Electron trabalho de microscopia de Cheng laboratório é parcialmente apoio por concessões do NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 e P50GM082250 (para A. Frankel)), e uma bolsa da UCSF Programa de Pesquisa Biomédica Breakthrough, Award e Prêmio Oportunidade Novas Tecnologias.

1. Preparação de EM grades para revestimento de carbono <ol><li> Encha um copo de vidro grande com água destilada. </li><li> Use uma pipeta de vidro para deixar cair uma única gota de colódio (~ 20μl, 2% em acetato de amila, Ciências Microscopia Eletrônica, PA, EUA) na superfície da água. Colódio vai se espalhar para formar uma camada de plástico fino para a água da superfície / ar; Nota: A primeira gota de colódio pode ser usado para limpar a superfície da água a partir de qualquer partículas de poeira. Após a remoção do filme da primeira queda, a superfície da água está livre de poeira. </li><li> Coloque EM grades, 400 ou 200 mesh grades Gilder Cu comprado de Ted Pella Inc. (EUA), um por um para a camada de plástico flutuando na superfície da água; Nós colocamos geralmente 50 ~ 100 grids em um padrão próximo de embalagem, com a brilhante lado da grade voltada para baixo na camada de plástico (Fig. 1A). Nota: 400 redes mesh são bons para a rotina negativa grades mancha EM, e que 200 redes mesh são bons para a recolha de imagens par de inclinação. </li><li> Cortar uma tortace de papel com dimensões ligeiramente maiores do que a área onde as redes são colocadas sobre a camada de plástico. Coloque o papel com cuidado por cima da grade (Figura 1B), e esperar até o papel ficar completamente molhada (Fig. 1C). Nota: Diferentes tipos de papel têm diferentes taxas de absorção de água. É importante que o papel não absorve água muito rápido. Por exemplo, papel de filtro regular não é boa para este fim, pois absorve água muito rápido e faz um monte de rugas. O filme de carbono feitas de papel amassado não é plana, e, portanto, não é bom para a recolha de imagens par inclinação para a reconstrução 3D cônica inclinação aleatória. Um deles tem para testar papéis diferentes para encontrar um adequado. Em nosso laboratório, temos vindo a utilizar papéis de blocos comprados a partir da mercearia local. Às vezes o papel de jornal também foi considerada adequada. Outra opção é usar o papel de arroz em relação espesso usado para caligrafia chinesa / japonesa. </li><li> Rapidamente fazer incisões no filme plástico em volta e perto deo papel encharcado. Logo em seguida, use uma pinça para pegar o papel com as grades imprensado entre o filme plástico e papel. Coloque o papel numa placa de Petri com as grades para cima para a secagem do ar (Figura 1D); Nota: É importante deixar o papel secar ao ar. Secagem muito rápido gera muitas rugas no papel. </li></ol> 2. Revestimento de grades de carbono <ol><li> A máquina de revestimento de carbono-usado em nosso laboratório é um Cressington 208C Alto Vácuo Turbo Carbono Coater (Ted Pella). Nosso sistema é equipado com um monitor de espessura do filme Cressington, que mede a espessura da película de carbono revestido com base no princípio de que a freqüência de oscilação de um cristal de quartzo é alterada pela massa de um filme depositado em sua superfície. No entanto, o protocolo descrito aqui não requer um monitor de espessura, uma vez que muitas vezes não é disponível em cada laboratório. </li><li> Afiar uma vara de carbono usando um apontador (Ted Pella) e varas de carbono de carga em carbono revestimento machine (Fig. 2A). Dois bastões, um deles com uma ponta afiada ea outra com uma extremidade plana são colocados uns contra os outros. </li><li> Aplicação de graxa para vácuo em metade da área fosco de uma lâmina de vidro e coloque-o ao lado das grades (Fig. 2B). Apenas metade da área fosco da lâmina de vidro deve ser coberta com graxa de vácuo. Nota: A área com graxa de vácuo não vai mudar de cor após o revestimento de carbono. O contraste entre as áreas adjacentes, com e sem graxa de vácuo fornece uma estimativa da espessura de carbono revestido. </li><li> Coloque o papel com grids no palco da máquina de revestimento de carbono. Coloque a lâmina de vidro ao lado das grades (Fig. 2C). Nota: Pode-se também grades primeira transferência revestido com o filme plástico para uma lâmina de vidro antes do revestimento, no caso de muitas grades cair do papel. </li><li> Bomba na câmara de vácuo, e espere até que o vácuo atinge um nível de 10 Torr -5. Nota: revestimento com menor vácuo muitas vezes gera muitas faíscas, resultando em muitas partículas de carbono em grandeda grade. </li><li> Aumentar a corrente de forma muito lenta. A ponta afiada da vara de carbono irá tornar-se primeiro vermelha e branca, em seguida, com o aumento da corrente. Não vê a ponta de alto brilho diretamente com o olho nu. Parar