivo testing to prove rapid endothelialization. We developed a weakly ferromagnetic stent from 2205 duplex stainless steel using computer aided design (CAD) and its design was further refined using finite element analysis (FEA). The final design of the stent exhibited a principal strain below the fracture limit of the material during mechanical crimping and expansion. One hundred stents were manufactured and a subset of them was used for mechanical testing, retained magnetic field measurements, in-vitro cell capture studies, and in-vivo implantation studies. Ten stents were tested for deployment to verify if they sustained crimping and expansion cycle without failure. Another 10 stents were magnetized using a strong neodymium magnet and their retained magnetic field was measured. The stents showed that the retained magnetism was sufficient to capture SPION-labeled EOC in our in-vitro studies. SPION-labeled EOC capture and retention was verified in large animal models by implanting 1 magnetized stent and 1 non-magnetized control stent in each of 4 pigs. The stented arteries were explanted after 7 days and analyzed histologically. The weakly magnetic stents developed in this study were capable of attracting and retaining SPION-labeled endothelial cells which can promote rapid healing.

Our goals were to design, manufacture and test ferromagnetic stents for endothelial cell capture. Ten stents were tested for fracture and 10 more stents were tested for retained magnetism. Finally, 10 stents were tested in-vitro and 8 more stents were implanted in 4 pigs to show cell capture and retention.

Endotel Hücre yakalama ve Saklanmasına İlişkin ferromanyetik Bare Metal Stent

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

Hücre tohum için özel özel Wells ve kendinden montajlı 3D baskı kalıpları kullanarak doku yüzük imalatı

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Biyolojik Dokuların Uyarılması için Elektrikli ve Manyetik Alan Cihazları

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

A Large Animal Model for Pulmonary Hypertension and Right Ventricular Failure: Left Pulmonary Artery Ligation and Progressive Main Pulmonary Artery Banding in Sheep

Decompensated right ventricular failure (RVF) in pulmonary hypertension (PH) is fatal, with limited medical treatment options. Developing and testing novel therapeutics for PH requires a clinically relevant large animal model of increased pulmonary vascular resistance and RVF. This manuscript discusses the latest development of the previously published ovine PH-RVF model that utilizes left pulmonary artery (PA) ligation and main PA occlusion. This model of PH-RVF is a versatile platform to control not only the disease severity but also the RV&#39;s phenotypic response.
Adult sheep (60-80 kg) underwent left PA (LPA) ligation, placement of main PA cuff, and insertion of RV pressure monitor. PA cuff and RV pressure monitor were connected to subcutaneous ports. Subjects underwent progressive PA banding twice per week for 9 weeks with sequential measures of RV pressure, PA cuff pressures, and mixed venous blood gas (SvO2). At the initiation and endpoint of this model, ventricular function and dimensions were assessed using echocardiography. In a representative group of 12 animal subjects, RV mean and systolic pressure increased from 28 &#177; 5 and 57 &#177; 7 mmHg at week 1, respectively, to 44 &#177; 7 and 93 &#177; 18 mmHg (mean &#177; standard deviation) by week 9. Echocardiography demonstrated characteristic findings of PH-RVF, notably RV dilation, increased wall thickness, and septal bowing. The longitudinal trend of SvO2 and PA cuff pressure demonstrates that the rate of PA banding can be titrated to elicit varying RV phenotypes. A faster PA banding strategy led to a precipitous decline in SvO2 &#60; 65%, indicating RV decompensation, whereas a slower, more paced strategy led to the maintenance of physiologic SvO2 at 70%-80%. One animal that experienced the accelerated strategy developed several liters of pleural effusion and ascites by week 9. This chronic PH-RVF model provides a valuable tool for studying molecular mechanisms, developing diagnostic biomarkers, and enabling therapeutic innovation to manage RV adaptation and maladaptation from PH.

This manuscript describes the surgical technique and experimental approach to develop severe right ventricular pressure overload to model their adaptive and maladaptive phenotypes.

