Esta pesquisa foi suportada pelos NIH bolsas (PN2EY016525 e P41GM103832). SHS foi apoiado por uma bolsa do Programa do Centro Keck WM Interdisciplinar de Biociências de Formação da Costa do Golfo Consórcios (NIH Grant No. T32EB009379) Formação de Pós-Graduação Interdisciplinar Nanobiologia. SHS dissecado, cresceu e vitrificados DRG e células do hipocampo; coletadas crio-EM e dados crio-ET de DRG e axônios do hipocampo; reconstruído e cor-anotada a série de inclinação. MRG dissecado e desde as células do hipocampo no laboratório do MNR. SC assistida em anotação série de inclinação. SHS foi treinado por CW sobre como dissecar e crescer neurônios. SHS, WCM e WC concebeu os experimentos. SHS preparou o manuscrito com a entrada de outros autores. Este vídeo foi filmado no Centro de Imaging and Cellular NanoAnalytics (C-CINA) do Biozentrum de tele Universidade de Basel. C-CINA está integrada no Departamento de Ciência e Engenharia Biosystems (D-BSSE) da ETH Zürich, localizada em Basileia, Suíça.

1. Preparar pratos com EM Grids para Galvanização primárias Neurônios <ol><li> Examine a integridade do carbono perfurado nas grades EM ouro usando um microscópio de luz com ampliação de pelo menos 25X. Certifique-se que buracos de carbono são&gt; 98% intacto. </li><li> Para chapeamento neurônios primários, use um bico de Bunsen para inflamar-esterilizar as grades EM e ao mesmo tempo torná-los hidrofílico. Use uma pinça para pegar a grade EM pelas bordas, e não a área em grade central. CUIDADO: Nunca deixe um bico de Bunsen aceso autônoma, e não use luvas ou pinças com componentes de plástico durante a execução destes passos: <ol><li> Antes de acender o bico de Bunsen, definir os ajustes de ar e gás para uma posição minimamente aberto. </li><li> Acenda o bico de Bunsen usando uma pederneira atacante ou butano isqueiro. </li><li> Modifique os ajustes de ar e gás para conseguir uma chama interior pequeno, azul dentro de um mais alto, mais leve chama azul / violeta. A ponta da chama interior é a parte mais quente da chama. O botão sobSob o queimador ajusta a quantidade de gás que entra no tubo do queimador, enquanto o tambor do queimador pode ser rodado para ajustar a quantidade de ar que entra no queimador. Virando o horário de ajuste do ar diminui o ar (resultando em uma chama roxa) e anti-horário aumenta o ar (resultando em uma chama amarela). </li><li> Com uma pinça de metal (sem peças de plástico) para manter a grade EM, passá-la rapidamente através da chama duas vezes, voltados para o lado de carbono para cima. O lado de carbono aparece mais mate (menos brilhante) e com mais de uma tonalidade acinzentada que o outro lado. </li><li> Transferir imediatamente a rede (lado do carbono para cima) para o centro do prato de fundo de vidro colocadas dentro de 10 cm do bico de Bunsen. Use uma grade EM por prato (Figura 1). Só use pratos com fundo de vidro que são pré-esterilizado, ou seja, através de irradiação gama. </li></ol></li><li> Use um microscópio de luz para verificar a integridade da rede (buracos de carbono intacta), enquanto ainda mantém a grade EM dentro do-bott vidroprato om (para evitar contaminação). Ao aplicar qualquer substância no grid ou qualquer coisa que vai entrar em contato com os neurônios, utilize procedimento estéril e pontas de pipetas estéreis. </li><li> Num capuz de cultura de tecidos usando o procedimento de estéril, aplicar 250 ul da substância de revestimento apropriado, lentamente e com cuidado para a área central de vidro da placa de Petri. Certifique-se que a substância de revestimento apropriado abrange toda a grade de EM. <ol><li> Para os neurónios do hipocampo, usar poli-L-lisina (PLL, 1 mg / ml) como a substância de revestimento, preparado tal como anteriormente descrito 19. Note-se que são necessários 250 ul por grelha EM, por prato, de modo que a escala em lotes de acordo. Para gânglio da raiz dorsal (DRG) neurônios, use uma mistura gelatinosa de proteína secretada pela Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células de sarcoma de rato (ver Tabela de Materiais e reagentes) como a substância de revestimento, preparar o seguinte. Note-se que são necessários 250 ul por grelha EM, por prato, de modo que a escala em lotes de acordo. <ol><li> Descongelar um frasco de estoqueda mistura de proteínas segregadas por gelatinoso Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), as células de sarcoma de rato durante a noite a 4 ° C. </li><li> Manter frio a mistura gelatinosa proteína secretada por Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células de sarcoma de rato, e todos os componentes utilizados para tornar a solução, isto é, mantendo-as em gelo. </li><li> Enquanto sobre gelo, dilui-se esta mistura de proteína gelatinoso em meio Neurobasal para dar uma diluição de 1:20 (ou seja, diluir 500 uL da mistura de proteína gelatinoso em 10 ml de Neurobasal). </li><li> Divide diluída mistura proteína gelatinoso em aliquotas de 1 mL e imediatamente armazenar quaisquer alíquotas adicionais a -20 ° C. </li><li> Aplicar 250 mL por grade EM, por prato, conforme descrito na Seção 1.4. </li></ol></li></ol></li><li> Cobrir a placa de Petri, com o seu topo e incubar (ou com PLL em amostras de hipocampo, ou com a mistura de proteína gelatinoso para espécimes DRG) durante 1 hora à temperatura ambiente, na capa de cultura de tecido. </li><li> Aspiclassificar todos PLL (para amostras de hipocampo) ou a mistura de proteína gelatinosa (para amostras de DRG) dos pratos. Para fazer isso, use o sistema de vácuo na capa de cultura de tecidos. Utilizar uma ponta de pipeta estéril, ligada ao tubo de vácuo. Evite o contato direto com a grade de EM. </li><li> Usar uma pipeta de deslocamento de ar ajustável para aplicar cuidadosamente 250 ul de PBS estéril (solução salina tamponada com fosfato) para a grelha de EM na área central de vidro de cada caixa de Petri, de tal modo que a grelha de EM é totalmente coberto pela PBS. Em seguida, aspirar o PBS de cada prato. Repita 3x. </li><li> Permitir que os pratos com grelhas EM secar sob o capuz de cultura de tecidos durante 15 min. Certifique-se de que estão completamente secos, marcando sob o microscópio de luz na sala de cultura do tecido. Certifique-se de que não haja bolhas de umidade na grade. Se assim for, cuidadosamente aspirado ao lado da grelha de EM para eliminar esta humidade adicional. A grade revestida deve ser usado imediatamente para chapeamento os neurônios. </li></ol> 2. Preparação e Plating primária Neurônios na EM Grids <ol><li> Para placa neurônios primários, primeiro dissecar, trypsinize (usando 2,5% de tripsina) e triturar dissociar a hipocampo (ou gânglio da raiz dorsal de 18 dias de idade embriões de ratos) em células individuais, como descrito anteriormente 19. <ol><li> Triturar é um termo comum usado por neurobiologists para descrever dissociação aglomerados de células em células individuais, particularmente por utilização de uma pipeta de vidro com uma ponta polida ao fogo. O resultado é conseguido com cuidado e lentamente desenho e liberar as células, para cima e para baixo, várias vezes (~ 30), por meio da pipeta. </li></ol></li><li> Siga os procedimentos como descritos anteriormente para dissecção DRG e isolamento de células 24, tomando nota de utilizar 0,25% de tripsina (em HBSS) para isolar os