o aumento da corrente quando o revestimento é iniciado. A lâmina de vidro muda de cor do branco ao cinza claro e cinza escuro, em seguida. A escuridão da slides correlaciona a espessura do filme de carbono sendo revestido. Desligue o atual para parar de revestimento quando a espessura desejada foi alcançada (Fig. 2D). Nota: 1) Depois de repetidos processos de carbono, revestimento de carbono revestido de dentro da redoma de vidro pode escurecer a sua cor. Isso torna o filme de carbono revestido aparecem mais grossos do que realmente é. 2) Uma haste de carbono afiada pode ser usado para o revestimento de várias. A nitidez da ponta é gradualmente reduzida após cada revestimento. A corrente máxima é influenciada pela nitidez da vara de carbono. A vara recém-afiada com diâmetro menor requer um parente menoratual para evaporar carbono. Mais tarde revestimento pode exigir um pouco maior corrente. </li><li> Ventilação da câmara de vácuo e remover grades revestido para uso posterior. Nota 1. O método mais preciso de controlar a espessura de carbono é usando um monitor de espessura do filme. Ou pode-se qualitativamente calibrar cor contra a espessura exacta medida pelo monitor. A espessura de carbono útil para esta técnica é entre 3 e 7 nm. </li></ol> Este é um método simples e fácil de preparar uma grande quantidade de grades de carbono revestidos, geralmente ~ 100 grades por preparação. As grades contém uma camada de plástico fino, o que geralmente não afeta a qualidade da imagem negativa manchado. No entanto, as redes preparadas neste método não são adequados para cryoEM. Esta camada de plástico pode ser removida por imersão as grades em clorofórmio por várias horas. 3. Preparação de solução de formiato de uranila (0,75%) para o negativo mancha EM. O protocolo detalhado foidescrito anteriormente 5 <ol><li> Pesar 37,5 mg de formato de uranila em um copo pequeno; </li><li> Adicionar 5 ml de água fervente e mexa por 5 minutos no escuro; </li><li> Adicionar 10μl NaOH 5M, continue mexendo por 5 minutos; </li><li> Filtrar a solução usando uma seringa filtro (Fisherbrand, 13 milímetros filtro de seringa, 0,2 Hm, Nylon não-estéril número de catálogo, 09-720-5), e armazenar a solução filtrada em um tubo Falcon 8ml coberto com papel alumínio; Nota pó Formate. Uranilo pode ser comprado de Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA), número de catálogo 22451. Solução de formiato de uranilo é sensível à luz e deve ser mantido longe da luz direta, por exemplo, que cobre o tubo de Falcon com papel alumínio. A solução recentemente preparada tem uma cor amarelo claro (Fig. 3A). Solução mancha pode ser mantido no banco de uma a duas semanas antes de começar a precipitar. Formiato de uranilo é ácida com um pH ~ 4. Adição de NaOH aumenta o pH, mas adicioná-lo muito rapidamenteou em excesso pode causar a mancha de precipitado. Além de gerar contraste, formate uranilo também corrige a amostra de proteína. Porque a taxa de fixação é tão rápido, o pH baixo geralmente não afeta as conformações da proteína total ou formação de complexos de proteínas 7. </li></ol> 4. Protocolo para a elaboração da grade negativa EM mancha. Este protocolo foi descrita em detalhes anteriormente 5 <ol><li> De descarga luminescente grade de carbono revestido, utilizando PELCO GlowDischarge easiGlow sistema (Ted Pella Inc., EUA). A corrente utilizada é de 15 mA e grades são brilho descarregada por 30 sec Nota.. Glow-descarregada grades deve ser usado logo após o fulgor de descarga. Muitas vezes usamos as grades em menos de duas horas após a descarga luminescente. </li><li> Coloque duas gotas 20μl de água destilada e duas gotas de solução de formiato 25μl de uranilo em um pedaço de parafilme (Fig. 3B). </li><li> Segure um brilho totalmente descarregada grade usando reverse força anti-capilar fórceps com o carrobon revestido virado para cima. Nota: É necessário o uso de anti-capilar fórceps. Caso contrário, amostra de líquido será bombeado para fora de grades pela força capilar entre a fórceps. </li><li> Aplicar amostra de proteína 2μl ao brilho descarregada grid, e aguarde 30 segundos. Nota: O tempo de espera eo tempo de descarga luminescente influência da concentração de proteínas adsorvidas na grade. Amostras muito diluídas requer maior tempo de adsorção. No entanto, adsorção prolongada pode alterar a concentração do tampão desde vapores de água. Para conseguir uma distribuição adequada de partículas em grade requer um pouco de tentativa e erro abordagem. </li><li> Blot fora da amostra, utilizando papel de filtro. </li><li> Toque na superfície da grade para uma gota de água e depois blot fora da água com papel de filtro. Repita com a queda de 2 de água. </li><li> Toque a superfície da grelha para a primeira gota de uma breve mancha. Blot off a