Pulmoner Hipertansiyon ve Sağ Ventrikül Yetmezliği için Büyük Bir Hayvan Modeli: Koyunlarda Sol Pulmoner Arter Ligasyonu ve Progresif Ana Pulmoner Arter Bantlama

Decompensated right ventricular failure (RVF) in pulmonary hypertension (PH) is fatal, with limited medical treatment options. Developing and testing ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

3D Biyobaskı için Adipoz Türevi Kök Hücre Sferoidlerinin Büyük Ölçekli, Otomatik Üretimi

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

In Silico Clinical Trials for Cardiovascular Disease

The SILICOFCM project mainly aims to develop a computational platform for in silico clinical trials of familial cardiomyopathies (FCMs). The unique characteristic of the platform is the integration of patient-specific biological, genetic, and clinical imaging data. The platform allows the testing and optimization of medical treatment to maximize positive therapeutic outcomes. Thus, adverse effects and drug interactions can be avoided, sudden cardiac death can be prevented, and the time between the commencement of drug treatment and the desired result can be shortened. This article presents a parametric model of the left ventricle automatically generated from patient-specific ultrasound images by applying an electromechanical model of the heart. Drug effects were prescribed through specific boundary conditions for inlet and outlet flow, ECG measurements, and calcium function for heart muscle properties. Genetic data from patients were incorporated through the material property of the ventricle wall. Apical view analysis involves segmenting the left ventricle using a previously trained U-net framework and calculating the bordering rectangle based on the length of the left ventricle in the diastolic and systolic cycle. M-mode view analysis includes bordering of the characteristic areas of the left ventricle in the M-mode view. After extracting the dimensions of the left ventricle, a finite elements mesh was generated based on mesh options, and a finite element analysis simulation was run with user-provided inlet and outlet velocities. Users can directly visualize on the platform various simulation results such as pressure-volume, pressure-strain, and myocardial work-time diagrams, as well as animations of different fields such as displacements, pressures, velocity, and shear stresses.

In Silico Clinical Trials for Cardiovascular Disease

This protocol demonstrates the workflow of the SILICOFCM platform for automatically generating a parametric model of the left ventricle from patient-specific ultrasound images by applying a multi-scale electromechanical model of the heart. This platform enables in silico clinical trials intended to reduce real clinical trials and maximize positive therapeutic outcomes.

Burada: Silico Kardiyovasküler Hastalıklar için Klinik Çalışmalar

The SILICOFCM project mainly aims to develop a computational platform for in silico clinical trials of familial cardiomyopathies (FCMs). The unique ...

Monte Edilmiş Domuz Aort Kapaklarında Hidrodinamik Özelliklerin Değerlendirilmesi

An Ex Vivo Porcine Model for Hydrodynamic Testing of Experimental Aortic Valve Procedures and Novel Medical Devices

The options for testing new cardiac procedures and investigative medical devices prior to use in an animal model are limited. In this study, we present a method for mounting a porcine aortic valve in a pulse duplicator to evaluate its hydrodynamic properties. These properties can then be evaluated before and after the procedure under investigation is performed and/or the investigative medical device is applied. Securing the inflow segment presents some difficulty owing to the lack of circumferential myocardium in the left ventricular outflow tract. This method addresses that issue by securing the inflow segment using the anterior leaflet of the mitral valve and then suturing the left ventricular free wall around the inflow fixture. The outflow segment is secured simply by inserting the fixture into an incision in the superior aspect of the aortic arch. We found that specimens had significantly different hydrodynamic properties before and after tissue fixation. This finding induced us to use fresh specimens in our testing and should be considered when using this method. In our work, we used this method to test novel intracardiac patch materials for use in the valvular position by performing an aortic valve neocuspidization procedure (Ozaki procedure) on the mounted porcine aortic valves. These valves were tested before and after the procedure to assess the change in hydrodynamic properties in comparison to the native valve. Herein, we report a platform for hydrodynamic testing of experimental aortic valve procedures that enables comparison with the native valve and between different devices and techniques used for the procedure under investigation.

Yazar Spot Işığı: Büyük Hayvan Çalışmalarına Başlamadan Önce Kardiyak Prosedür Testini İlerletmek 

We present a method for mounting a porcine aortic valve on a pulse duplicator to test its hydrodynamic properties. This method can be used to determine the change in hydrodynamics after the application of an experimental procedure or novel medical device prior to use in a large animal model.

Deneysel Aort Kapak Prosedürlerinin ve Yeni Tıbbi Cihazların Hidrodinamik Testi için Ex Vivo Domuz Modeli

The options for testing new cardiac procedures and investigative medical devices prior to use in an animal model are limited. In this study, we present a ...