neurônios DRG de ratos, ao invés de usar as enzimas sugeridas (papaína, a colagenase / Dispase), que são mais adequados para rato neurônios DRG. </li><li> Calcule o número de neurônios isolados (ou seja, utilizando um hemocitômetro)e usar este valor para calcular o volume adequado de células para aplicar a cada prato para obter uma concentração de 50.000 células / ml por placa. O volume máximo a aplicar é de 250 mL. Note que isto só preenche a área de vidro central, e não todo o prato. </li><li> Incubar os pratos durante 30 minutos em uma incubadora de CO 2 a 37 ° C. Permitir células para recuperar e aderir. </li><li> Lentamente, adicionar 1,5 ml de meio aquecido para cada prato, tomando cuidado para não perturbar a grade EM. O tipo de mídia depende do tipo celular (hipocampo ou DRG). <ol><li> Preparar os meios de comunicação apropriada para quer neurónios do hipocampo 19 ou neurónios do gânglio da raiz dorsal 24, que é para ser aquecido num banho de água a 37 ° C antes de usar. Incubar os pratos durante a noite na incubadora de CO 2. </li><li> Para os neurônios do hipocampo, alterar a mídia no dia seguinte. Mude metade dos media a cada dois dias em diante, durante 14 dias. Aqueça a mídia em um 37 ° C banho de água antes do uso. </li&gt; <li> Para os neurónios DRG, o dia seguinte dissecação / chapeamento, preparar um material fresco de meios de comunicação com um agente anti-mitótico (uridina e 5 &#39;-fluoro-2&#39;-desoxiuridina) fazer uma solução estoque de 10 mM de cada um, separadamente, usar um definitivo concentração de 10 uM para cada. Retirar metade dos meios de DRG (875 mL) e adicionar 875 mL de meio fresco com o agente anti-mitótico. <ol><li> Para neurônios DRG, a cada dois dias para a primeira semana, alternativo mudando media entre a mídia anti-mitóticas e mídia DRG padrão. Para a segunda semana, altere mídia DRG padrão a cada dois dias. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Vitrificação Neurônios na EM Grids <ol><li> Preparar o equipamento e todos os materiais para congelar e armazenar as grelhas EM ouro à temperatura criogénica: um dispositivo de vitrificação com uma câmara de humidade 17, uma pinça fina especializados pontos para a máquina de vitrificação, pinças ponto longo plana, Dewar (s) de azoto líquido (LN 2), crecipiente oolant, caixa de armazenamento rede EM, papel de filtro sem cálcio. </li><li> Inicie o dispositivo de vitrificação. Ajuste a umidade para 100% e temperatura de 32 ° C. Na seção &quot;Console&quot;, defina o tempo blot para zero segundos. Isso permite que o manual borrando através da janela lateral de câmara de umidade da máquina de vitrificação. </li><li> Manuseie o papel de filtro sem cálcio com luvas, mergulhá-los de tal forma que três trabalhos são empilhados. Corte a pilha em 0,5 centímetros de largura tiras que são ~ 2 cm de comprimento. Dobrá-los a um ângulo de 90 ° de tal forma que um dos lados do papel tem de 0,5 cm x 0,5 cm da face (Figura 2). Com uma pinça, retire o papel do meio e colocá-lo em outro papel de filtro isento de cálcio até o uso. </li><li> Coloque o botão de armazenamento de rede no porta-botão dentro da câmara de vitrificação. Encher a câmara interior do recipiente do líquido de arrefecimento com azoto líquido e esperar até completa evaporação. Encha a câmara externa do the recipiente de líquido de arrefecimento com azoto líquido até atingir uma temperatura estável para prosseguir para o passo seguinte. Encher a câmara interior com elevado grau de pureza de etano gasoso que irá condensar a um estado líquido no interior da câmara refrigerada. </li><li> Mova o prato (s) da incubadora para um grande prato de 100 mm de poliestireno para o transporte para a sala de vitrificação, se não nas imediações. Use a pinça de vitrificação especializados para escolher com cuidado a grade EM do prato. Observe que lado os neurónios estão crescendo na grelha EM; posição importa para a próxima etapa. Usar o bloqueio de deslizamento preto sobre as pinças para bloquear com segurança as pinça sobre a grelha de EM. </li><li> Inserir a pinça para dentro da máquina de vitrificação de tal modo que o lado da grade de EM em que os neurónios são aderidas caras para a esquerda, para longe do orifício da máquina de vitrificação de abertura lateral. Recolha os pinças especializados na máquina de vitrificação. </li><li> Coloque o recipiente do líquido de arrefecimento no suporte apropriadoda máquina de vitrificação. Deve ser preenchido com LN adequada 2 e etano líquido. Usando o comando de tela apropriada da máquina de vitrificação, levante a câmara de líquido refrigerante para cima até que ele seja liberado com a parte inferior da câmara de umidade. </li><li> Com as pinças ponto plana, agarrar uma extremidade do papel de filtro de tal forma que o lado mais curto (os 0,5 cm x 0,5 centímetros da face) é perpendicular às pinças. Esse cara vai entrar em contacto directo com a grade EM para secar (Figura 2B). Insira cuidadosamente o papel de filtro para o lado buracos de câmara de umidade da máquina de vitrificação (Figura 2A). Estável segurar o papel contra a grade de EM (o lado virado para longe da amostra) por 10 segundos. Descarte o papel depois e imediatamente mergulhe-congelar as amostras no etano líquido usando a automação da máquina de vitrificação. </li><li> Transferir cuidadosamente sua grade EM frozen-hidratado a uma das vagas em uma dasbotões de armazenamento de rede. Repita o processo para as redes EM adicionais nos pratos. Os botões de armazenamento grade EM utilizados nesses experimentos pode armazenar vários grades EM congelados hidratado. </li></ol> 4. Coleção de imagens, Processamento e Anotação <ol><li> Prossiga para coletar 2-D microscopia eletrônica e / ou 3-D inclinação série 5 das neurites, utilizando um microscópio crio-eletrônico de sob uma condição de baixa dose. As imagens de 2-D foi concebido para avaliar a qualidade da rede em termos de espessura do gelo e as áreas possíveis de ser útil para o 3-D série de inclinação. <ol><li> Neste caso, todas as imagens foram coletadas usando uma câmera CCD 4k x 4k acoplada a um microscópio de 200 kV elétron equipado com um único titular tilt nitrogênio líquido transferência crio, a 20k ampliação microscópio em um alvo underfocus de 7 mM e amostragem de 4,4 Å / pixel. </li><li> Para obter uma tomografia 3D da amostra, tirar uma série de imagens de projeção, enquanto progressivamente a inclinação do al amostraong um eixo do microscópio eletrônico de transmissão (TEM). Dados os ângulos de inclinação e outras configurações experimentais, existem vários softwares diferentes disponíveis para coletar automaticamente a série de inclinação 5. A série de inclinação 3-D mostrado aqui foram coletados no mesmo microscópio usando semi-automatizado software aquisição série de inclinação 26 em uma faixa de -60 ° a 60 ° em incrementos de 5 ° com uma dose cumulativa de ~ 60 E / A 2. </li></ol></li><li> Reconstruir a série de inclinação das neurites, utilizando software de processamento de imagem 21, tal como anteriormente descrito para outras amostras de 5,29. </li><li> Cor-anotar as características 3-D de neurites pelo primeiro segmentando o tomograma e criação de um modelo de superfície utilizando um software de processamento de imagem 3-D, conforme descrito anteriormente 5. </li></ol>