solução mancha com papel de filtro. </li><li> Toque a superfície da grelha para a segunda gota de corante durante 20 segundos. Blot off solução mancha com papel de filtro. </li><li> Secar a grade usando vácuo. Nota: também se pode deixar as redes no banco ou em um capuz químico secar ao ar. O benefício de vácuo seco é que pode-se observar as grades na EM imediatamente. O artefato possíveis gerados por secagem rápida é desigual mancha. </li></ol> 5. Microscopia eletrônica de transmissão <ol><li> O microscópio utilizado nesta demonstração é um T12 Tecnai (FEI Company) equipado com um x 4K 4K Gatan câmera CCD. </li><li> Brevemente verificar o alinhamento do microscópio antes de inserir amostra; Nota: Isto só é necessário uma vez por EM sessão. Em um microscópio modelo, perto de um perfeito alinhamento pode ser salvo anteriormente. Carregando um arquivo-alinhamento deve restaurar o alinhamento microscópio para uma condição quase perfeita. </li><li> Carregar a grade de EM em porta espécime único de inclinação padrão. </li><li> Inserir titular em CompuStage do T12. Aguarde até que o ciclo de bombeamento para ser concluído. </li><li> Insira o suporte na coluna. &lt;/ Li&gt; <li> Foco amostra e definir um defocus desejado, geralmente, 1.5um. Nota: A focalização pode ser conseguida por manualmente foco usando o método de contraste mínima ou usando câmera CCD para capturar imagens ao vivo e computar espectro de potência ao vivo Fourier. </li><li> Gravar uma imagem utilizando CCD da câmera; </li><li> Em imagens de forma negativa amostras coradas proteínas, as proteínas são muitas vezes vistos com contraste branco, ou seja, densidade branco contra um fundo mais escuro. Observe que, enquanto as concentrações de proteínas em diferentes áreas da mesma grade são geralmente bastante semelhantes, se faz observar diferentes níveis de mancha em diferentes áreas da grade mesmo. Às vezes, as áreas podem ter coloração irregular ou mesmo coloração positiva (proteína aparece escura sobre um fundo claro), enquanto que outras áreas têm perfeita mancha. Muitas vezes, é necessário procurar a grade para localizar uma área boa para a imagem latente. </li></ol> 6. Resultados representante Exemplos típicos de boas imagens de forma negativa staamostras INED, cavalo baço ferritina (Figura 4A), Fab (Fig. 4B), 20S archaeal proteassoma (Fig. 4C) e nucleossomos (Fig. 4D), são mostrados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig1.jpg" /> Figura 1. Elaboração de grelhas de carbono revestido para negativa mancha EM. A) Colocar EM grades um por um em um padrão de embalagem fechada na superfície do filme colódio. B) Colocar um pedaço de papel um pouco maior do que a área das grades. C) Esperar até que o papel fica completamente molhado. D) Pegue o papel em conjunto com as grades para secagem ao ar. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig2.jpg" /> Figura 2. . Grades revestimento de carbono com EM A) Instalação do evaporador de carbono: coloque as duas varas de carbono no aparelho de revestimento, com uma haste (à esquerda) com uma ponta afiada ponto. A haste de outros (à direita) tem uma superfície plana e entrar em contato com a ponta do ponto um no s opostoide. B) Coloque uma pequena quantidade de graxa de vácuo em um lado de uma lâmina de vidro promovida. A área dentro do quadro negro tem graxa de vácuo. C) Setup as grades para revestimento. As lâminas de vidro são usados ​​para segurar o papel na posição. A seta aponta a área com graxa de vácuo. D) Após o revestimento, a cor do slide com graxa de vácuo cobertos não muda a cor. O contraste indica a espessura de carbono revestido. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig3.jpg" /> Figura 3. Ilustrando o procedimento de coloração negativa. A) recentemente preparada (à esquerda) solução de formiato de uranilo é transparente sem sinal de precipitados. Depois de 1 ~ 2 semanas, precipita começar a acumular no fundo no fundo do tubo. B) Coloque duas gotas (~ 25μl) de água destilada e duas gotas de solução de uranilo formate em um pedaço de parafilme. Use um par de anti-capilar pinça para segurar um brilho descarregada carbono revestido com grade EM lado de carbonopara cima. Uma gota de amostra (~ 2μl) é colocado no grid. C) Após uma espera de 30 segundos, blot a solução com um filtro de papel. D) Virar a grade para tocar o lado amostra da grade com a primeira gota de água. Repita o passo C e D para completar o processo de coloração. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig4.jpg" /> Figura 4. Exemplos de imagens de amostras EM proteínas negativamente manchado. A) ferritina baço cavalo, B) fragmento de ligação do antígeno (Fab), C) 20S archaeal proteassoma e D) nucleossomo. Todas as imagens foram gravadas com a mesma ampliação. A barra de escala é de 20nm.

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	<li>Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advent+of+near-atomic+resolution+in+single-particle+electron+microscopy.">The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 723-742 (2009).</li><li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy.">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (2), 265-273 (2011).</li><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+cryo+electron+microscopy+of+macromolecular+complexes.">Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes.</a> Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 82, 1-35 (2011).</li><li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+viruses.">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Rabl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+gate+opening+in+the+20S+proteasome+by+the+proteasomal+ATPases.">Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases.</a> Mol. Cell. 30 (3), 360-368 (2008).</li><li>Zhao, F. Q., Craig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+time-resolved+changes+in+molecular+structure+by+negative+staining.">Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining.</a> J. Struct. Biol. 141 (1), 43-52 (2003).</li><li>Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+from+a+single-exposure,+random+conical+tilt+series+applied+to+the+50S+ribosomal+subunit+of+Escherichia+coli.">Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli.</a> J. Microsc. 146 (Pt. 2), 113-136 (1987).</li><li>Zhao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+adjustment+of+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring adjustment of a particularly large combination of specific parameters.</a> J. Struct. Biol. 169 (3), 450-454 (2010).</li><li>Nishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+leukocyte+beta2+integrins+by+conversion+from+bent+to+extended+conformations.">Activation of leukocyte beta2 integrins by conversion from bent to extended conformations.</a> Immunity. 25 (4), 583-594 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Negativa mancha EM é uma ferramenta poderosa que pode ser usado para estudar estruturas 3D de amostras de proteínas purificadas, como o uso de inclinação cônica aleatória 8 método, que requer a coleta de um par de imagens com uma de uma amostra inclinado a 60 ° e um da mesma área mas untilted, para calcular reconstruções 3D dos complexos macromoleculares. Além disso, coloração negativa EM pode ter muitas outras aplicações, como rastreamento de duas dimensões (2D) de cristais de proteínas da membrana 9, visualizando complexos de proteína em conformações diferentes 10, ou simplesmente para a visualização de homogeneidade e / ou heterogeneidade de proteínas purificadas amostra assim fornecendo feedbacks para melhorar os procedimentos de purificação de proteínas, etc Pode ser um ensaio poderoso para bioquímicos. Neste artigo, apresentamos os protocolos que vão desde preparar as grades de carbono revestidos para recolher imagens de amostras de proteínas negativamente coradas em um microscópio eletrônico. Como ilustrado aqui,o procedimento é bastante simples e fáceis de seguir. Se a tentativa de calcular as reconstruções 3D da amostra que está sendo observado pelo método aleatório inclinação cônica, é necessário adquirir imagens par de inclinação. No entanto, se a realização de análises única partícula é o propósito, várias imagens untilted será suficiente. Em ambos os casos, processamento de imagem adicional é necessária e isso está além do escopo deste artigo vídeo. Como acontece com qualquer método, existem variações para os protocolos. Formate uranila funciona muito bem como um reagente negativo mancha na maioria dos casos. Acetato de uranila é outro comumente usado reagente negativo mancha. Ele funciona muito semelhante ao formato de uranila, mas com um tamanho maior de grãos e, em muitos casos, menor contraste do que formate uranila. A vantagem de usar acetato de uranila é que a solução dura mais de formiato de uranila. Não é preciso para preparar uma nova solução a cada uma ou duas semanas. Ambos formiato e acetato de uranila são ácidas. Uma preocupação óbvia é que opH baixo pode induzir alterações na amostra de proteína em estudo. Ambas as soluções mancha também funcionam como fixadores de proteínas. Um estudo anterior mostrou que ambas as amostras de proteínas corrigir rapidamente 7. Essa fixação rápida faz com que o pH baixo menos importante. Durante o processo de coloração, uma amostra de proteína torna-se fixado antes do pH baixo pode induzir qualquer alteração. No entanto, outras negativas reagentes mancha, como molibdato de amônio e ácido fosfotúngstico, pode produzir melhores resultados para a coloração de amostras quando o pH baixo é uma preocupação 7. Ambos molibdato de amônio e ácido fosfotúngstico têm um pH praticamente neutro, mas o contraste das amostras de proteína gerada por essas manchas é geralmente inferior a formiato de uranila.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Colódio </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências, PA, EUA </td><td> 12620-30 </td><td> 30ml, 2% em acetato de amila </td></tr><tr><td> Gilder Cu grades </td><td> Ted Pella Inc., EUA </td><td> G400/G200 </td><td> 400/200 mesh </td></tr><tr><td> Cressington 208C Alto Vácuo Coater Carbono Turbo </td><td> Ted Pella Inc., EUA </td><td> 9260 </td><td></td></tr><tr><td> Pontas duplas carbono vara </td><td> Ted Pella Inc., EUA </td><td> 58 </td><td></td></tr><tr><td> Formate uranila </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências, PA, EUA </td><td> 16984-59-1 </td><td> 99,9% de pureza </td></tr><tr><td> PELCO sistema GlowDischarge easiGlow </td><td> Ted Pella Inc., EUA </td><td> 91000 </td><td> Compra na farmácia local </td></tr><tr><td> Whatman # 1 Filtro de papel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-805E </td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain em: from grid preparation to image acquisition