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Biol. 20, 95-111 (1964).</li><li>Raza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+elevated+intracellular+calcium+levels+and+altered+calcium+homeostatic+mechanisms+in+hippocampal+neurons.">Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons.</a> Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).</li><li>Scroggs, R. S., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+current+variation+between+acutely+isolated+adult+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+of+different+size.">Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size.</a> J. Physiol. 445, 639-658 (1992).</li><li>Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental neuroscience. , (2003).</li><li>Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+hit+hypotheses+for+dopamine+neuron+loss+in+Parkinson's+disease.">Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+expression+of+glycine+and+GABA(A)+receptors+in+developing+spinal+cord+neurons.+Effects+on+neurite+outgrowth.">Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth.</a> Neuroscience. 108, 493-506 (2001).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós mostramos que ratos neurônios embrionários (gânglio da raiz dorsal e hipocampo) podem ser cultivadas em microscopia eletrônica de ouro (EM) grades e congelado em gelo vítreo fina o suficiente para as suas neurites a ser fotografada usando 2-D crio-EM e 3-D crio- ET. Enquanto neurites hipocampo foram previamente visualizados utilizando crio-ET 8,10,18,23, um protocolo detalhado para a replicação suficiente de sucesso utilizando dispositivos comercialmente disponíveis tem faltado. Além disso, enqu...

Neurónios estabelecer o essencial circuitos complexos para a função dos sistemas nervosos central e periférico, através da elaboração de dendrites e axónios receber informação, muitas vezes muito demorado, para se comunicar com os neurónios a jusante. Crescimento de neurites desempenha um papel fundamental durante o desenvolvimento embrionário e na diferenciação e manutenção de neurites neuronal suporta criticamente a função do sistema nervoso. Processos neuriticos também apresentam criticamente em lesões neuronais e de regeneração, bem como distúrbios do sistema nervoso. O estudo da arquitetura neuronal é crucial para entender tanto o cérebro normal e doente. Felizmente, existem sistemas de cultura de células neuronais fisiologicamente relevantes que podem recapitular estruturas celulares complexos e heterogêneos. Com base na elucidação de plataformas experimentais sólidos, estratégias eficazes de visualização que permitem análises qualitativas e quantitativas da morfologia neuronal são necessários. Especialmente útil seriaser uma metodologia detalhada que fornece uma plataforma consistente para a visualização de neurites, ambos os axônios e dendritos em escala nanométrica. Microscopia tradicional elétron requer o uso de solvente orgânico durante a desidratação e incorporação de resina, o que pode induzir distorções nas amostras de seu verdadeiro estado. Até à data, a maioria das caracterizações estruturais em escala nanométrica são baseados em células ou tecidos maiores, que são submetidos a tais produtos químicos - limitando, assim, a interpretação dos resultados 4,9,25. Além disso, para a penetração do feixe de electrões, de corte é necessária para que os organismos celulares ou saliências que apresentam uma espessura superior a 1 um 12. Finalmente, os resultados de tecido seccionados ou branqueado no conjunto de conjuntos de dados discretos específico slice, tornando complicada a definição da característica alongada de neurites. Mesmo para crio-EM, em que o corte de um espécime congelado hidratado é possível, o método apresenta compressão ArtifAtos 1. Nos últimos anos, os pesquisadores aprenderam a crescer neurônios do hipocampo diretamente em grades e EM-los em etano líquido para visualizar posteriormente neurites usando crio-ET 8,10,18,23 de congelamento flash. No entanto, tais estudos ou usar um dispositivo feito sob medida 10,23, ou detalhes de falta na etapa mata-borrão para a geração de gelo vítreo suficientemente fina para visualização rotina 8,18. Por exemplo, um estudo recomenda o uso de 30-40 segundos para secar a grade EM 10, no entanto, este valor não é otimizado para uso geral, mas é específico para esse dispositivo de congelamento mergulho feito por encomenda. Usando um dispositivo feito sob medida, em vez de um comercialmente disponível um 17 para a manutenção de umidade antes de mergulhar de congelamento da amostra pode representar um obstáculo para a reprodutibilidade generalizada. Embora esses estudos têm sido inovador em visualizar neurites por crio-ET, demos um passo à frente para explorar a applicability de crio-ET para uma variedade de amostras (neuronais do hipocampo e do gânglio da raiz dorsal, neurónios). Além disso, discute-se ambos os resultados ótimos e subótimos, bem como os possíveis artefatos que se pode encontrar usando crio-ET para tais espécimes. Definindo uma técnica detalhada para a preservação e visualizar neurites inteiros em escala nanométrica em um estado quase nativo iria aumentar a capacidade para mais pesquisadores para realizar estudos ultra-estruturais. Para este efeito, descrevem um protocolo eficaz e detalhado usando equipamentos disponíveis comercialmente para preparar a não fixadas, os neurónios não-coradas para visualizar as neurites. Este é um primeiro passo importante para detalhar a ultra-estrutura das neurites saudáveis ​​e estabelecer as bases para a compreensão do que estão presentes em modelos de doenças do sistema nervoso diferenças estruturais. Desde crio-ET pode resolver não corrigidos, características neurite não coradas em 3-D em escala nanométrica, o método, será possível, como nunca serantes de definir a arquitetura neuritic 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="970">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Dumont #7 Tweezers</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:309px;">72803-01</td>
			<td style="width:171px;">For handling EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10C</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electron microscopy grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium-free filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1541-055</td>
			<td>For blotting sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large flat point long tweezers</td>
			<td>Excelta Corporation</td>
			<td>E003-000590, 25-SA</td>
			<td>For blotting sample </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitrification device and tweezers</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>For freezing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini grid storage boxes</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>160-40</td>
			<td>For storing EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo transfer holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Semi-automated tilt series acquisition software</td>
			<td>SerialEM</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>IMOD eTomo</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>For image processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Transmission electron microscope for cryoEM</td>
			<td>JEOL, Tokyo</td>
			<td>200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4k x 4k CCD camera</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-D annotation software</td>
			<td>Visage Imaging GmbH</td>
			<td>Amira/Avizo</td>
			<td>For processing 3-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software for digitally stitching 2-D images</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>For processing 2-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-0252</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant rat b-NGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>556-NG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#39;-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography

Neuritos, ambos os dendritos e axônios, são processos celulares neuronais que permitem a condução de impulsos elétricos entre os neurônios. Definir a estrutura de neurites é fundamental para a compreensão de como esses processos mover materiais e sinais que suportem comunicação sináptica. A microscopia eletrônica (EM) tem sido tradicionalmente usada para avaliar as características ultra-estruturais dentro de neurites, no entanto, a exposição a solventes orgânicos durante a desidratação e resina incorporação podem alterar as estruturas. Um objetivo importante não atendida é a formulação de procedimentos que permitam avaliações estruturais não impactadas por tais artefatos. Aqui, nós estabelecemos um protocolo detalhado e reprodutível para o cultivo e de congelamento de flash neurites inteiros de diferentes neurônios primários em grades de microscopia eletrônica, seguido por seu exame com tomografia crio-elétron (crio-ET). Esta técnica permite a visualização 3-D de congelados, neurites hidratados com resolução nanométrica, facilitando assessment de suas diferenças morfológicas. Nosso protocolo produz uma visão sem precedentes da raiz dorsal (DRG) gânglio neurites, e uma visualização de neurites hipocampo em seu estado quase original. Como tal, estes métodos de criar uma base para futuros estudos sobre neurites de ambos os neurônios normais e aqueles afetados por distúrbios neurológicos.