Microscopia eletrônica única partícula (EM), de ambos os manchado negativo ou congelados hidratado amostras biológicas, tornou-se uma ferramenta versátil em biologia estrutural 1. Nos últimos anos, este método tem alcançado grande sucesso no estudo de estruturas de proteínas e complexos macromoleculares 2, 3. Em comparação com elétrons criomicroscopia (cryoEM), no qual amostras de proteínas congeladas hidratadas são incorporados em uma fina camada de gelo vítreo 4, coloração negativa é um método mais simples de preparação da amostra em que as amostras de proteínas são incorporados em uma fina camada de sal de metal pesado para aumentar secas contraste da amostra em 5. O contraste aprimorado de mancha negativa EM permite o exame de relativamente pequeno de amostras biológicas. Além de determinar a estrutura tridimensional (3D) de proteínas purificadas ou complexos de proteínas 6, este método pode ser usado para fins muito mais amplo. Por exemplo, a mancha negativa EM pode ser facilmente usado para visualizar purificadaamostras de proteínas, a obtenção de informações, tais como homogeneidade / heterogeneidade da amostra, a formação de complexos de proteínas ou grandes montagens, ou simplesmente para avaliar a qualidade de uma preparação de proteína. Neste artigo de vídeo, apresentamos um protocolo completo para a utilização de uma amostra de EM para observar proteínas negativamente coradas, desde a preparação grades de carbono revestido para negativa mancha EM para aquisição de imagens de amostra negativamente coradas em um microscópio eletrônico operado a tensão de aceleração 120kV. Estes protocolos têm sido utilizados rotineiramente em nosso laboratório e pode ser facilmente seguido por usuários novatos.