Antes de congelamento e de imagens via crio-ET, devem ser tomadas da rede de EM em que os neurônios estão crescendo imagens de microscópio de luz. Neuritos deve ser claramente visível, sem sobreposição significativa com o outro. Uma caixa colorida na Figura 3A representa uma área que é ampliada em mostrar um maior ampliação na Figura 3B, em que as neurites se estendem através da treliça da grade. Cada grade quadrados é composto por uma película de carbono perfurado que sup...

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Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Para preservar processos neuronais para análise ultra-estrutural, nós descrevemos um protocolo para revestimento dos neurônios primários em grades de microscopia eletrônica seguido de congelamento flash, rendendo amostras suspensas em uma camada de gelo vítreo. Essas amostras podem ser examinadas com um microscópio crio-eletrônico para visualizar estruturas em escala nanométrica.

Preparação de primário neurônios para visualizar Neuritos num Estado Frozen-hidratado Usando Cryo-Electron Tomografia

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

preparation-primary-neurons-for-visualizing-neurites-frozen-hydrated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

79.0K visualizações.  Baylor College of Medicine.  Para preservar processos neuronais para análise ultra-estrutural, nós descrevemos um protocolo para revestimento dos neurônios primários em grades de microscopia eletrônica seguido de congelamento flash, rendendo amostras suspensas em uma camada de gelo vítreo. Essas amostras podem ser examinadas com um microscópio crio-eletrônico para visualizar estruturas em escala nanométrica. 