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Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Amostras de proteínas visualização por microscopia eletrônica negativa mancha (EM) tornou-se um método de análise estrutural populares. É útil para a análise estrutural quantitativa, como cálculo de uma reconstrução 3D das moléculas em estudo, e também para a análise qualitativa da qualidade de preparações de proteína. Neste artigo apresentamos protocolos detalhados para preparar as grades EM, a coloração da amostra e visualizar a amostra em um microscópio eletrônico. Usuários novatos podem seguir estes protocolos facilmente e utilizar negativa mancha EM como um ensaio de rotina, além de outros ensaios bioquímicos, para avaliar as suas amostras de proteína.

Visualizando Proteínas e Complexos Macromoleculares por Negative EM Stain: Preparação de Grid para Aquisição de Imagem

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

visualizing-proteins-macromolecular-complexes-negative-stain-em-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

58.3K visualizações.  University of California San Francisco. Amostras de proteínas visualização por microscopia eletrônica negativa mancha (EM) tornou-se um método de análise estrutural populares. É útil para a análise estrutural quantitativa, como cálculo de uma reconstrução 3D das moléculas em estudo, e também para a análise qualitativa da qualidade de preparações de proteína. Neste artigo apresentamos protocolos detalhados para preparar as grades EM, a coloração da amostra e visualizar a amostra em um microsc...

Vídeo: Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Padronização de células co-cultura Usando duas fases aquosas Sistemas

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Bioengenharia

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

Preparação de Hidroxi-PAAm hidrogéis para dissociar os efeitos de Mecanotransdução Sugestões

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Melhorar 2D e 3D Pele<em&gt; In Vitro</em&gt; Models Usando Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their biocompatibility, biodegradability, non-immunogenicity, non-toxicity, and ability to entrap both hydrophilic and hydrophobic compounds. The classical hydration of thin lipid films in an organic solvent is applied herein as a technique to encapsulate tarin, a plant lectin, in nanoliposomes. Nanoliposome size, stability, entrapment efficiency, and morphological characterization are described in detail. The nanoliposomes are prepared using 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt; DSPE-MPEG 2000), and cholesterylhemisuccinate (CHEMS) as the main constituents. Lipids are first dissolved in chloroform to obtain a thin lipid film that is subsequently rehydrated in ammonium sulfate solution containing the protein to be entrapped and incubated overnight. Then, sonication and extrusion techniques are applied to generate nanosized unilamellar vesicles. The size and polydispersity index of the nanovesicles are determined by dynamic light scattering, while nanovesicle morphology is assessed by scanning electron microscopy. Entrapment efficiency is determined by the ratio of the amount of unencapsulated protein to original amount of initially loaded protein. Homogeneous liposomes are obtained with an average size of 155 nm and polydispersity index value of 0.168. A high entrapment efficiency of 83% is achieved.

This study describes classical hydration using the thin lipid film method for nanoliposome preparation followed by nanoparticle characterization. A 47 kDa-hydrophilic and globular protein, tarin, is successfully encapsulated as a strategy to improve stability, avoid fast clearance, and promote controlled release. The method can be adapted to hydrophobic molecules encapsulation.

Preparação e caracterização de Nanolipossomas para a aprisionamento de proteínas globulares hidrofílicas bioativas

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

Modelo in vitro de cicatrizes hipertróficas cutâneas humanas usando aglomeração macromolecular

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized in cells and then left within. One challenge is to assess their fate in the intracellular environment with reliable and precise methodologies. Herein, we introduce the use of the vibrating sample magnetometer (VSM) to precisely quantify the integrity of magnetic nanoparticles within cells by measuring their magnetic moment. Stem cells are first labeled with two types of magnetic nanoparticles; the nanoparticles have the same core produced via a fast and efficient microwave-based nonaqueous sol gel synthesis and differ in their coating: the commonly used citric acid molecule is compared to polyacrylic acid. The formation of 3D cell-spheroids is then achieved via centrifugation and the magnetic moment of these spheroids is measured at different times with the VSM. The obtained moment is a direct fingerprint of the nanoparticles&#8217; integrity, with decreasing values indicative of a nanoparticle degradation. For both nanoparticles, the magnetic moment decreases over culture time revealing their biodegradation. A protective effect of the polyacrylic acid coating is also shown, when compared to citric acid.

Iron oxide nanoparticles are synthesized via a nonaqueous sol gel procedure and coated with anionic short molecules or polymer. The use of magnetometry for monitoring the incorporation and biotransformations of magnetic nanoparticles inside human stem cells is demonstrated using a vibrating sample magnetometer (VSM).

Usando magnetometria para monitorar a incorporação celular e a biodegradação subsequente de nanopartículas de óxido de ferro quimicamente sintetizadas

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...