Vídeo: Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Neurociência

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience research. Ion channels are the basis of all behavior since they mediate neuronal excitability. The first voltage gated ion channel cloned was the Drosophila voltage gated potassium channel Shaker1,2. Toward understanding the role of ion channels and membrane excitability for nervous system function it is useful to combine powerful genetic tools available in Drosophila with in situ patch clamp recordings. For many years such recordings have been hampered by the small size of the Drosophila CNS. Furthermore, a robust sheath made of glia and collagen constituted obstacles for patch pipette access to central neurons. Removal of this sheath is a necessary precondition for patch clamp recordings from any neuron in the adult Drosophila CNS. In recent years scientists have been able to conduct in situ patch clamp recordings from neurons in the adult brain3,4 and ventral nerve cord of embryonic5,6, larval7,8,9,10, and adult Drosophila11,12,13,14. A stable giga-seal is the main precondition for a good patch and depends on clean contact of the patch pipette with the cell membrane to avoid leak currents. Therefore, for whole cell in situ patch clamp recordings from adult Drosophila neurons must be cleaned thoroughly. In the first step, the ganglionic sheath has to be treated enzymatically and mechanically removed to make the target cells accessible. In the second step, the cell membrane has to be polished so that no layer of glia, collagen or other material may disturb giga-seal formation. This article describes how to prepare an identified central neuron in the Drosophila ventral nerve cord, the flight motoneuron 5 (MN515), for somatic whole cell patch clamp recordings. Identification and visibility of the neuron is achieved by targeted expression of GFP in MN5. We do not aim to explain the patch clamp technique itself.

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

In situ patch clamp recordings are used for electrophysiological characterization of neurons in intact circuitry. In the Drosophila genetic model patch clamping is difficult because the CNS is small and surrounded by a robust sheath. This article describes the procedure to remove the sheath and clean neurons for subsequent patch clamp recordings.

Preparação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Os neurônios centrais para<em&gt; In situ</em&gt; Patch aperto

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imagiologia espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo de rato primária usando Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modelagem de morte Neuronal e a degeneração no Mouse grânulo cerebelar primária de neurônios

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

Imagens ao vivo da proteína GLUT4 tráfico de Mouse de neurônios hipotálamo primário usando microscopia de deconvolução

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a commercially available pre-assembled plastic chip for compartmentalizing cultured primary rat hippocampal neurons. These plastic chips, contained within the footprint of a standard microscope slide, are compatible with high-resolution, live, and fluorescence imaging. This protocol demonstrates how to retrograde label neurons via isolated axons using a modified rabies virus encoding a fluorescent protein, create isolated microenvironments within one compartment, and perform axotomy and immunocytochemistry on-chip. Neurons are cultured for &gt;3 weeks within the plastic chips, illustrating the compatibility of these chips for long-term neuronal cultures.

This protocol describes the use of plastic chips to culture and compartmentalize primary murine neurons. These chips are preassembled, user-friendly, and compatible with high-resolution, live, and fluorescence imaging. This protocol describes how to plate rat hippocampal neurons within these chips and perform fluidic isolation, axotomy and immunostaining.

Uso de Chips microfluídicos plástico pré-montados para compartimentar os neurônios primários de murino

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Rotulagem Balística de Neurônios Piramidais em Fatias Cerebrais e na Cultura Celular Primária

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx due to the abnormal activation of glutamate receptors results in DA excitotoxicity and has been identified as an important mechanism for DA neuron loss. In this study, we isolate, dissociate, and culture midbrain neurons from the mouse ventral mesencephalon (VM) of ED14 mouse embryos. We then infect the long-term primary mouse midbrain cultures with an adeno-associated virus (AAV) expressing a genetically encoded calcium indicator, GCaMP6f under control of the human neuron-specific synapsin promoter, hSyn. Using live confocal imaging, we show that cultured mouse midbrain neurons display spontaneous Ca2+ fluxes detected by AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath application of glutamate to midbrain cultures causes abnormal elevations in intracellular Ca2+ within neurons and this is accompanied by caspase-3 activation in DA neurons, as demonstrated by immunostaining. The techniques to identify glutamate-mediated apoptosis in primary mouse DA neurons have important applications for the high content screening of drugs that preserve DA neuron health.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Here we present a protocol to measure in vitro Ca2+ fluxes in midbrain neurons and their downstream effects on caspase-3 using primary mouse midbrain cultures. This model can be employed to study pathophysiologic changes related to abnormal Ca2+ activity in midbrain neurons, and to screen novel therapeutics for anti-apoptotic properties.

Quantificando fluxos espontâneos ca2+ e seus efeitos a jusante em neurônios midcérebros do rato primário

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

Imagem ao vivo do Estado De Glutathione Mitocondrial Redox em Neurônios Primários usando um Indicador Ratiométrico

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...